4-己基间苯二酚通过调节代谢功能障碍和内质网应激，减轻乙醇引起的肝损伤和胰腺损伤 Hora?iu Rotar, Soon-Young Kang, Hyun-Seung Kim, Seung-Ki Hong, Yoon-Jo Lee, Ji-Hyeon Oh, Suyeon Park, Jongho Choi, Xiangguo Che, Je-Yong Choi + 1位作者

《Biomedicines》：4-Hexylresorcinol Attenuates Ethanol-Induced Hepatic and Pancreatic Injury by Modulating Metabolic Dysfunction and Endoplasmic Reticulum Stress Hora?iu Rotar, Soon-Young Kang, Hyun-Seung Kim, Seung-Ki Hong, Yoon-Jo Lee, Ji-Hyeon Oh, Suyeon Park, Jongho Choi, Xiangguo Che and Je-Yong Choi + 1 author

　　摘要 背景/目的：长期乙醇（EtOH）摄入是导致代谢功能障碍和多器官损伤的主要原因，尤其是在肝脏和胰腺中。由于氧化应激和内质网（ER）应激是这两个器官中的核心机制，本研究评估了4-己基间苯二酚（4HR）对EtOH引起的肝胰腺损伤的保护作用。方法：将6周大的雄性C57BL/6J小鼠分为四组（每组10只）：对照组、EtOH组、EtOH + 4HR（5 mg/kg）组和EtOH + 4HR（10 mg/kg）组。经过1周的适应期后，小鼠被喂食液态EtOH饮食5周。评估了葡萄糖耐受性、空腹血糖、血清胰岛素和胰岛素生成指数。通过组织学、免疫组化、Western blotting、Periodic Acid-Schiff染色、Oil Red O染色和马唐酰二醛测定来分析肝脏和胰腺。结果：长期EtOH暴露损害了葡萄糖稳态，降低了胰岛素生成指数，增加了肝脏炎症和ALT水平，减少了肝脏糖原，并提高了肝脏和胰腺中的脂质过氧化以及GADD153（CHOP）表达。4HR的给予，尤其是在10 mg/kg剂量下，缓解了这些改变中的几种。4HR处理与肝脏炎症减轻和ALT升高相关，降低了胰腺马唐酰二醛水平，并抑制了两个器官中的GADD153表达。尽管4HR处理组中的PAS染色显示出肝脏糖原沉积量有增加的倾向，但定量分析并未表明与EtOH组相比有显著恢复。结论：4HR对长期EtOH引起的肝胰腺损伤的多个方面表现出保护作用，包括肝脏炎症、胰腺脂质过氧化和与ER应激相关的GADD153表达。然而，定量PAS分析未支持4HR显著恢复EtOH引起的肝脏糖原耗竭。这些发现表明，4HR可能作为一种潜在的多器官保护剂，对抗酒精引起的炎症、氧化应激和ER应激相关的损伤，尽管其在当前实验条件下的对肝脏糖原代谢的影响仍然有限。

1. 引言
长期乙醇（EtOH）摄入仍然是全球代谢和器官功能障碍的主要原因。肝脏作为EtOH代谢的主要场所，会因酒精脱氢酶和细胞色素P450 2E1（CYP2E1）介导的氧化作用而遭受显著的氧化应激。这一过程会产生高水平的乙醛和活性氧（ROS）[1,2]。由此产生的氧化负担会引发脂质过氧化，破坏线粒体完整性，并激活肝细胞内的促炎途径[3,4]。这些过程扰乱了正常的肝脏代谢，导致甘油三酯积累、糖原耗竭和肝细胞损伤，可能会发展为脂肪变性和脂肪性肝炎及纤维化[5]。此外，EtOH代谢通过增加NADH/NAD+比值来改变细胞内的氧化还原状态，抑制糖异生并促进从头脂肪生成，从而加剧肝脏的代谢失衡[6]。
EtOH引起的损伤不仅限于肝脏。胰腺也极易受到EtOH介导的毒性影响。长期EtOH暴露会导致胰腺腺泡细胞和内分泌细胞的氧化应激和线粒体功能障碍，从而导致细胞损伤和炎症反应。升高的EtOH代谢物和氧化应激已被证明会损害胰腺β细胞的胰岛素分泌，从而破坏葡萄糖稳态[7,8]。因此，长期饮酒与胰腺炎症、内分泌功能受损及代谢紊乱风险增加有关[9]。这些观察结果表明，EtOH暴露通过涉及氧化应激和生物能量失败的共同机制引起肝脏和胰腺的多器官代谢损伤。由于氧化应激和代谢失调是EtOH引起器官损伤的核心特征，已经研究了各种药理学和营养学方法来减轻这些效应。抗氧化剂，包括N-乙酰半胱氨酸[10]、维生素E[11]和多种多酚[12]，因其能够减少ROS介导的损伤而被探索。其他治疗策略包括改善线粒体功能、调节脂质代谢或增强细胞抗氧化防御的物质[13]。尽管做出了这些努力，但对EtOH引起的肝胰腺损伤的有效药理学干预仍然有限。许多抗氧化剂在实验模型中显示出保护作用，但在临床环境中效果并不一致[14,15]。此外，现有的治疗方法主要侧重于肝脏保护，忽视了胰腺的平行功能障碍。因此，识别和开发能够同时保护肝脏和胰腺组织免受EtOH引起的氧化应激和代谢损伤的双功能化合物是一个关键的未满足的临床需求。

