黏土分散作用与阳离子转移在蒙脱石催化的双酚A臭氧氧化水处理中的角色及其引发的生态毒性效应 作者：Ahlem Bargougui、David Dewez 和 Abdelkrim Azzouz

《Environments》：Role of Clay Dispersion and Cation Transfer in Montmorillonite-Catalyzed Ozonation of Bisphenol A in Water Treatment and Induced Ecotoxicity Ahlem Bargougui, David Dewez and Abdelkrim Azzouz

　　摘要：本研究探讨了可交换阳离子对双酚A（BPA）在蒙脱石催化臭氧化过程中的吸附和降解作用，并将其与原始膨润土进行了比较。在NaMt上进行5分钟的吸附后，即可实现100%的BPA去除；而所有粘土催化剂在15分钟的臭氧化后也可以去除BPA，但并未完全使其矿化。通过使用水生植物Lemna minor作为生物指示物种，发现BPA的降解程度与臭氧化后混合物的生态毒性相关。液相色谱分析表明，BPA的吸附促进了臭氧化过程，且BPA的降解速率和生态毒性强烈依赖于可交换阳离子以及粘土催化剂的粒径。这些因素还影响臭氧化和吸附过程，从而直接影响对生物体的毒性。本研究的结果预示着基于粘土的氧化水处理方法能够有效去除BPA，并大幅减少其持久性衍生物的量。

1. 引言
水生环境中有机污染物的存在不可避免地会对生态系统、生物多样性和人类健康造成影响。在常温条件下，这些污染物部分氧化会产生多种中间体，其中一些中间体可能会积累，对水生生物产生潜在毒性。双酚A（BPA），即2,2-双(4-羟基苯基)丙烷，由于其广泛应用于制造环氧树脂和聚碳酸酯塑料（主要用于食品包装、药品和化妆品等）[1]，在各种废水中被频繁检测到[2,3]。据报道，地表水中的BPA浓度范围为10至1000 ng·L?1[4]，而在工业和城市废水中甚至可达到10–20 μg·L?1[5,6]。尽管有严格的水质要求，处理后的水中仍存在高达1 μg·L?1的BPA[7]，甚至在饮用水中也能检测到[8]，并且BPA还存在于食物、人体组织和液体中[9,10,11]。人类消费产品长期接触BPA的影响以及BPA在自然环境中缓慢且不可避免地降解为中间体的过程及其生态毒性后果仍不清楚[12,13,14,15,16,17,18,19]。BPA是一种已知的内分泌干扰物（EDC），已被证实会影响水生生态系统的激素系统和动物繁殖能力[20,21,22]，导致某些水生物种出现雌性化现象[23,24,25]、生育问题[26]、胚胎着床失败[27]以及心血管疾病[28,29]。此外，BPA还与Lemna minor生长减缓和Artemia salina毒性增加有关[30]，并已被证实能引发某些癌症[31]、高血压、心脏病、糖尿病及肝功能障碍[32,33]。出于对人类健康的考虑，自2011年起禁止在婴儿用品制造中使用BPA[26,34,35]。

BPA具有酚基结构，使其在温和氧化剂作用下具有稳定性，并能在空气中长期存在，从而阻碍其完全矿化[1]。其两性至弱碱性的特性使其在酸性和碱性条件下都具有较高的稳定性，进一步减缓了其自然降解[36]。即使在紫外线-可见光辐射和臭氧（O?）等氧化剂的作用下，BPA在自然环境中的氧化也不完全，产生的降解产物仍可能通过破坏生物体的抗氧化能力对其造成额外伤害[37]。除非完全禁止BPA的使用，否则仅通过矿化来去除所有残留的中间体才是可行的策略。尽管已提出了多种方法（包括微生物生物修复和氧化过程），但在实现BPA及其衍生物的完全矿化方面效果不佳[38,39,40,41]。臭氧化可能是更好的选择，但由于臭氧在水中的溶解度较低，需要消耗大量的臭氧和能源[42]。使用某些基于金属和金属氧化物的催化剂（如MnOx/SBA-15）可以改进BPA的降解过程[43]、中间体的分布以及其引发的毒性[44]。研究发现，铁和镍等金属在有氧[45]和缺氧[46]条件下均具有显著的催化活性，能够促进有机污染物的降解。这些金属存在于土壤和水生介质中，可增强催化性能，促进电子转移。载有金属的粘土通过增强吸附作用来弥补臭氧的低溶解度，从而改善臭氧化效果。这种方法利用了土壤和水生介质自我调节的能力，实现了受自然启发的有机污染物氧化降解过程[47]。因此，由负载金属的粘土矿物催化的臭氧化过程与大多数暴露在空气和太阳辐射下的浑浊水介质中的土壤或粘土悬浮液中的非生物氧化过程非常相似[48,49]。本研究的核心创新点即在于使用替换为无害金属阳离子（K?、Ca2?和Mg2?）的蒙脱石催化BPA的臭氧化。这种方法在去除多种有机污染物方面已显示出良好的效果[50,51,52,53,54]。然而，关于粘土硅醇基团在催化过程和吸附中的作用的研究较少[54,55]，将其与BPA去除率、中间体分布和过程毒性变化关联起来的研究更是寥寥无几[47,52,53,56,57,58,59]。除非完全矿化，否则BPA衍生物的毒性可能高于母体分子[60]。BPA在自然环境和水处理过程中的部分氧化可能对生物多样性产生不利影响，值得进一步研究。因此，本研究旨在探讨这种影响。

