血浆代谢组学揭示实验性和人类慢性肾脏病存在共同的代谢特征

《Toxins》：Plasma Metabolomics Reveals a Shared Metabolomic Profile in Experimental and Human Chronic Kidney Disease S?ren H. Elsborg, Jasmine C. L. Atay, Johan Palmfeldt, Christian Daugaard Peters, Krista Dybtved Kj?rgaard, Henricus A. M. Mutsaers and Rikke N?rregaard

　　

慢性肾脏病 (CKD) 影响全球近10%的人口，但其诊断和疾病监测仍主要依赖于血浆肌酐。由于肌酐水平受非肾脏因素的强烈影响，如年龄、性别、肌肉质量和饮食，其作为肾功能标志物的准确性有限。为了识别反映肾损伤的血浆生物标志物，研究人员在腺嘌呤诱导的CKD小鼠模型（一种已知的肾小管损伤模型）中应用了非靶向和靶向代谢组学，并在晚期CKD患者和健康对照的血浆中验证了这些发现。研究人员发现了五种代谢物，它们在实验性和人类CKD中的血浆水平均发生改变，其中半乳糖酸 (galactonic acid, Gal)、哌啶酸 (pipecolic acid, Pip) 和N-乙酰神经氨酸 (N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac) 与测量的肾小球滤过率 (glomerular filtration rate, GFR) 显著相关。作为概念验证，研究人员证明，与单独使用肌酐相比，将这些代谢物整合到包含肌酐的生物标志物组合中，可以改善GFR的估算。本研究引入了一个有前景的基于代谢物的生物标志物组合，可能提高肾功能评估的准确性，并有可能支持疾病诊断、风险分层和进展监测；然而，需要在更广泛的CKD队列中进行验证。

研究背景、问题与目的

慢性肾脏病 (CKD) 是全球范围内影响近十分之一人口的重大健康问题，是导致死亡的主要原因之一。在临床实践中，CKD的诊断和监测主要依赖于肾小球滤过率 (GFR)，而GFR通常通过估算获得，其中血浆肌酐是最常用的估算指标。然而，肌酐水平受到年龄、性别、肌肉质量等多种非肾脏因素的影响，且在反映早期肾损伤方面不敏感。此外，目前临床使用的替代标志物（如胱抑素C）主要反映肾小球功能，对评估肾小管间质损伤（这是CKD的关键特征，且是肾功能下降的更强预测因子）的价值有限。因此，迫切需要寻找更准确、能反映肾损伤的生物标志物。近年来，非靶向血浆代谢组学已成为一种强大的工具，能够检测CKD患者血浆中积累的小分子代谢物，为发现新型生物标志物提供了可能。动物模型（特别是能够模拟特定病理变化的模型）在阐明CKD机制和识别潜在生物标志物方面具有重要作用。本研究中，腺嘌呤诱导的CKD模型被用作研究肾小管损伤的工具。本研究旨在利用该模型，通过代谢组学方法寻找与肾损伤相关的血浆生物标志物，并在人类患者中进行验证，以评估其潜在的临床应用价值，从而改善肾功能的评估。

关键技术方法概览

为开展研究，研究人员主要应用了以下关键技术：首先，建立了动物模型，即对雄性C57BL/6NRj小鼠分别喂食含0.2%腺嘌呤的饲料2周或4周，以诱导不同阶段的肾损伤，并设立不含腺嘌呤的对照组。其次，在人类样本验证方面，研究使用了来自SAFIR临床试验队列的晚期CKD患者的血浆样本，并与在当地招募的年龄、性别匹配的健康志愿者样本进行比较。第三，在表型与机制分析中，采用了包括血液尿素氮 (BUN) 和血浆肌酐测定、肾脏组织学与免疫组化/免疫荧光（例如H&E染色、AQP1/KIM1/αSMA/PDGFRβ/OAT1/OCT2染色）、实时定量PCR (qPCR) 以及蛋白质印迹 (Western blotting) 等技术，以全面评估肾功能、肾小管损伤、纤维化、炎症及肾小管转运蛋白的表达变化。第四，在代谢组学分析这一核心环节，研究人员对小鼠和人类血浆样本进行了非靶向代谢组学分析，采用液相色谱-质谱联用 (LC-MS/MS) 平台，并对筛选出的候选代谢物进行了靶向定量验证。最后，在数据整合与统计分析中，运用了主成分分析 (PCA)、聚类分析、线性与逻辑回归模型等生物信息学和统计方法，以识别差异代谢物、评估其与临床参数（如测量GFR, mGFR）的相关性，并构建和比较基于肌酐的GFR预测模型。