4-己基间苯二酚（4HR）是一种广泛用于食品保存和医疗应用中的抗菌和消毒剂的酚类化合物[16,17]。然而，最新证据表明4HR具有抗氧化和抗炎特性[18]。作为酚类衍生物，4HR可以清除ROS并减轻氧化应激介导的细胞损伤[19]。先前的研究还表明，4HR可以调节细胞应激反应和代谢信号通路，包括与线粒体功能和细胞能量代谢相关的通路[20]。胰腺β细胞特别容易受到氧化应激的影响，因为它们自身的抗氧化酶水平相对较低[21]。在使用链脲佐菌素（STZ）的实验模型中，这种导致胰岛素生成失败的化合物通过产生ROS和DNA烷基化选择性地损害胰腺β细胞，氧化应激会导致明显的胰腺组织损伤和高血糖[22,23,24]。有趣的是，我们最近的研究表明，4HR减轻了链脲佐菌素引起的胰腺β细胞损伤并保持了胰岛素分泌，这表明4HR可能保护代谢易感的组织免受氧化应激介导的损伤。由于氧化应激和ER应激是乙醇引起的肝脏和胰腺损伤的共同机制，我们假设4HR可能在长期EtOH暴露中对整个肝胰腺轴具有保护作用。因此，本研究的目的是评估4HR是否能够减轻长期乙醇喂养小鼠模型中的EtOH引起的肝胰腺损伤。为此，我们评估了葡萄糖稳态、肝损伤和糖原耗竭、胰腺内分泌改变、氧化应激和ER应激相关反应。这项研究的意义在于确定4HR作为一种潜在的多器官保护剂，可能同时减轻长期EtOH暴露引起的肝脏和胰腺损伤，这是一个尚未充分探索的治疗领域。

2. 材料与方法
2.1. 实验动物和研究设计
从Samtako Bio Korea（韩国奥斯兰）购买了常用的代谢和EtOH喂养研究的C57BL/6J系小鼠。实验开始时小鼠年龄为6周，初始体重约为25克。动物在标准实验室条件下饲养，温度和湿度受控，并保持12小时光照/黑暗周期。每笼子饲养两只小鼠，每天测量每笼子的食物摄入量。除非另有规定，否则食物和水自由供应。所有动物操作均符合机构关于实验室动物护理和使用的指南，并获得了作者所在机构（GWNU-2025-19）的批准（2025年11月3日批准）。小鼠被随机分为四个实验组（每组10只）：（1）对照组，（2）EtOH组，（3）EtOH + 低剂量4HR组（4HR5），（4）EtOH + 高剂量4HR组（4HR10）。本研究中使用的4HR（编号209465；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯；纯度98%）。低剂量和高剂量4HR组的小鼠在整个5周的EtOH喂养期间分别接受5 mg/kg和10 mg/kg的4HR皮下注射。所有动物都经过1周的适应期以适应液态饮食系统。适应期后，EtOH喂养组的小鼠接受了基于Lieber–DeCarli长期乙醇喂养模型（编号710260；Dyets Inc., 美国宾夕法尼亚州贝塞斯达）的含EtOH液态饮食，而对照组则接受了等热量的对照液态饮食（编号710027；Dyets Inc.）[25]。根据制造商的说明，通过每升饮食中加入67毫升95% EtOH来制备EtOH饮食，并在适应阶段逐步引入EtOH，然后在整个5周的实验期间保持目标浓度。在整个研究过程中，每周监测体重，每天评估整体健康状况和食物摄入量（图S1）。