为此，研究了中间体分布变化对植物生物指示物种Lemna minor生长的影响，该物种对生态毒性高度敏感[61]。Lemna minor是常见于可能受到有机污染物污染的水生介质中的生物多样性代表。本研究有望提供宝贵数据，预测有机污染物及其衍生物的降解性、内在毒性和这些性质如何受蒙脱石可交换阳离子的影响。本研究还尝试将BPA的降解速率和中间体分布与每种粘土催化剂产生的活性氧（ROS）和其他毒性生物标志物相关联。讨论主要集中在初始臭氧化阶段，假设此时中间体分解的副反应不明显。

2. 材料与方法
2.1. 粘土催化剂的制备与表征
首先，通过传统方法[62]提纯了Aldrich膨润土（Sigma-Aldrich，Burlington，MA，美国），其Si/Al摩尔比为2.50，阳离子交换容量（CEC）约为98–100 meq/100 mg，具体化学组成见表S1。纯化过程中去除了石英和结晶球粒等密实二氧化硅相及其他火山灰（主要是伊利石和云母）。将400克膨润土和50克NaCl加入2升蒸馏水中，在80°C下剧烈搅拌7小时后冷却24小时。然后将粘土悬浮液反复离心并用蒸馏水洗至AgNO?水溶液检测不出氯化物。富含Na?交换后的蒙脱石（NaMt）通过离心并在40°C下风干过夜获得。接下来，在70–80°C下，将NaMt在不同1 M硝酸盐金属盐溶液中进行离子交换4–5小时，得到KMt、Mg(II)Mt和Fe(II)Mt等不同阳离子交换的蒙脱石。K?、Ca2?和Mg2?等金属阳离子在大多数土壤和水生介质中普遍存在，可作为有机污染物的载体。选择这些阳离子是为了模拟粘土催化的BPA臭氧化过程中有机污染物的自然部分降解情况，避免金属本身的毒性干扰BPA及其衍生物的降解。选择Na?和Fe2?的原因包括：(i)它们在自然界中的普遍存在；(ii)Fe2?在土壤和水体自我调节中的催化作用；(iii)Na?对许多生物体的营养作用。所得粘土悬浮液在室温下用新鲜去离子水反复透析，最后在60°C下离心并风干过夜。通过X射线衍射（XRD，D8 Advance Brucker仪器，Madison，WI，美国，CuKα 1.54051 ?）分析了NaMt在低pH（1–6）下0–30分钟内的化学稳定性。此外，还使用电感耦合等离子体光发射光谱（ICP-OES）分析了离子交换过程中粘土矿物化学组成的变化。

2.2. 吸附与臭氧化实验
首先，用Sigma-Aldrich提供的纯度≥98%的双酚A（BPA）制备了10?? M的 aqueous 溶液，并在Nanopure水中剧烈搅拌24小时。通过UV-Vis光谱仪（Agilent-Cary 60 UV-Vis spectrophotometer，Agilent Technologies Canada Inc.，Mississauga，ON，加拿大）制备了不同浓度的BPA溶液，用于绘制吸收曲线。吸附实验在室温下进行，吸附剂为40毫克，接触时间为不同时间。为了改变初始pH值，还添加了少量0.1 M氢氧化钠（NaOH）或盐酸（HCl）。选择HCl是因为其在严苛条件下能保持Mt的晶格结构[63]。所有Mt样品的XRD图谱均显示清晰的001峰，且粘土层片层排列完美，未检测到2-θ值偏移或结晶度损失（图S1）。先前的研究已证明Mt在短接触时间内对酸性介质具有化学稳定性[62]。0.05 M和0.25 M的HCl浓度仅导致H?通过离子交换进入层间间隙，但在室温下24小时酸处理后结构未发生改变[64]。接下来，在50毫升圆柱形玻璃反应器中加入20毫升BPA溶液（含或不含40毫克基于Mt的催化剂粉末），通入臭氧（600 mg·h?1，由A2Z Ozone Inc.，Louisville，KY，美国产生），在不同的气体 bubbling 时间下进行臭氧化实验。由于臭氧溶解度较低，其最大浓度约为0.4 mmol/L[52]。实验过程中还离心上清液以获得澄清无浑浊的混合物。通过测量每个臭氧化混合物上清液的相对吸光度（A/A?）× 100%（Agilent-Cary 60光谱仪，Santa Clara，CA，美国，1厘米石英池）来定性评估反应进程。BPA的去除率通过高效液相色谱（HPLC）对吸附和臭氧处理过程进行了定量评估，最大标准偏差为0.1%。实验使用Waters Alliance 2695系统和Agilent C18柱（4.6毫米×150毫米，5微米粒径），并与Waters 2487二极管阵列检测器（HPLC-DAD）在275纳米波长下联用。由于样品体积小且BPA浓度低，且没有针对BPA的矿化作用，HPLC分析已经足够准确，无需通过总有机化合物测量（TOC）进行验证。采用梯度洗脱法，流动相为乙腈和Nanopure水，流速为1.0毫升·分钟^-1。梯度方案为：0分钟时30%乙腈，0-5分钟时增加到50%，5-8分钟时回到30%，12分钟后升至70%。进样量为20微升。BPA的去除率根据以下公式计算：对于吸附过程，使用(1 ? A/A0) × 100%；对于臭氧处理过程，使用(1 ? I/I0) × 100%，其中A/A0是通过校准曲线确定的残留BPA浓度的HPLC峰值面积。