研究结果

2.1. 腺嘌呤喂养降低肾功能并诱导肾小管间质损伤

通过喂食0.2%腺嘌呤饲料2周或4周，小鼠成功模拟了CKD表型。与对照组相比，腺嘌呤喂养组小鼠出现显著体重下降，肾脏重量减轻，肾脏纤维化区域增加。血液尿素氮 (BUN) 和血浆肌酐水平升高，表明肾功能受损。肾皮质中，健康近端小管细胞标志物Aqp1的mRNA表达在2周组下调，而损伤标志物Havcr1 (编码KIM1) 的mRNA表达在两个时间点均显著上调，且KIM1阳性小管数量增加。免疫荧光共染色显示AQP1和KIM1呈反向表达模式。此外，肌成纤维细胞活化标志物Acta2 (编码αSMA) 的mRNA和蛋白水平在腺嘌呤喂养组均升高，其与PDGFRβ的共定位在肾小管间质区（尤其是2周组）增加。炎症和纤维化相关基因的表达也上调。这些结果表明，腺嘌呤饮食在2周和4周时均能诱导肾损伤，其特征是肾功能下降、近端小管质量丢失，伴随小管损伤、间质纤维化和炎症增加。

2.2. 非靶向血浆代谢组学揭示腺嘌呤诱导肾病期间血浆代谢组的阶段特异性变化

对小鼠血浆进行非靶向代谢组学分析发现，与对照组相比，2周和4周组中大多数已识别的特征（代谢物）在血浆中富集。主成分分析 (PCA) 显示各组间血浆代谢组谱存在明显差异，其中2周组与对照组分离最明显。对90个差异最显著的特征进行热图分析，发现了三个对应于不同实验组的簇：簇1（对照组）以脂肪酰基类为主；簇2（2周组）以苯系物和有机酸为主；簇3（4周组）以核酸衍生物为主，其次是有机酸。这表明腺嘌呤诱导的CKD导致循环代谢物普遍积累，但不同时间点的代谢物组成不同。

2.3. 近端小管转运蛋白表达在腺嘌呤诱导肾病期间发生改变

为探究代谢谱变化是否与清除能力变化同时发生，研究人员检测了负责有机化合物肾脏排泄的关键基底侧和顶侧近端小管转运蛋白的表达。mRNA分析显示，与对照组相比，2周和4周组中主要基底侧阴离子转运蛋白Slc22a6 (OAT1) 和阳离子转运蛋白Slc22a2 (OCT2) 表达下调。蛋白质印迹证实OAT1蛋白水平在两个时间点均显著降低，而OCT2蛋白水平仅在2周组显著降低。免疫组化也支持了这些发现。其他转运蛋白如Slc22a8 (OAT3)、Slco4c1 (OATP4C1) 的mRNA在2周组下调，而顶侧转运蛋白Slc47a1 (MATE1) 和Abcc4 (MRP4) 的mRNA在2周组上调。此外，研究人员测量了已知的尿毒症毒素 (UTs)，发现犬尿酸、马尿酸等在腺嘌呤喂养组小鼠血浆中水平升高。这些发现表明，腺嘌呤喂养导致近端小管转运蛋白表达谱改变，以及典型尿毒症毒素血浆水平升高。

2.4. 与腺嘌呤诱导肾病相关的候选代谢物的鉴定

通过逐步过滤策略，研究人员从数百个代谢特征中筛选出与肾损伤强烈且一致相关的候选代谢物。首先，将数据集限制在经mzCloud数据库确认的代谢物以提高注释可靠性，然后筛选在2周或4周组中与对照组相比有显著差异的代谢物，最后聚焦于在两个腺嘌呤喂养组中均发生显著变化的代谢物。这一严格筛选最终确定了五个候选代谢物：硫酸吲哚酚 (indoxyl sulfate, IxS)、哌啶酸 (pipecolic acid, Pip)、半乳糖酸 (galactonic acid, Gal)、N-乙酰神经氨酸 (N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac) 和5-磺基水杨酸 (5-sulfosalicylic acid, 5-SSA)。随后的靶向代谢组学分析证实，这五种代谢物在2周和4周组中的血浆水平均显著升高。