2.2. 葡萄糖耐量测试和血清胰岛素测量
为了评估葡萄糖代谢和胰腺内分泌功能，在实验期结束时进行了葡萄糖耐量测试（GTT）。葡萄糖耐量测试按照之前的描述进行，略有修改[26]。测试前小鼠禁食一夜，并保持自由饮水。禁食后，从尾静脉血液样本中测量基线血糖水平。使用50%葡萄糖溶液进行腹腔注射，剂量为每公斤体重2克。在葡萄糖注射后15分钟、30分钟、60分钟和120分钟使用GreenDoctor血糖仪（GC Pharma，韩国龙仁）测量血糖水平。通过比较每个时间点的血糖水平并计算葡萄糖反应的曲线下面积（AUC）来评估葡萄糖耐量。
为了评估胰腺β细胞功能，在葡萄糖耐量测试期间测量血清胰岛素水平。在禁食和葡萄糖注射后30分钟从小鼠尾静脉采集少量血液。血液样本离心后获得血清，储存在-80°C直到分析。根据制造商的说明使用Mouse Insulin ELISA试剂盒（编号10-1247-01；Mercodia AB，瑞典乌普萨拉）测定血清胰岛素浓度。简要来说，向每个孔中加入10 μL样本，然后加入100 μL酶结合物，在室温下的平板摇床上孵育2小时，洗涤后用TMB底物显色，并在450 nm处读取。
胰岛素生成指数用于评估葡萄糖刺激的胰岛素分泌能力。它定义为葡萄糖负荷后血清胰岛素浓度的增加与血糖浓度增加的比率，计算公式如下：

2.3. 组织学分析
在处死时，采集肝脏和胰腺组织并立即固定在10%中性缓冲福尔马林中。为了最小化叶间采样变异性，所有动物的肝脏样本一致地从左侧叶采集。固定后的组织通过分级乙醇溶液脱水，在二甲苯中透明处理，然后嵌入石蜡中。使用切片机制备石蜡切片（厚度5 μm），并安装在玻璃载玻片上进行组织学分析。对于一般组织学评估，根据标准方案用苏木精和伊红（H&E）对组织切片进行染色。简要来说，切片在二甲苯中脱蜡，通过分级乙醇重新水化，用苏木精染色，然后用伊红复染。脱蜡和装片后，在光学显微镜下检查染色切片。使用配备DP73数码相机的BX51光学显微镜（Olympus，日本东京）在相同的光照条件下以200倍放大倍数获取代表性显微图像。对于定量或半定量组织学评估，每个切片分析三个代表性的不重叠显微视野。在H&E染色的肝脏切片中，根据Kleiner等人描述的组织学评分系统[27]半定量分级炎症。
为了评估肝脏脂质积累，在选定的肝脏样本上进行了Oil Red O染色。因为Oil Red O染色需要冷冻切片，而并非所有样本都有冷冻组织，所以这种分析是在每个实验组的代表性样本上进行的。简要来说，肝脏组织嵌入最佳切割温度化合物中并冷冻。使用冷冻切片机制备冷冻切片（厚度10 μm），并安装在玻璃载玻片上。切片用10%中性缓冲福尔马林固定，用蒸馏水冲洗，然后用Oil Red O工作液染色以可视化中性脂滴。染色后，切片用苏木精复染，洗涤，并安装以进行显微镜检查。在相同的光照条件下使用光学显微镜拍摄图像。通过比较各组之间的染色模式定性地评估脂质积累，并使用数字图像分析量化Oil Red O阳性区域。定量分析是在从选定样本获得的代表性图像上进行的。
为了评估肝脏糖原含量，进行了Periodic Acid–Schiff（PAS）染色。脱蜡和重新水化后，根据制造商的说明用Periodic Acid处理切片，然后与Schiff试剂孵育。PAS阳性的糖原沉积在肝细胞胞质中呈现为洋红色染色。为了半定量分析肝脏糖原沉积，使用在相同光照和放大条件下捕获的代表性显微图像进行数字图像分析。洋红色指数计算为PAS阳性染色区域与选定感兴趣区域（ROI）内总组织面积的百分比。由于PAS阳性的品红色染色在肝细胞质中主要反映糖原沉积，因此该指标被用作肝脏糖原含量的半定量指标。对于每个样本，选取三个具有代表性的显微视野进行分析，并使用平均值作为该动物的代表值。为了确保可靠性，图像分析结果由不了解实验组的人类观察者进行了审查和确认。为了确认糖原的特异性，在PAS染色之前对选定的切片进行了淀粉酶消化处理。组织切片在37°C下与α-淀粉酶（淀粉酶）溶液一起孵育，以酶促降解糖原。淀粉酶处理后PAS染色的减少或消失被解释为PAS阳性信号主要来源于糖原的证据。