2.3. 黏土矿物分散性评估
通过测量ζ电位（ZP）和粒径（PS）来分析吸附和臭氧处理后的混合物，以评估粘土材料在水介质中的分散情况。这种介质应类似于自然水生环境，其中粘土颗粒具有高度多分散性和各向异性，表现出随机粒径和形状，并与BPA、其衍生物以及氧化物种发生相互作用。在此实验中，介质的pH值根据这些相互作用而变化，从而直接影响Mt悬浮液的稳定性[65,66]。方法是将40毫克Mt粉末分散在20毫升Nanopure水中或吸附和臭氧处理后的混合物中。上清液进一步通过45微米孔径的过滤器过滤，以测定释放的金属阳离子含量。使用Agilent Technologies 5100光谱仪（美国加利福尼亚州圣克拉拉市）进行电感耦合等离子体光学发射光谱（ICP-OES）分析，该光谱仪采用轴向配置并且配备了同心石英雾化器。在之前将2毫升上清液与等体积的浓缩硝酸（HNO3，70%）在120°C下酸消化2小时后，冷却并用Nanopure水稀释至最终酸度为5%（v/v）HNO3。使用从认证标准溶液（Sigma-Aldrich）在5% HNO3基质中制备的校准曲线进行定量，测量范围为0至25,000纳克·毫升^-1。数据采集和处理使用专用的ICP Expert软件（版本7.4.2）[66]完成。

pH值和Mt分散性对BPA溶液中的吸附和臭氧处理效率有影响，进而间接影响上清液的毒性。Mt分散性与毒性之间的相关性研究基于pH值、溶解的金属阳离子和副产品的中心作用。为此，对NaMt和Fe(II)Mt进行了33个因素实验设计，考察了初始pH值、臭氧处理时间和粘土矿物量对吸附和臭氧处理以及一些毒性生物标志物的影响。每个参数的变化范围包括三个不同水平，即上限、中和下限，这是基于初步实验和可用数据的综合分析（表S3）。选择NaMt和Fe(II)Mt作为蒙脱石酸碱特性的下限和上限，因为它们的pH值被认为控制着其在液体介质中的分散性和催化性质。模型系数的计算得到了多项式回归方程，描述了(i)吸附和臭氧处理以及(ii)基于初始pH值（x1）、吸附和臭氧处理时间（x2）和粘土矿物浓度（x3）的主要生物标志物的主要响应函数（表S7和S8）。这些数学模型不仅考虑了过程变量的单独效应，还考虑了它们对不同响应函数之间的相互作用。

2.4. Lemna minor的毒性测试
Lemna minor在标准化的SIS营养培养基（表S2）中培养，调整pH值为6.5 ± 0.2，并进行高压灭菌处理。植物在受控条件下生长：16/8小时光照/黑暗周期（100 ± 10微摩尔光子·平方米·秒^-1），温度24 ± 2°C，相对湿度60 ± 5%。为了评估毒性，测试了BPA溶液（0.001–10毫克·升^-1，溶于Nanopure水中），分别在吸附或臭氧处理前后进行。测试过程按照经济合作与发展组织（2006年）[61]的要求进行。所有测试均与对照组样品进行比较，对照组样品包含未经臭氧处理的Lemna minor。空白样品根据实验情况而定，可能是不含BPA的对照样品或不含粘土矿物的对照样品，具体见每张图的说明。对于每个重复实验，将5毫升测试滤液与20毫升SIS培养基和三片叶子的植物一起放入50毫升Erlenmeyer烧瓶中；对照组样品只有植物，置于25毫升SIS培养基中。暴露7天后，通过多种生物标志物（如叶片数量、新鲜重量和ROS产生量）来估计生长抑制情况[65,66]。使用CellROX? Green试剂（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）通过荧光法测量整个植物组织中的细胞内ROS水平[65]。暴露7天后，将植物轻轻吸干并在黑暗中于25°C下孵育30分钟，使用5微摩尔CellROX Green（激发/发射最大值：485/520纳米）。随后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）在室温下冲洗10分钟以去除多余的探针。相对荧光在520纳米发射波长（激发：485纳米；增益：200）下使用相同的微孔板读取器进行测量。测得的ROS产生量按单位生物量（新鲜重量）进行归一化。

从Lemna minor叶片中提取叶绿素（Chl），方法是在室温下用5毫升95%（v/v）乙醇进行机械匀浆。所得匀浆液离心后，使用微孔板读取器（Infinite M200?，瑞士Tecan）在665纳米和648纳米处测量上清液的吸光度[67]。叶绿素浓度（μg·毫升^-1）根据Lichtenthaler方程式[67]计算[67]：

通常预期低pH值会对L. minor产生不利影响，甚至超过SIS培养基的pH值。与臭氧处理后的混合物类似，所有在土壤和/或水生介质中释放有机分子的自然氧化水都具有低pH值，并对生物多样性产生不利影响。这也是开展本研究的原因。在本研究中，不建议在SIS培养基水平上进行pH调整，因为添加酸或碱（稀释的HCl或NaOH）会导致离子力的不可避免改变，可能还会改变BPA及其衍生物的毒性。

