《Journal of Fungi》：Preliminary Validation of a Colorimetric Loop-Mediated Isothermal Amplification (c-LAMP) Assay for Detection of Pythium insidiosum in Clinical Specimens
Thanawat Sridapan,
Chalisa Jaturapaktrarak,
Thidarat Rujirawat,
Wilasinee Konsue,
Pattarana Sae-Chew,
Chompoonek Yurayart and
Theerapong Krajaejun
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摘要：腐霉病是一种由卵菌纲真菌样生物潜隐疫霉菌（Pythium insidiosum）引起的新发传染病，主要影响亚热带和热带地区的宿主。该病病原体常见于沼泽环境，接触可导致多种临床表现。在人类中，眼部和血管感染为主，而在动物中，皮肤/皮下或胃肠道疾病更为常见。
摘要：腐霉病是一种由卵菌纲真菌样生物潜隐疫霉菌（Pythium insidiosum）引起的新发传染病，主要影响亚热带和热带地区的宿主。该病病原体常见于沼泽环境，接触可导致多种临床表现。在人类中，眼部和血管感染为主，而在动物中，皮肤/皮下或胃肠道疾病更为常见。药物治疗常无效，许多患者需广泛手术切除感染器官，晚期病例可能进展为致命结局。因此，早期准确检测对改善临床管理至关重要。本研究评估了一种比色环介导等温扩增（colorimetric loop-mediated isothermal amplification, c-LAMP）检测方法，并将其与已建立的复合聚合酶链式反应（multiplex PCR, m-PCR）方法进行了比较，用于检测伴有或不伴有腐霉病的动物临床标本中的潜隐疫霉菌。在测试的47份冷冻组织样本中，c-LAMP表现出更优越的诊断性能，其灵敏度（83.9% vs. 41.9%）和准确度（78.7% vs. 61.7%）显著更高，且周转时间更短（65分钟 vs. 180分钟）。然而，c-LAMP产生了5例假阳性结果，可能归因于非特异性扩增或污染。改进的样本处理操作将特异性从68.8%提升至93.8%。相比之下，m-PCR显示出完美的特异性（100.0%），但灵敏度大幅降低，导致较高的假阴性率。总之，这些初步研究结果表明，c-LAMP是一种极具前景的疑似腐霉病快速筛查工具，特别适用于资源有限的环境。尽管如此，对于c-LAMP阳性或模棱两可的结果，仍需进行确证性检测。
研究人员针对潜隐疫霉菌（Pythium insidiosum）感染诊断中存在的挑战，开展了一项关于比色环介导等温扩增（c-LAMP）技术的临床验证研究。该研究旨在解决现有分子检测技术依赖昂贵设备及专业人员，而传统免疫学方法存在交叉反应的问题。通过对47份动物冷冻组织样本的分析，研究人员比较了c-LAMP与实验室常规使用的复合聚合酶链式反应（m-PCR）的诊断效能。结果显示，c-LAMP在灵敏度（83.9%）和检测速度（65分钟）方面显著优于m-PCR（灵敏度41.9%，耗时180分钟），尽管初期存在因污染导致的假阳性问题，但通过优化样本处理可将特异性提升至93.8%。该研究证实了c-LAMP作为一种快速筛查工具在资源有限环境下的应用潜力，相关成果发表于《Journal of Fungi》。
在技术方法层面，研究人员采用了盲法测试设计，样本来源于泰国农业大学兽医学院微生物学与免疫学系保存的47份动物冷冻组织，包括31份确诊腐霉病样本及16份非腐霉病对照样本。核心技术包括：使用基于羟基萘酚蓝（HNB）显色原理的c-LAMP技术进行等温扩增检测，并通过肉眼观察颜色变化判读结果；同时使用已发表的m-PCR方法进行平行比对；最后利用生物信息学工具（如BLAST和BioEdit）对引物结合位点进行序列同源性分析，以探究假阳性成因。
研究结果部分显示：首先，在诊断性能比较中，c-LAMP的灵敏度（83.9%）远高于m-PCR（41.9%），且准确性更高（78.7% vs. 61.7%），但初期特异性较低（68.8%）。其次，关于假阳性与假阴性原因分析，研究发现c-LAMP的5例假阳性主要源于样本处理过程中的交叉污染或其固有的超高灵敏度，而非引物与非目标真菌的序列同源性所致；假阴性则可能由于组织中病原体载量过低或DNA降解。第三，在结果判读干扰因素分析中，研究人员发现高粘度样本可能导致HNB指示剂提前变色，通过10倍稀释可有效解决此类判读偏差。最后，在临床意义探讨中，鉴于c-LAMP存在假阳性风险，建议其定位为快速筛查工具，阳性结果需辅以m-PCR等确证性检测。
讨论与结论部分指出，虽然c-LAMP具有高灵敏度和快速的优势，但初期的高假阳性率限制了其作为独立诊断工具的适用性，因为这可能导致不必要的手术或抗真菌治疗。通过实施严格的预分析控制措施，特异性可提升至93.8%，这表明实验室操作流程对结果可靠性至关重要。因此，c-LAMP最适合作为低患病率环境下腐霉病的初步筛查手段，用于快速排除阴性病例，并将阳性或可疑样本分流至确证试验。最终结论是，c-LAMP在总体诊断性能上优于m-PCR，但需要在更大的临床队列中进一步验证其临床效用。