2.4. 免疫组织化学
为了评估胰腺组织中内分泌和应激相关蛋白的表达，对胰岛素、胰高血糖素和GADD153（CHOP）进行了免疫组织化学染色。石蜡包埋的胰腺组织切片（5 μm厚度）先用二甲苯脱蜡，然后通过梯度乙醇溶液重新水化。通过将切片在柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中加热来进行抗原回收。使用3%过氧化氢孵育以阻断内源性过氧化物酶活性。在用正常血清阻断以防止非特异性结合后，将切片在4°C下与针对胰岛素（编号sc-8033，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA）、胰高血糖素（编号sc-514592，Santa Cruz Biotechnology）和GADD153（CHOP；编号sc-166682，Santa Cruz Biotechnology）的一抗孵育过夜。所有一抗的稀释比例为1:100。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤后，根据制造商的说明将切片与Dako REAL EnVision辣根过氧化物酶检测系统（Dako，Glostrup，Denmark）一起孵育。使用3,3′-二氨基苯肼（DAB）作为显色底物来可视化免疫反应性，并用苏木精进行复染。染色的切片经过脱水、装片后，在光学显微镜下观察。为了在实验组之间进行比较，捕获了代表性图像。对于GADD153免疫染色的半定量分析，从每个肝切片中选取三个代表性区域，并从每个胰腺切片中选取三个代表性朗格汉斯岛。使用SigmaScan Pro版本5.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）测量选定区域的平均染色强度。相对强度值以0到255的灰度范围表示，其中0表示最低强度，255表示最高强度。三个选定区域的平均值被用作每个样本的代表值。

2.5. 脂质过氧化的测量
通过使用TBARS测定试剂盒（编号10009055；Cayman Chemical，Ann Arbor，MI，USA）并按照先前描述的分析方法[28]测量胰腺组织中的脂质过氧化程度。简而言之，将胰腺组织在适当的缓冲液中匀浆并离心以获得清澈的上清液。然后样品在高温酸性条件下与硫代巴比妥酸（TBA）反应，形成MDA-TBA加合物。在532 nm处通过分光光度法测量产生的显色产物，并使用试剂盒提供的MDA标准曲线计算MDA浓度。将MDA水平按组织重量标准化，并表示为nmol/g组织。

2.6. 西式印迹分析
通过Western印迹分析胰腺组织中胰高血糖素、GRP78和GADD153（CHOP）的蛋白质水平。将胰腺组织在含有蛋白酶抑制混合物（Thermo Scientific，Rockford，IL，USA）的冰冷放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液（iNtRON Biotechnology，Seongnam，Republic of Korea）中匀浆，并离心以从上清液中获得总蛋白质裂解物。使用比色酸（BCA）蛋白质测定法（编号23225；Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL，USA）测量蛋白质浓度。等量的蛋白质通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。膜用5%无脂干牛奶封闭，并在4°C下与针对胰高血糖素（编号sc-514592；Santa Cruz Biotechnology）、GRP78（编号sc-13539；Santa Cruz Biotechnology）和GADD153/CHOP（编号sc-166682；Santa Cruz Biotechnology）的一抗孵育过夜。洗涤后，将膜与稀释比为1:10,000的辣根过氧化物酶结合的二抗孵育。使用增强化学发光（ECL）检测系统和ChemiDoc成像系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）检测蛋白质条带。使用GAPDH（编号sc-137179；Santa Cruz Biotechnology）和β-actin（编号sc-81178；Santa Cruz Biotechnology）作为内部加载对照。使用SigmaScan Pro版本5.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）量化条带强度，并相对于GAPDH和β-actin进行归一化。Western印迹实验重复进行两次。