3. 结果与讨论
3.1. pH值对BPA吸附的影响
在BPA吸附的最初五分钟内，上清液的UV-Vis光谱中195–205纳米、225纳米和275纳米带显示出明显的强度下降（图S2和S3）。这些带主要涉及芳香环的π-π*和n-π*跃迁，是BPA通过吸附被消耗的准确指标。NaMt的强度下降最为明显，MgMt和膨润土的下降程度相对较小，这解释了它们比其他基于Mt的吸附剂更高的吸附效率，这与它们可交换阳离子的酸碱性质有关。其中，Na+和Fe2+可以被视为研究有机污染水中离子交换蒙脱石酸碱性质的良好候选者，因为这些阳离子通常使介质呈酸性，pH值几乎无法达到6。在1–6的pH范围内，接触时间小于30分钟时，未观察到Mt结构和结晶度的明显变化。因此选择15分钟作为进一步建模和优化步骤中的pH值中心值是合理的。在这个pH范围内，对NaMt和Fe(II)Mt上的BPA吸附施加不同的初始pH值时，最终pH值显示出近似线性增加（图1）。这是因为在pH 2时Fe2+从分散的Fe(OH)2悬浮液中溶解，导致Na+/H+和Fe2+/H+浓度比增加，随后逐渐被脱质子化的BPA分子和硅醇捕获。随着pH值接近3–4，施加的酸度带来的遮蔽效应和同时释放的质子效应逐渐减弱，最终pH值趋于一致。在这个接近许多类型的二氧化硅和铝硅酸盐的pH零电荷（pHZC）[68,69,70,71]的水平，最终pH值有所增加。图1显示了初始pH值对NaMt（a）和Fe(II)Mt（b）上BPA吸附过程中水介质最终pH值的影响。T：25°C；体积：20毫升；BPA浓度：10^-4 M；Mt量：40毫克（2克·升^-1）。初始pH值是通过加入适量的0.1 M HCl或NaOH溶液调整得到的。在加入粘土吸附剂后20–30秒的接触时间后测量初始pH值。在这个pH范围内，由于NaMt和Fe(II)Mt悬浮液的UV-Vis光谱几乎相似（图S4和S5），未观察到pH值的显著影响。然而，HPLC-DAD显示出发射率有显著波动，NaMt的下降几乎不可检测，而Fe(II)Mt的下降较为明显，从80–84%下降到45–60%（图S6和S7）。一个合理的解释是BPA/Mt之间的静电相互作用几乎完全缺失。实际上，BPA的pKa1和pKa2分别为约9.59和10.2[72]，因此在pH值低于3时BPA分子应几乎完全呈中性，在pH值4时则完全呈中性。这应该主要限制BPA的吸附通过疏水性[methyl:siloxy]相互作用和亲水性[phenol–phenol]分子间H-桥（图1）。在这个pH范围内，吸附的中性BPA分子应有助于Mt层状结构的胶凝，通过[Mt:BPA:BPA:Mt]夹心相互作用导致颗粒聚集（图1）。

3.2. 吸附过程中的阳离子转移
随着SiOH2+团组逐渐转化为中性SiOH，当pH值接近pHZC时，排斥性正电荷减少，这解释了ζ电位的明显下降（图2）。这一pH阈值预计会引发SiOH脱质子化为SiO?团组，从而导致：(i) BPA分子和Mt表面的排斥性负电荷增加以及Mt层状结构的剥离；(ii) 亲水性的增强；(iii) BPA通过与水分子的竞争性相互作用而轻微脱附；(iv) 阳离子可能被BPA和Mt表面捕获。在研究的1–6 pH范围内，负电荷主要来源于与Si、H和Al或Mg原子的≡S-O基团结合。后者具有不同的pKa值，包括5.3（≡Si(OH)2Mg）、5.9（≡Si(OH)2Al）和6.3–10.41（适用于各种空间构型和周围原子）。鉴于(≡Al(OH)Al位点的相对较高的pKa值分别为10.1（相当于Al(OH2)(OH)）和13.2，这些位点在边缘结构中对表面负电荷的贡献应该很小[73]。Mg2+的存在似乎增加了邻近区域的pKa值[73]。图2显示了在NaMt（红色）和Fe(II)Mt（蓝色）存在下，BPA吸附的泽塔电位与初始（a）和最终pH值（b）的关系。温度：25°C。样品体积：20毫升。BPA初始浓度：10^-4 M。Mt含量：40毫克（2克/升）。添加Mt到BPA溶液后20-30秒测量初始pH值。添加Mt到BPA溶液后5分钟测量初始泽塔电位。吸附30分钟后测定最终泽塔电位。亲水性的提高通过195-205纳米谱带的变蓝现象得到了很好的说明，这归因于与水分子的n-π*相互作用。在pH 6时，30分钟后该谱带变蓝约15纳米（从210纳米变为195纳米），在更高的pH值下这一现象更为明显（见图S4和S5）。随着pH值的增加，BPA与水分子的相互作用增强也涉及到BPA的脱质子化，这有助于通过离子交换捕获阳离子。表面负电荷的增加预计会减弱泽塔电位的下降，并增强从液体介质中捕获阳离子的能力（图3）。这一点从吸附介质中Na+浓度的显著下降可以得到很好地证明，Na+浓度在BPA吸附NaMt 30分钟后达到一个平台值。图3还显示了初始pH值对BPA吸附在NaMt（a）和Fe(II)Mt（b）上的纳米纯水中的上清液阳离子浓度的影响，通过ICP-OES测定。温度：25°C。样品体积：20毫升。BPA初始浓度：10^-4 M。Mt含量：40毫克（2克/升）。添加Mt到BPA溶液后20-30秒测量初始pH值。对于Fe(II)Mt，pH 2.8-3.3时的平台值对应于溶液中约1 ppm的最低Fe2+浓度，并且不像NaMt那样受到吸附时间的影响（见图3b）。因此，BPA在离子交换蒙脱石上的吸附似乎伴随着固体表面、脱质子化的BPA分子和渗透介质之间的pH依赖性阳离子交换。由于初始pH值的增加有利于在吸附过程中从液体介质中捕获阳离子（见图2和图3），所以在臭氧化过程中应该会出现相反的现象，无论哪种阳离子。粘土矿物中的阳离子被生成的酸性物质提供的质子所取代，这些酸性物质又会捕获释放出的阳离子。如果发生Fe2+沉淀，那么应在pH值高于2或阳离子通过离子交换或螯合作用被捕获时发生。