2.5. 在男性和女性CKD患者中验证候选代谢物

为了评估发现的转化潜力，研究人员在一个包含晚期CKD患者和年龄、性别匹配的健康对照的队列中进行了血浆代谢组学分析。PCA分析显示，晚期CKD患者与健康对照的血浆代谢组存在明显分离，且性别间无差异。靶向定量分析证实，IxS、Gal和Neu5Ac在男性和女性CKD患者血浆中均显著升高。然而，与小鼠结果相反，Pip在人类CKD患者中显著降低。5-SSA因技术原因未能可靠定量而被排除。此外，在人类CKD患者中也观察到色氨酸水平降低，以及犬尿氨酸、犬尿酸、马尿酸、对甲酚硫酸盐等尿毒症毒素水平升高。这表明，除了Pip的变化方向存在种属差异外，多个候选代谢物在人类CKD中同样发生改变。

2.6. 候选代谢物相关性分析显示与糖尿病关联较弱，与肾脏病关联较强

通过多元回归分析，研究人员探讨了候选代谢物与心血管疾病 (CVD)、糖尿病等合并症的潜在关联。分析发现，Gal的水平与血浆葡萄糖和糖化血红蛋白 (HbA1c) 显著相关，且在调整年龄和体重后，与HbA1c的关联依然显著。高水平Gal的患者患糖尿病的风险显著增加。关于肾脏病相关参数，Gal、Pip和Neu5Ac均与测量GFR (mGFR) 显著相关。此外，Pip和Neu5Ac也与透析前血浆肌酐水平显著相关。在调整年龄和体重后，仅Neu5Ac仍与mGFR和肌酐保持显著关联。IxS则与mGFR或肌酐无显著相关性。这些结果表明，Gal与糖尿病标志物存在新的关联，而Gal、Pip和Neu5Ac均与肾功能显著相关。

2.7. 加入哌啶酸、半乳糖酸和N-乙酰神经氨酸可改善基于肌酐的GFR预测

研究人员评估了将Gal、Pip和Neu5Ac纳入透析前血浆肌酐模型是否能改善晚期CKD患者的GFR估算。训练了两个线性回归模型：一个仅使用肌酐，另一个使用肌酐、Gal、Pip和Neu5Ac的组合。组合模型的表现优于肌酐单独模型，具有更好的模型拟合度（R²更高）和更低的均方根误差 (RMSE)。此外，在利用逻辑回归模型对GFR低于中位数（4.01 mL/min/m²）的患者进行分类时，组合模型的预测准确率（AUC为90.1%）也高于肌酐单独模型（AUC为83.1%）。这证明，采用包含这三种代谢物的多标志物方法，可以显著提高对CKD患者肾功能的估算和分类能力。

讨论与结论总结

在讨论部分，研究人员指出，尽管血浆肌酐是临床肾功能评估的基石，但其受到非肾脏因素的影响，并非理想的独立生物标志物。本研究通过腺嘌呤小鼠模型结合人类验证，表明半乳糖酸 (Gal)、哌啶酸 (Pip) 和N-乙酰神经氨酸 (Neu5Ac) 是有前景的肾损伤候选生物标志物。Gal显示出与糖尿病标志物的新关联，可能对合并糖尿病的CKD患者具有特别意义。Pip在人与小鼠间的变化方向不同，可能反映了种属间赖氨酸代谢的差异。Neu5Ac与肾功能参数关联最强，且既往与心血管疾病相关，提示其可能作为CKD及其心血管并发症的潜在标志物。研究证实腺嘌呤模型适用于转化生物标志物的发现，并观察到了与人类CKD一致的代谢变化（如特定尿毒症毒素积累）和近端小管转运蛋白表达下调。研究优势包括使用动物模型先行筛选以减少混杂因素、采用高分辨质谱平台以及严格的代谢物注释流程。局限性在于人类队列仅包含晚期透析患者且样本量较小，GFR范围有限，未来需要在更广泛的CKD人群和更大队列中进行验证。

本研究发表于《Toxins》。根据论文结论部分，研究人员总结道：总之，研究人员确定了半乳糖酸 (Gal)、哌啶酸 (Pip) 和N-乙酰神经氨酸 (Neu5Ac) 作为有前景的肾损伤候选生物标志物。在本研究中，将这些代谢物与肌酐组合成一个生物标志物组合，相比单独使用肌酐，显著改善了GFR的估算。这个生物标志物组合有可能用于改善肾功能的临床监测。然而，需要在更大的队列中进行验证研究，以及评估CKD患者中Gal、Pip和Neu5Ac水平的纵向变化、透析对其血浆水平的影响，以及这些代谢物是否与临床结局相关的研究。