广东水牛乳腺炎牛奶中分离大肠杆菌的抗菌药物敏感性及广谱β-内酰胺酶表征

《Microorganisms》：Antimicrobial Susceptibility and Characterization of Extended-Spectrum β-Lactamases in Escherichia coli Isolated from Buffalo Mastitis Milk in Guangdong Province, China Yunchen Zhou, Rong Xi, Siran Wang, Ban Li, Yue Wu, Chengbo Wen and Dexian Zhang

　　

食源性动物中大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）的抗菌药物耐药性（Antimicrobial Resistance, AMR）构成了重大的公共卫生关切。本研究表征了从患亚临床乳腺炎的水牛中分离的E. coli菌株的耐药谱、系统发育多样性、毒力基因分布及质粒介导的广谱β-内酰胺酶（Extended-Spectrum β-Lactamases, ESBL）决定簇。在54株产ESBL E. coli分离株中，所有菌株均对氨苄西林和头孢噻肟耐药。对头孢唑林（75.9%）、复方新诺明（74.0%）、头孢噻呋（70.4%）、氟苯尼考（68.5%）和头孢唑啉（63.0%）也观察到高耐药率。对硫酸粘菌素（40.7%）、恩诺沙星（33.3%）和庆大霉素（25.9%）的耐药率较低。产ESBL菌株的系统发育分析显示，B1群占主导地位（42.6%），其次是A群（29.6%）和D群（25.9%）。多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing, MLST）显示ST50（20.4%）是最常见的序列型，且O150血清群占主导（70.4%）。毒力基因如iss（81.5%）、astA（59.3%）和espP（38.9%）在产ESBL分离株中频繁检出。ESBL基因主要为blaCTX-M-1（27.8%），同时也普遍共检出窄谱β-内酰胺酶基因blaTEM-1（55.6%）和blaOXA-10（14.8%）。生物信息学分析预测所有ESBL基因均与质粒来源的重叠群相关，预测质粒大小约为32至187 kb，属于IncFIB、IncFIA、IncI1、IncFIA + I1和IncFII复制子类型。接合频率范围为4.8 × 10?7至4.1 × 10?2，且预测质粒携带介导氯霉素（floR）、磺胺类（sul1, sul3）、四环素（tet(A)和tet(B)）和甲氧苄啶（dfrA1, dfrA12）耐药的额外耐药基因。ESBL基因与额外抗菌素耐药及毒力决定簇的共同携带表明，水牛可能作为临床相关耐药性状的储存库，这些性状可能通过水平基因转移进行传播。

论文解读：广东水牛乳腺炎牛奶中分离大肠杆菌的抗菌药物敏感性与ESBL表征

研究背景与意义

抗菌药物耐药性（AMR）已构成严重的公共卫生威胁，预计到2050年可能导致每年约1000万人死亡。在畜牧业中，食源性动物被认为是耐药细菌和耐药基因的重要储存库，尤其是产广谱β-内酰胺酶（ESBL）的大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli），其不仅能水解第三代头孢菌素，还常伴随对氟喹诺酮类、氨基糖苷类和磺胺类药物的耐药，给临床治疗带来极大挑战。水牛乳因其品质在东南亚地区备受青睐，而乳腺炎是水牛中最普遍的疾病之一。尽管奶牛源ESBL阳性E. coli已有较多报道，但对于中国广东地区水牛乳腺炎中ESBL阳性E. coli的毒力分布、耐药机制及质粒特征的研究相对匮乏。为此，Yunchen Zhou、Rong Xi等研究人员开展了一项针对水牛乳腺炎牛奶中分离E. coli的系统性研究，旨在揭示该地区水牛源E. coli的耐药现状及分子特征，该研究成果发表在《Microorganisms》期刊。

关键技术方法

研究人员采集了来自水牛亚临床乳腺炎的牛奶样本，依据国家标准委员会协议进行样本收集与预处理，利用California Mastitis Test (CMT)试剂盒进行初筛。细菌分离采用MacConkey琼脂培养基，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行鉴定。ESBL表型确认遵循CLSI指南，采用纸片扩散法和表型确证试验。药敏试验采用肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）。全基因组测序使用Illumina Nextera XT平台进行双端测序，利用SPAdes组装，并通过MLST 2.0、PlasmidFinder 2.0、VirulenceFinder 2.0等在线工具进行多位点序列分型、质粒复制子分型及毒力基因检测。质粒接合转移实验采用滤膜结合法，以钠叠氮化物抗性的E. coli J53为受体菌。

研究结果

1. 抗菌药物耐药性

在276株分离自水牛亚临床乳腺炎的E. coli中，鉴定出54株产ESBL菌株。所有产ESBL菌株均对氨苄西林和头孢噻肟耐药，对头孢唑林（75.9%）、复方新诺明（74.0%）、头孢噻呋（70.4%）、氟苯尼考（68.5%）和头孢唑啉（63.0%）也表现出高耐药率。相比之下，非产ESBL菌株对上述药物的耐药率显著较低。MIC值比较显示，产ESBL菌株对β-内酰胺类药物的MIC₅₀和MIC₉₀值远高于非产ESBL菌株，证实了ESBL酶对药物活性的显著影响。

2. 系统发育群、MLST及血清型

系统发育分析显示，产ESBL E. coli的优势群为B1群（42.6%），其次为A群（29.6%）和D群（25.9%），仅有一株属于B2群。MLST分析表明ST50（20.4%）是最主要的序列型，其次是ST2797（11.1%）。血清型分析显示O150（70.4%）占据绝对优势。

3. 毒力基因分布

在检测的毒力基因中，iss（81.5%）、astA（59.3%）和espP（38.9%）在产ESBL菌株中检出率较高，表明这些菌株可能具有较强的适应性和致病潜力。

4. ESBL基因分布

所有分离株均检测到ESBL编码基因，以bla_CTX-M型和bla_OXA型为主。其中bla_CTX-M-1（27.8%）最为普遍，其次是bla_CTX-M-15（13.0%）。此外，窄谱β-内酰胺酶基因bla_TEM-1（55.6%）和bla_OXA-10（14.8%）也广泛共存。

5. ESBL基因携带质粒的特征

生物信息学分析预测所有ESBL基因均位于质粒来源的DNA片段上，质粒大小介于32至187 kb之间。预测的质粒复制子类型包括IncFIB、IncFIA、IncI1、IncFIA + I1和IncFII。接合实验证实这些质粒具有转移性，接合频率在4.8 × 10^?7到4.1 × 10^?2之间。除ESBL基因外，这些质粒还携带有其他耐药基因，如氯霉素耐药基因floR、磺胺类耐药基因sul1和sul3、四环素耐药基因tet(A)和tet(B)以及甲氧苄啶耐药基因dfrA1和dfrA12。

结论与讨论

本研究首次对中国水牛亚临床乳腺炎源产ESBL E. coli进行了全面表征。研究发现，产ESBL菌株表现出多重耐药性，且耐药基因与毒力基因共存于可转移的质粒上。研究鉴定出以B1系统发育群、ST50序列型和O150血清型为主导的独特分子特征。虽然研究揭示了水牛可能是临床相关耐药菌及其基因的重要储存库，但由于缺乏对牛群水平、农场水平和时间结构的系统捕获，尚不能确定ST50/O150/B1的优势是否代表了更广泛的人群水平信号还是局部克隆富集。尽管如此，该研究强调了水牛养殖系统在耐药基因水平传播中的潜在风险，为制定农场层面的监测计划、开发快速诊断工具以及实施抗菌药物管理策略提供了关键的分子靶点和科学依据。