3.3 pH值对粘土分散的影响
pH值从1增加到6会导致硅醇的弱但足够的脱质子化，从而促进粘土分散，并使主要的质子化硅醇暴露于体溶液中。随之而来的亲水性的增强以及负电荷密度的增加促使蒙脱石层状结构的剥离和分层，这一点通过粒径的显著减小得到了证实（见图4）。这种现象已经在中酸活化的膨润土中被报道过，其中发现粘土的分散受到表面亲水-疏水比例的控制[54]。后者强烈依赖于水介质的pH值。这种现象似乎减少了[Mt:BPA:Mt]键合疏水性的贡献，并决定了BPA分子的疏水/亲水端朝向体溶液的方向（图2）。图4显示了在NaMt（红色）和Fe(II)Mt（蓝色）存在下，BPA吸附时粒径与初始（a）和最终pH值（b）的相关性。温度：25°C。样品体积：20毫升。BPA初始浓度：10^-4 M。Mt含量：40毫克（2克/升）。添加粘土吸附剂到BPA溶液后20-30秒测量初始pH值。吸附过程30分钟后测定最终pH值。图2示意性地说明了在pH值高于pHZC时，通过脱质子化的可交换位点（硅醇）、吸附的BPA和自由的BPA进行的阳离子交换：(a) 疏水[methyl:siloxy]相互作用；(b) [BPA-O-:Fe2+:-O-BPA]、[BPA-O-:Fe2+:-O-Mt]和[Mt-O-:Fe2+:-O-Mt]桥；(c) 含有较少H+和Na+或Fe2+阳离子的介质。BPA分子的存在似乎逆转了表面的疏水特性，从而促进了通过脱质子化的BPA羟基和硅醇的阳离子捕获。这应该使吸附的BPA的甲基基团朝向Mt表面的硅氧基岛，并使可接近的OH基团和脱质子的对应物暴露于体溶液中，这被认为有助于促进和增强颗粒分散。粒径的连续减小被认为改善了可接触的表面积，从而有利于粘土催化的臭氧化。

3.4 吸附与臭氧化之间的相关性
在臭氧化过程中，最初的10分钟内观察到220-245纳米紫外带的整体强度增加（见图S8和S9）。这归因于π → π*和n → π*电子跃迁，表明形成了羧酸[74]。 carbonyl基团的特定π → π*跃迁可以在大约190纳米的较短波长处观察到，涉及从π成键轨道到π*反键轨道的跃迁。n → π*跃迁是由于氧上的非键合电子向反键π轨道的跃迁。可能的n → σ*跃迁也可能涉及在高能区域从非键合（n）轨道到反键σ*轨道的电子转移，尤其是在产生具有非键合电子对的反应饱和醇分子后，特别是在苯环断裂后。这一过程需要苛刻的氧化条件，通常涉及自由基，然而，在粘土催化的臭氧化的酸性介质中，与BPA的光催化降解相比，这些自由基的贡献较小[75,76]。与此同时，275纳米带的强度增加比225纳米带更明显，从10分钟到30分钟都可以检测到。这一带归因于氧原子上的非键合电子向芳香环上的反键π*轨道的n → π*跃迁[77,78]。这表明了酚环的化学改性。在这里，羟基化可能是主要的改性。研究发现，环断裂和/或羟基化是生成儿茶酚、邻醌、黏酸、苯醌和2-(4-羟基苯基)-丙-2-醇的主要反应[79]。大多数BPA氧化中间体在这个光谱区域都有吸收。此外，所有含有羟基的衍生物都应该与水分子相互作用，导致在300-400纳米区域出现宽的肩峰，以及从水到OH基团的电荷转移跃迁，这在230纳米区域表现为高强度带。这不可避免地掩盖了母体分子紫外带的随时间减弱[59]。这是紫外-可见光谱法的一个主要限制，它仅限于定性评估臭氧化的进展，但可以提供BPA通过吸附去除的相对可靠的时间演变（见图S10）。使用高效液相色谱法对臭氧化过程中的BPA转化进行定量评估，能够准确评估吸附和臭氧化过程中的BPA去除情况（见图S11）。对于所有研究的粘土矿物，臭氧化的BPA去除率都高于单独的吸附（见图5）。这表明粘土表面在BPA氧化转化之前对其有捕获作用。吸附在催化臭氧化过程中的作用通过两种过程的BPA去除率成正比增加得到了证实，以及在NaMt催化的臭氧化后大约1分钟和用其他粘土催化剂后大约15分钟时，BPA的总去除率都有所提高。NaMt以及在较小程度上，膨润土在5分钟接触时间后显示出最高的保留率分别为100%，30分钟后约为85%（见图5）。图5通过HPLC-DAD评估了吸附（a）和臭氧化（b）的BPA去除率。V = 20毫升的纳米纯水或10^-4 M的BPA溶液在室温下；臭氧通量 = 600毫克/小时；Mt含量 = 40毫克（2克/升）。在Mt悬浮液的上清液中，在其初始内在pH值下测定BPA的剩余浓度。使用30/70（v/v）的水/乙腈梯度，在7.1分钟保留时间监测BPA的峰。使用30/70（v/v）的水/乙腈梯度，在7.1分钟保留时间监测BPA的HPLC-DAD峰。接触时间5-10分钟后达到平衡，CaMt、膨润土、KMt和Fe(II)Mt的最大吸附容量分别为72.26%、87%、66.96%和55.86%。Fe(II)Mt已经显示出非常相似的催化性能，包括吸附贡献[59]。这种完全的BPA降解在没有完全矿化的情况下发生，然而，在较高pH值下即使存在羟基自由基也似乎难以实现[80]。对于大多数双酚来说，氧化首先生成儿茶酚及其衍生物，然后形成邻醌中间体、环断裂产物和酚类衍生物[76,81,82,83]。像儿茶酚、丙酮、氢醌、甲醛、乙酸、甲酸、草酸等衍生物相对于未氧化的对应物具有更高的化学稳定性，这解释了它们在臭氧化30分钟后仍然存在的原因[84,85]。