2.7. 统计分析
除非另有说明，所有定量数据均以平均值±标准差（SD）表示。统计分析使用GraphPad Prism软件版本11.0.1（GraphPad Software，San Diego，CA，USA）进行。对于多个实验组之间的比较，先使用单因素方差分析（ANOVA），然后进行Tukey的事后检验。由于脂肪变性和炎症等级表示序数组织学评分，这些变量使用非参数统计测试进行分析。当适当时，使用Kruskal–Wallis检验评估组间差异，然后进行Dunn的多重比较检验。p值< 0.05被认为具有统计学意义。

3. 结果
3.1. EtOH和4HR对体重和葡萄糖稳态的影响
在研究期结束时，各实验组之间的体重没有显著差异（图1a），表明长期EtOH喂养或4HR给药并未显著影响动物的整体生长或营养状况。然而，长期EtOH摄入导致空腹血糖水平显著降低（图1b）。值得注意的是，4HR给药部分恢复了这些水平，表明其对基础葡萄糖稳态有恢复作用。

3.2. 葡萄糖耐量和胰岛素分泌能力的改变
腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）显示了不同实验组之间的明显代谢特征（图2a）。在外源性葡萄糖负荷后，EtOH喂养的小鼠的葡萄糖波动幅度比对照组小，这一趋势在4HR处理组中部分逆转，特别是在葡萄糖负荷后30分钟时。与EtOH组相比，高剂量4HR组显示出胰岛素生成指数的改善趋势，表明早期胰岛素分泌反应的部分恢复；然而，其值仍低于对照组，因此应谨慎解释这一结果（图2b）。

3.3. 4HR减轻EtOH引起的肝脏炎症
鉴于EtOH喂养小鼠观察到的代谢改变（图2），进一步检查了肝脏的组织学和生化标志物。对照组的苏木精和伊红（H&E）染色显示肝脏结构完整，肝细胞呈明显的索状排列。相比之下，EtOH喂养组显示出明显的肝细胞空泡化，这是肝脏脂肪变性的标志（图3a）。值得注意的是，4HR的给药显著减轻了这些空泡变化，表明其对EtOH引起的结构损伤具有保护作用。

3.4. 4HR减弱EtOH引起的肝脏炎症
鉴于EtOH喂养小鼠观察到的代谢改变（图2），进一步检查了肝脏的组织学和生化标志物。对照组的苏木精和伊红（H&E）染色显示肝脏结构完整，肝细胞呈明显的索状排列。相比之下，EtOH喂养组显示出明显的肝细胞空泡化，这是肝脏脂肪变性的特征（图3a）。值得注意的是，4HR的给药显著缓解了这些空泡变化，表明其对EtOH引起的结构损伤具有保护作用。

3.5. 4HR不显著逆转EtOH引起的肝脏糖原耗竭
为了进一步评估EtOH对肝脏能量底物的影响，使用PAS染色评估了肝脏糖原含量。在对照组中，肝细胞显示出强烈的PAS阳性染色，表明糖原储存丰富（图4a）。相比之下，EtOH喂养组在整个肝实质中显示出显著的PAS染色减少，表明肝脏糖原储备严重耗竭。尽管4HR处理组在视觉上显示出轻微的增加PAS染色的趋势，但这一趋势未被定量分析所证实。

3.6. 4HR保持胰腺岛细胞结构并减轻氧化应激
为了确定长期EtOH暴露是否影响胰腺内分泌的完整性，我们进行了组织和免疫组织化学（IHC）分析。对照组的H&E染色显示胰腺结构完整，具有排列良好的腺泡细胞和明确的朗格汉斯岛（图5a）。相比之下，EtOH喂养组显示出岛屿细胞结构的明显破坏，边缘不规则，周围的外分泌实质也有局部改变。值得注意的是，4HR的给药部分但显著保持了胰腺岛的结构组织。