3.5 吸附和臭氧化过程中的pH值变化
对于NaMt，BPA的吸附导致含有BPA的NaMt和膨润土悬浮液的初始内在pH值从8.18略微下降，在15-20分钟后降至7.40–7.16的稳定水平（见图6a）。所有其他Mt悬浮液在BPA吸附后的5分钟内，pH值从其各自的内在pH值上升到稳定水平：MgMt为7.04，CaMt为6.78，KMt为6.11–5.73，Fe(II)Mt为3.6。这一顺序对应于所研究的可交换阳离子的Lewis酸度和极化能力的增加，这决定了它们在水介质中的Bronsted酸度[86,87]。这一结果表明阳离子从水介质中被去除，可能是通过离子交换发生在脱质子化的硅醇和BPA分子上，以及通过其羟基的螯合作用，这与之前的说法一致（见图6）。图6显示了在存在粘土吸附剂/催化剂的情况下，吸附（a）和臭氧化（b）过程中的pH值变化。O3通量：600毫克/小时。样品体积：20毫升。BPA初始浓度：10^-4 M。粘土矿物含量：40毫克（2克/升）。相比之下，在臭氧化的最初1-10分钟内观察到pH值迅速下降（见图6b）。这很可能是由于酸性副产物的形成。此外，这一趋势伴随着pH值下降速率的明显减缓，可能是由于缓冲效应的增加。这种变化可能是由于在粘土表面进行离子交换时不可避免地释放Fe2+阳离子，这些阳离子不仅可以被脱质子化的BPA分子捕获，还可以被臭氧化产生的酸性物质中的羧基捕获。这一结果很重要，因为它表明BPA的吸附导致了特定的pH值变化，而这些变化又影响了臭氧化过程。

3.6 吸附/臭氧化后的上清液毒性
采用了一种综合的方法来评估控制吸附和臭氧化的参数的模拟效应和相互作用，以及这两种过程对它们的BPA混合物对Lemna minor毒性的影响。BPA是一种合成有机化合物，作为一种外源性化学物质，在其降解之前就对生物体的生长和代谢表现出内在毒性。各种吸附或臭氧化混合物的毒性在接触含有L. minor的SIS介质7天后进行了评估。初步分析结果显示，在大多数Mt吸附存在的情况下，接触吸附混合物后，含有L. minor的SIS介质的初始pH值（pH 6.5）显著升高（见图S12a）。这可以用植物从液体介质中吸收作为营养物质的阳离子来解释。由于在起始pH值为6.5时，碱性阳离子和碱土金属阳离子发生大量释放，因此膨润土引起的pH值升高更为显著。在L. minor暴露于吸附混合物7天后测得的最终pH值波动表明，阳离子在粘土矿物、BPA分子和植物样本之间发生了复杂的转移（见图S12b）。大约10分钟后，根据粘土矿物的情况，pH值稳定在6.8到7.25之间，这可能是由于BPA通过吸附逐渐被消耗所致。这一结果非常重要，因为它清楚地证明了BPA的固有毒性，其消耗导致植物叶片的比例和新鲜重量有轻微改善（见图S13和图7a）。图7显示了吸附混合物对植物样本比例（a）和Lemna minor新鲜重量（b）的影响，与空白样本（对照组）进行了比较。结果以相对于对照组样本（无BPA的SIS介质）的百分比表示。这些数据基于植物暴露7天后的三次测量平均值，包括对照组样本和吸附混合物的上清液。相比之下，臭氧化混合物在大约10分钟后导致pH值急剧下降，经过所谓的“诱导期”后，30分钟接触时间时pH值降至2.75–3.4（见图S14）。最终pH值的类似下降发生在20–25分钟时，这可以归因于酸性BPA衍生的形成。这可能是由于所研究的植物生物指示物最初受到了氧化应激。对获得的数据的初步分析显示，Lemna minor暴露于臭氧化混合物7天后，植物叶片和样本的比例以及新鲜重量显著且逐渐减少（见图S15）。臭氧化混合物对植物正常生长的这种有害影响包括：（i）酸性及潜在有毒衍生物的增加；（ii）通过粘土表面的离子交换以及去质子化BPA分子和中性BPA分子的螯合作用，导致SIS介质中阳离子分布的变化。MgMt和NaMt的影响最小，而在一定程度上CaMt也影响较小，因为它们是L. minor必需的营养素。Fe(II)Mt、膨润土和KMt的消耗最为明显。在吸附时间15分钟后，这三个生物标志物略有恢复，但与起始未改变的SIS介质相比仍然非常低。

正如预期的那样，在含有L. minor的SIS介质与吸附和臭氧化上清液接触后，活性氧（ROS）的产生也出现了波动。在BPA吸附Fe(II)Mt、膨润土和NaMt不超过5分钟的时间内，以及单独臭氧化BPA或在MgMt、NaMt和Fe(II)Mt存在的情况下，检测到较高的ROS水平（见图8a）。除了MgMt和一些Fe(II)Mt的波动外，吸附过程中ROS水平的整体和明显均匀的下降必须是由于BPA的逐渐去除及其相关毒性衰减所致（见图8）。这些数据基于植物暴露7天后的三次平均测量结果，包括对照组样本（不含BPA的SIS介质中的Lemna minor）和吸附或臭氧化混合物的上清液。T: 25 °C；O3流量：600 mg·h?1；样品体积：20 mL；BPA初始浓度：10?4 M；粘土矿物量：40 mg（2 g·L?1）。ROS水平高于对照组样本可能是由于一种“ hormesis”现象，即L. minor对臭氧化混合物在最初4–5分钟诱导的氧化应激的反应。后者可能是由（i）酸性及/或有毒物质的存在以及（ii）SIS介质中阳离子分布的变化引起的。在Mt催化的臭氧化过程中，ROS的波动似乎取决于蒙脱石的可交换阳离子，这应该决定了酸性及/或有毒物质的分布以及SIS介质的化学组成。在长时间吸附和臭氧化过程中，即在膨润土或NaMt存在的情况下，也观察到了ROS水平的恢复，即20–30分钟的吸附和30分钟的臭氧化（见图8）。这与吸附（见图7a）和臭氧化（见图7b）过程中植物生长的恢复一致。因此，显然BPA在有氧条件下的降解减少了其毒性，但在完全矿化为二氧化碳和各种氧化物之前仍对环境产生了不可避免的整体影响。这种对L. minor的诱导毒性体现在吸附过程中叶绿素a/b比率的增加，在臭氧化过程中这一效应更加明显，反映了其对Lemna minor光合作用效率的负面影响（见图9）。这种现象是由于叶绿素a的比例相对于叶绿素b的比例增加，同时根据吸附和臭氧化过程中可交换阳离子的不同，ROS水平也发生了波动。然而，总的色素含量仅在臭氧化过程中减少，可能是因为光合作用系统的不可逆改变（见图S16）。

接下来，应用了33个因子实验设计来模拟初始pH值、臭氧化时间和粘土矿物量的影响（表S3）。这些参数基于文献数据的综合分析和我们之前的一些工作，在一定范围内进行了变化。所得到的多项式回归方程能够描述BPA的吸附和臭氧化过程，以及L. minor的所有生长参数（表S4–S6）。通过t-Student检验和Fisher检验以及Snedecor表对这三个变量进行了验证，方差为2，置信水平为0.95（p < 0.05）（表S7）。对于（i）吸附和臭氧化过程以及（ii）L. minor的主要生物标志物，主要响应函数强烈依赖于所有三个参数的单独效应和相互作用（表S8–S10）。乍一看，大多数最佳值似乎都位于两种粘土矿物的无量纲参数[?1, 1]的设定变化范围内（表S11）。这证实了基于文献综合分析关于pH值对水悬浮液中Mt行为影响的合理选择，包括接近零电荷pH（pHZC）时的pH值、Fe2+沉淀pH值、硅醇的最低pKa值以及蒙脱石的临界胶束浓度[88,89]。这也表明了pH值和Mt量在BPA吸附、臭氧化及其诱导的毒性之间的相互依赖性。最佳响应函数的发生清楚地表明，NaMt和Fe(II)Mt都需要起始pH值的中间值，即大约pH 2.8（X1 = 0），接触时间大约15分钟（X2 = 0）以及粘土浓度约为2 g·L?1（X3 = 0），以实现最佳的BPA去除率和毒性参数。这本质上包括了释放到液体介质中的浸出阳离子的浓度、Zeta电位以及粘土颗粒大小的最佳值。这三个因素已知控制着粘土矿物的分散性和接触表面，这解释了吸附和臭氧化之间的强相关性，以及这两个过程与诱导的毒性之间的相关性。当将过程持续时间固定为15分钟（X2 = 0）时，初始pH值和粘土矿物浓度的影响更加明显。因此，消除这一参数的影响和相互作用可以更准确地预测响应曲线的预期形状（表S10）。有趣的是，ZP和PS的多项式模型在pH的二次项显示出相反的符号（NaMt为X1, ?1.96和3090.5；Fe(II)Mt为?7.64和4289.1）。这证实了在NaMt和Fe(II)Mt存在的情况下，最佳pH值分别为0.86和0.80以及0.80和0.10时，会导致ZP最大和PS最小（表S11）。所有这些值都高于中心水平X1 = 0，即当负电荷增加和Mt层间距增加时。这种现象在臭氧化过程中没有观察到，可能是由于BPA衍生物的竞争性相互作用所致。正如预期的那样，臭氧化的最大BPA转化对应于新鲜重量和叶绿素a/b比率的最低值，表明NaMt催化的臭氧化产生了比母体分子更有毒的衍生物。这与通过Fe(II)Mt催化的臭氧化导致新鲜重量和叶绿素a/b比率的最大值相一致。换句话说，在接近参数中心值的最佳条件下，Fe(II)Mt对L. minor的毒性似乎比NaMt要小。这两种粘土矿物的不同行为可能是由于液体介质的过度酸性，这是由于（i）Fe(II)Mt的酸性本质，有利于BPA的吸附；以及（ii）更活跃的粘土催化剂产生的过量酸性物质和更显著的臭氧化。这种过度酸性可能导致（i）通过浸出导致Fe2+的过度损失；（ii）与预测的Zeta电位最小值一致的粘土表面电荷的衰减；以及（iii）随着-Si-O基团转化为中性硅醇和催化活性的丧失。这里，所有马鞍形表面都表明了初始pH值和粘土矿物浓度的不同影响。这种现象解释了（i）Zeta电位和颗粒大小以及（ii）L. minor的各种生物标志物的相反影响。因此，这项研究解释了有机污染物在含粘土生态系统中氧化降解的命运和有害影响，这是本项工作的主要目的。

在钠交换蒙脱石（NaMt）的情况下，最大BPA转化发生在臭氧化过程中Zeta电位最大的条件下，同时Lemna minor的新鲜重量和叶绿素a/b比率最小，证实了有毒化合物的降解。这些最佳的降解条件和生态毒理学影响的减少始终伴随着粘土上BPA吸附的最小化。相比之下，对于Fe(II)Mt来说，确立这样的明显相关性更具挑战性。这种困难源于两个关键因素：首先，Fe2+ 的二价电荷促进了蒙脱石（Mt）与双酚A（BPA）之间的桥接作用，同时也可能促进了BPA分子之间的相互作用；其次，Fe2+ 的 inherent acidity（固有酸性）同时影响了表面电荷分布、吸附过程以及臭氧化途径。考虑到吸附是Mt催化臭氧化过程中不可避免的一个步骤，其对于催化剂效果的影响似乎难以评估，因为酸性物质的形成导致pH值下降，从而强烈改变了Mt的分散性和接触表面，进而影响了BPA与固体表面的相互作用。这些相互作用又直接影响了吸附和未吸附BPA分子的降解过程，而在每个pH值下，这些分子应该与衍生物的分布达到平衡。因此，只有综合考虑所有这些单个效应和相互作用，才能将BPA的氧化降解与对L. minor的毒性联系起来。目前针对这一方向的研究仍在进行中。进一步深入了解pH效应与粘土矿物浓度的影响，有望提供有关潜在阳离子转移和分散物质之间相互作用的宝贵数据，从而关联到所引起的毒性。