3.7. 4HR保存胰腺岛细胞结构并减轻氧化应激
为了确定长期EtOH暴露是否影响胰腺内分泌的完整性，我们进行了组织和免疫组织化学（IHC）分析。对照组的H&E染色显示胰腺结构完整，具有排列良好的腺泡细胞和明确的朗格汉斯岛（图5a）。相比之下，EtOH喂养组显示出岛屿细胞结构的明显破坏，边缘不规则，周围外分泌实质也有局部改变。值得注意的是，4HR的给药部分但显著保持了胰腺岛的结构组织。数值代表平均值±标准差（** p < 0.01）。进行了胰岛素的免疫组化（IHC）染色以评估β细胞的功能完整性。对照组在胰岛核心显示出强大且均匀的胰岛素免疫反应性。相比之下，乙醇（EtOH）暴露导致胰岛素阳性区域和强度显著减少，表明β细胞的分泌能力受损。然而，经4小时（4HR）处理的鼠显示出显著更高的胰岛素免疫反应性，表明在乙醇暴露下β细胞的功能完整性部分得到保留。此外，葡萄糖激素（glucagon）阳性的α细胞的分布，在对照组中仅限于胰岛外围，在乙醇组中则发生了紊乱。4HR处理有效地维持了更典型的α细胞分布，表明整体胰岛形态部分得到保留。为了量化氧化损伤的程度，我们使用TBARS测定法测量了胰腺组织中的丙二醛（MDA）水平（图5b）。长期乙醇摄入导致胰腺MDA水平显著升高（p < 0.01），表明脂质过氧化加剧。重要的是，10毫克/公斤（mg/kg）的4HR处理显著降低了MDA水平（p < 0.01），而5毫克/公斤（mg/kg）剂量未达到统计显著性（p > 0.05）。这些定量数据支持了组织学证据，表明减轻氧化应激可能在一定程度上解释了4HR处理所观察到的胰腺效应。

4HR减轻由乙醇诱导的肝脏和胰腺的内质网（ER）应激
为了研究代谢和组织学改变是否与内质网（ER）应激相关，我们检测了GADD153（CHOP）的表达，这是一种促凋亡转录因子，也是未解决ER应激的标志物。通过在胰腺和肝脏组织中进行IHC分析，并在胰腺组织中进行Western blotting分析来检测GADD153的表达。免疫组化染色显示对照组中GADD153的免疫反应性极低，而乙醇喂养的鼠在胰腺和肝脏中显示出明显增加的染色（图6a）。定量分析证实，与对照组相比，乙醇组中GADD153的表达显著增加（图6b,c）。在胰腺组织中，4HR5和4HR10处理显著降低了GADD153的免疫反应性，而在肝脏组织中，仅4HR10组显示出显著降低（图6b,c）。与这些发现一致，胰腺组织的Western blot分析显示乙醇组中GRP78、GADD153（CHOP）和葡萄糖激素的表达增加（图6d）。定量密度分析进一步支持了这些变化（图6e–g）。使用β-actin作为互补加载对照的定量分析显示的结果与图S2中呈现的结果相似。4HR处理降低了胰腺组织中这些ER应激相关标志物的表达，尽管各个标志物的恢复程度不同（图6）。图6. 乙醇喂养和4HR处理对胰腺和肝脏组织中内质网（ER）应激相关蛋白表达的影响。(a) 来自对照组、乙醇组、4HR5组和4HR10组的胰腺和肝脏组织中GADD153的代表性免疫组化染色。与对照组相比，乙醇喂养的鼠显示出更高的免疫反应性，而4HR处理降低了染色强度。刻度条= 50 μm。(b) 胰腺组织中GADD153免疫染色强度的半定量分析。(c) 肝脏组织中GADD153免疫染色强度的半定量分析。(d) 胰腺组织中GRP78、GADD153（CHOP）和葡萄糖激素表达的Western blot分析。乙醇暴露增加了与ER应激相关蛋白的表达，而4HR处理缓解了这些变化。GAPDH被用作加载对照。(e–g) GRP78（e）、GADD153（f）和葡萄糖激素（g）的Western blot结果的量化，以GAPDH为标准。数据以平均值±标准差表示。统计显著性如所示（* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.005）。

4. 讨论
本研究显示，长期乙醇暴露导致肝脏和胰腺的代谢和组织损伤，包括葡萄糖稳态的改变、肝毒性和炎症变化、肝糖原的耗竭、胰岛的破坏以及ER应激相关标志物GADD153（CHOP）的表达增加。这些发现与先前的研究一致，表明长期乙醇暴露会导致肝脏和胰腺的代谢和细胞损伤[29]。在这个病理生理背景下，当前的结果表明4HR处理可能在相同的长期乙醇喂养模型中减轻几种乙醇诱导的肝脏和胰腺改变，支持其作为多器官保护剂的潜力。本研究中观察到的肝脏改变（图3），包括肝细胞空泡化、脂质沉积增加和血清ALT水平升高，与酒精相关性肝病（ALD）的特征一致[29]。乙醇通过乙醇脱氢酶和细胞色素P450 2E1代谢产生乙醛和ROS，同时使细胞内的氧化还原状态向NADH/NAD+比率升高[30,31]。这种代谢失衡抑制了脂肪酸氧化并促进了从头脂质生成，从而导致乙醇喂养组观察到的脂肪变性表型[32,33]。在本研究中，4HR处理减少了肝空泡变化、Oil Red O阳性的脂质积累和ALT升高，表明4HR可能减轻与长期乙醇暴露相关的肝脏损伤。本研究的一个显著发现是乙醇喂养鼠肝糖原储存的显著耗竭（图4）。虽然肝脂肪变性反映了能量底物的积累，但糖原的同时丧失表明肝脏能量动员和葡萄糖稳态的紊乱。乙醇代谢增加了肝脏的NADH/NAD+比率，这可以抑制糖异生并改变肝脏的葡萄糖输出，从而导致空腹低血糖和糖原储存减少[1,34,35]。在本研究中，通过视觉检查，4HR处理组的PAS染色似乎略高于乙醇组（图4）；然而，使用洋红色指数的定量分析并未显示出相对于乙醇组的统计显著恢复。因此，当前数据不支持4HR恢复了肝糖原储备的结论。这种不完全的恢复可能反映了长期乙醇引起的肝脏能量代谢紊乱的严重性、治疗持续时间或剂量不足以恢复糖原，或者4HR主要减轻了炎症、脂质相关、氧化和ER应激反应，而不是直接恢复正常肝糖原储存。尽管如此，我们最近的研究表明4HR增强了肝GLUT4表达、AMPK磷酸化和葡萄糖摄取，并与体内肝细胞中糖原储存的增加有关[20]。因为AMPK是肝脏能量代谢的关键调节器[36]，这些先前的发现表明4HR可能影响应激条件下的肝脏葡萄糖处理和代谢适应，尽管在当前的长期乙醇模型中尚未直接确定确切的分子机制。除了肝脏，我们的数据还强调了胰腺对长期乙醇暴露的高敏感性。胰岛素免疫反应性的降低和胰岛素生成指数的减少（图2和图5）表明胰腺β细胞功能受损。由于β细胞具有有限的内源性抗氧化能力，它们特别容易受到乙醇代谢过程中产生的ROS和乙醛的影响[37,38]。在本研究中，长期乙醇暴露还与肝脏和胰腺中GADD153（CHOP）的上调有关（图6）。CHOP是一种公认的未解决ER应激的下游介质，当未折叠蛋白反应从适应性信号转为促凋亡途径时会被诱导[39]。因此，乙醇组中观察到的CHOP表达增加与长期乙醇暴露可能在两个器官中触发适应性不良的ER应激一致。值得注意的是，4HR处理减少了肝脏和胰腺中的CHOP表达（图6）。尽管本研究未直接评估上游ER应激调节因子，但这种减少表明4HR可能减轻乙醇诱导的细胞应激，从而限制了与ER应激相关的凋亡信号的进展。本研究中观察到的4HR的保护作用可能与其先前报道的抗氧化和细胞保护特性有关。4HR是一种酚类化合物，广泛用作抗菌剂[40]，但越来越多的证据表明它还可以调节细胞应激反应和代谢信号通路[20]。已知酚类化合物可作为自由基清除剂，并通过中和ROS来减少氧化损伤[41,42]。在实验模型中，4HR已被证明可以减轻氧化应激引起的细胞损伤，并影响与能量稳态相关的代谢信号通路[43,44]。由于长期乙醇暴露会产生大量氧化应激并破坏细胞内氧化还原平衡[45]，4HR调节这些应激反应的能力可能有助于其保护作用。在本研究中，4HR处理与多种乙醇诱导的改变有关，包括肝脏炎症、胰腺内分泌紊乱和GADD153表达的改善（图2、图3、图4、图5和图6）。然而，关于糖原的发现应更谨慎地解释，因为定量分析未显示出相对于乙醇组的统计显著恢复（图4）。总的来说，这些发现支持4HR可能在乙醇诱导的损伤条件下调节代谢和细胞应激反应，可能是通过与氧化应激和ER应激相关信号的作用。尽管确切的分子机制尚待澄清，但当前结果表明4HR可能具有超出其传统抗菌作用的更广泛的生物活性，并可能成为缓解乙醇诱导的代谢和组织损伤的候选化合物。尽管有这些发现，但仍应考虑几个限制。首先，尽管通过Oil Red O染色证明了肝脏脂质积累，但这一分析是在选定的冷冻样本上进行的，而不是所有动物样本，因为并非所有动物的冷冻组织都可用。其次，尽管本研究显示ER应激相关标志物（包括GADD153（CHOP）和GRP78）的表达增加，但未评估关键的上游信号通路，如PERK–eIF2α–ATF4或IRE1α信号通路，这将允许更全面地表征ER应激的激活。第三，尽管结果表明氧化应激可能促成乙醇诱导的肝脏和胰腺损伤，但本研究未直接测量ROS或抗氧化酶活性。第四，本研究未包括单独使用4HR的处理组。因为4HR本身可能调节代谢信号和细胞应激反应，包含仅用4HR的组将能够更清楚地区分其内在生物学效应和其对乙醇诱导损伤的保护效应。第五，尽管通过免疫组化在两个器官中评估了与ER应激相关的改变，但Western blot分析仅在胰腺组织中进行，而不在肝脏组织中进行，这限制了组织特异性的分子比较。最后，本研究是在小鼠长期乙醇喂养模型中进行的，因此这些发现应在控制条件下解释为预防或同时保护效应，而不是治疗性逆转现有的酒精诱导的肝脏或胰腺损伤。因此，本研究中观察到的4HR的保护作用不能直接外推到人类的治疗效果。因此，未来的研究应包括更全面的分子分析、额外的氧化应激相关标志物、仅用4HR的对照组、在酒精诱导的组织损伤发生后施用4HR的延迟治疗模型，以及补充的细胞和临床前模型，以更好地定义4HR在酒精相关代谢和器官损伤中的机制和转化相关性。