**结论**

这项综合研究有助于理解双酚A在含有粘土的自然介质中的命运及其潜在的生态毒性。研究结果表明，无论可交换阳离子如何，粘土矿物的存在都能显著增强双酚A的臭氧化降解过程。在吸附和臭氧化过程中，BPA的去除率会随着蒙脱石可交换阳离子的不同而变化。吸附和臭氧化过程中BPA去除率的波动显著影响了其对L. minor的毒性。最佳的粘土催化剂浓度和初始pH值可以实现最大的BPA降解率，同时将氧化应激和对植物生物指示剂的毒性降到最低。这些最佳条件会因存在的可交换阳离子类型而异。这些宝贵的发现有望根据自然宿主介质和化学成分预测有机酚类污染物的命运和环境影响。所获得的科学工具应有助于开发可持续的修复策略，为实现安全且基于粘土的水处理方法提供支持。

**补充材料**

以下支持信息可在此网址下载：**
https://www.mdpi.com/article/10.3390/environments13050263/s1

- 表S1：化学成分的变化（wt.%）
- 表S2：根据瑞典标准（SIS介质，一种专门设计用于支持水生植物Lemna minor生长的培养基）配方的Lemna minor生长介质组成
- 图S1：未经酸处理和在pH 1的酸性介质中浸泡30分钟后处理的NaMt的XRD峰形
- 图S2：在不同交换型蒙脱石上进行吸附时，BPA在275 nm (a) 和 225 nm (b) 处的相对吸光度变化
- 图S3：在不同交换型蒙脱石上进行吸附时，BPA在Nanopure水溶液中的UV-Vis光谱随时间的变化
- 图S4：在Nanopure水溶液中，吸附到NaMt吸附剂上时BPA的UV-Vis光谱随时间的变化（不同pH值）
- 图S5：在Nanopure水溶液中，吸附到Fe(II)Mt吸附剂上时BPA的UV-Vis光谱随时间的变化（不同pH值）
- 图S6：通过HPLC-DAD观察，在不同pH值的Nanopure水中，通过吸附到NaMt (a) 和 Fe(II)Mt (b) 上的BPA保留率受初始pH值的影响
- 图S7：在存在40 mg (2 g·L?1) NaMt (a) 和 Fe(II)Mt (b) 的情况下，通过HPLC-DAD评估不同pH值溶液中BPA的去除率
- 图S8：在Nanopure水溶液中，非催化臭氧化过程中BPA的UV-Vis光谱随时间的变化
- 图S9：在Nanopure水溶液中，粘土催化臭氧化过程中BPA的UV-Vis光谱随时间的变化
- 图S10：在Nanopure水溶液中，臭氧化过程中不同催化剂存在时225 nm (a) 和 275 nm (b) 波段的相对吸光度变化
- 图S11：在Nanopure水溶液中，初始pH值下，粘土催化剂添加对吸附（a）和臭氧化（b）过程中相对HPLC峰面积比（PA/PAo）变化的影响（室温）
- 图S12：在含有SIS介质的L. minor中加入BPA吸附上清液后初始pH值的变化（a），以及接触7天后的变化（b）
- 图S13：在不同阳离子交换型蒙脱石存在下，吸附（a）和臭氧化（b）过程中Lemna minor叶片比例的变化
- 图S14：在含有SIS介质的L. minor中加入BPA臭氧化上清液后初始pH值的变化（a），以及接触7天后的变化（b）
- 图S15：在不同催化剂存在下，臭氧化混合物对Lemna minor植物样本比例（a）和新鲜重量（b）的影响（与空白样本（Control）相比）
- 图S16：吸附（a）和臭氧化（b）过程中，叶绿素a和叶绿素b含量的变化
- 图S17：使用NaMt（a）和FeMt（b）进行臭氧化时BPA转化的响应表面形状，暴露于FeMt臭氧化上清液后的Lemna minor新鲜重量（c），以及NaMt存在下BPA臭氧化的ζ电位（d）（处理时间15分钟，X2 = 0）
- 表S3：T = 25 °C时33因子实验设计的参数水平和范围
- 表S4：BPA吸附后最终pH值、保留率、液体介质中释放的阳离子量、ζ电位和粒径的33因子实验设计
- 表S5：使用NaMt和Fe(II)Mt进行臭氧化后最终pH值、转化率、液体介质中释放的阳离子量、ζ电位和粒径的33因子实验设计
- 表S6：使用NaMt和Fe(II)Mt进行臭氧化或吸附后，通过45 μm过滤器过滤的Lemna minor生物标志物的33因子实验设计
- 表S7：不同模型的适用性测试和方差分析程序
- 表S8：在NaMt和Fe(II)Mt吸附后，某些L. minor生物指示物的多项式模型系数
- 表S9：NaMt和Fe(II)Mt催化BPA臭氧化后以及暴露于臭氧化混合物后的Lemna minor生物指示物的多项式模型系数
- 表S10：在NaMt和Fe(II)Mt存在下，吸附或臭氧化后Lemna minor生物指示物的多项式模型（包括X2 = 0时的情况）
- 表S11：使用NaMt和Fe(II)Mt进行吸附和臭氧化过程中某些响应函数的最佳参数