5. 结论
总之，本研究证明长期乙醇暴露导致肝脏和胰腺的代谢和细胞改变。乙醇喂养导致了显著的代谢紊乱，包括葡萄糖调节受损、肝脂肪变性以及肝糖原储存的耗竭。此外，乙醇暴露破坏了胰腺的内分泌完整性，并增加了肝脏和胰腺组织中ER应激标志物GADD153的表达，表明与应激相关的细胞通路被激活。重要的是，4HR的应用部分缓解了乙醇引起的一些变化，包括肝脏脂质积累、胰腺内分泌紊乱、氧化应激和内质网应激激活；然而，在目前的实验条件下，4HR未能显著恢复乙醇引起的肝脏糖原耗尽。这些发现表明，乙醇引起的代谢失衡涉及肝脏和胰腺的功能障碍，并且内质网应激可能在这个过程中起着重要作用。4HR能够减轻这些变化的能力表明，它可能通过调节代谢和细胞应激反应来发挥保护作用。总体而言，这项研究强调了4HR作为对抗乙醇引起的代谢和组织损伤的保护剂的潜在作用，尽管需要进一步的研究来阐明其分子机制和治疗应用性。补充材料：以下支持信息可以在以下网址下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/biomedicines14051077/s1。图S1：累积食物摄入量；图S2：利用β-actin作为补充加载对照，对胰腺内质网应激相关蛋白表达的定量分析。