一种改进的用于HepG2和IM-9细胞质膜成像的SEM样品制备工作流程

《Bioengineering》：An Improved SEM Preparation Workflow for Plasma Membrane Imaging in HepG2 and IM-9 Cells Laura Manin, Antonio Castelliti, Elena Stuppia, Filippo Laganà, Salvatore A. Pullano and Marta Greco

　　

精确可视化质膜对于评估实验扰动引起的形态变化至关重要。扫描电子显微镜（SEM）能够对细胞表面结构进行高分辨率成像，但固定、脱水和干燥步骤严重影响膜的保存。在此，研究人员为两种具有不同生长表型的培养细胞模型（HepG2和IM-9）提出了一种改进的SEM制备工作流程，并评估了固定时间和干燥策略对质膜保存的影响。在所测试的条件中，较短的戊二醛固定时间（15分钟）结合逐步乙醇-六甲基二硅氮烷（HMDS）置换，在膜连续性、细胞形状和表面规则性的总体保存上提供了最佳效果。形态测量分析支持了定性的SEM观察结果，并且在测试条件下，经过HMDS处理的样品在储存期间也表现出更好的结构稳定性。该工作流程为培养细胞模型基于SEM的细胞表面形态学分析提供了一种简单、可重复且具有成本效益的策略。

研究解读

一、 研究背景、问题与目的

在细胞生物学和生物工程领域，对细胞表面形态的高精度观察是理解细胞功能、信号传导以及与外界环境相互作用的基础。扫描电子显微镜（SEM）是进行此类纳米级表面形貌观察的有力工具。然而，生物样品的SEM成像质量高度依赖于样品制备过程，特别是化学固定、脱水和干燥步骤。不当的制备会导致细胞收缩、起皱、膜塌陷等假象，从而扭曲对质膜（Plasma Membrane）真实形态的观察。尽管临界点干燥（CPD）被视为避免表面张力损伤的金标准，但其设备昂贵、流程复杂，限制了广泛应用。另一种常用的化学干燥剂六甲基二硅氮烷（HMDS）虽简便，但多数现有方案采用从无水乙醇直接替换为100% HMDS的粗暴方式，可能对细胞膜造成机械应力。同时，固定时间作为影响醛类交联程度和膜弹性的关键参数，在针对质膜保存的优化研究中常被忽视。因此，针对不同生长类型（贴壁与悬浮）的细胞，开发并评估一种简单、有效且可重复的SEM样品制备工作流程，以最佳化质膜超微结构的保存，具有重要的实际应用价值。

二、 关键技术方法

本研究以人肝癌HepG2（贴壁细胞）和人B淋巴细胞IM-9（悬浮细胞）为模型。研究核心在于比较两种戊二醛固定时间（30分钟与15分钟，均在4°C下）与两种干燥方法（空气干燥 与 逐步乙醇-HMDS置换干燥）对细胞质膜保存效果的影响。具体工作流程包括：细胞培养与收集、2%戊二醛固定、PBS缓冲液洗涤、系列梯度乙醇脱水（30%, 50%, 70%, 90%, 100%），随后进行空气干燥或HMDS逐步置换干燥。干燥后的样品被转移至导电碳胶带上，使用ZEISS EVO扫描电镜在5 kV加速电压、可变压力模式下进行成像，样品未进行导电镀膜。形态测量学分析通过ImageJ软件进行，测量参数包括细胞投影面积、圆形度、实心度及边界不规则指数（BII），并对数据进行了统计学检验。

三、 研究结果

3.1. 固定时间对膜保存的影响

通过比较两种固定时间，研究发现，缩短戊二醛固定时间至15分钟与30分钟固定相比，能带来更好的结构保存。SEM成像显示，固定15分钟的样品具有更好的整体膜保存效果、更少的表面假象和更均一的形态。这可能是由于缩短反应时间在稳定膜蛋白的同时，减少了过度交联或戊二醛聚合物形成，从而保持了膜在后续脱水干燥步骤中的柔韧性。该15分钟固定方案同样适用于悬浮细胞模型IM-9，为其提供了可用于比较干燥策略的形态学基础。

3.2. 质膜保存的形态测量学分析

为量化形态差异，研究对细胞进行了形态测量。在HepG2细胞中，HMDS-SS 15（15分钟固定结合逐步HMDS干燥）条件下的细胞表现出显著更大的面积、更高的圆形度和实心度，以及更低的边界不规则指数。在IM-9细胞中，逐步HMDS干燥也显著优于空气干燥，显示出更高的面积、圆形度、实心度和更低的边界不规则指数。这些定量结果与SEM的定性观察一致，证实了HMDS干燥，特别是在15分钟固定条件下，能带来更佳的形态学保存。

3.3. 干燥策略对超微结构保存的影响

研究对比了空气干燥和HMDS化学干燥的效果。空气干燥的样品表现出明显的膜塌陷、表面起皱、细胞体局部扁平化以及微绒毛等精细结构的丢失，这主要归因于乙醇蒸发时产生的高表面张力引起的强大毛细管力。相比之下，HMDS具有更低的表面张力和更高的蒸汽压，其逐步置换乙醇的过程减少了界面应力，使蒸发过程更温和，从而更好地保持了质膜的纳米级特征和连续性。因此，HMDS干燥在减轻干燥相关假象方面效果显著。

3.4. 制备样品的长期稳定性

为评估制备方案的稳健性，研究观察了样品在4°C下储存4个月后的形态。结果显示，HMDS干燥的细胞即使长期储存后，仍能保持更紧凑、连续的形态，而空气干燥的样品则表现出明显的结构塌陷和形态改变。这表明HMDS处理不仅改善了即时成像效果，还增强了样品在储存期间的结构稳定性。

3.5. 与现有SEM制备方法的比较

研究通过与文献中常用方法（如长时间固定、空气干燥、CPD等）对比，突出了所开发工作流程的优势。该方案整合了短时间固定与可控的HMDS干燥，避免了使用四氧化锇（OsO₄）后固定和昂贵的CPD设备，为两种细胞模型（贴壁和悬浮）提供了一种简单、低成本、可重复的SEM制备策略。

四、 研究讨论与结论

本研究开发并评估了一种用于培养细胞扫描电子显微镜（SEM）制备的改进工作流程，重点在于保存质膜超微结构。通过评估固定时间和干燥策略，研究证明较短的戊二醛固定时间（15分钟）结合逐步乙醇-HMDS置换，与更长的固定时间和空气干燥方法相比，能提供更优的形态学保存。所评估的方案改善了膜连续性，减少了表面假象，并增强了结构稳定性，这得到了定性SEM观察和定量形态测量分析的共同证实。重要的是，该工作流程成功应用于贴壁（HepG2）和悬浮（IM-9）两种细胞模型，表明其适用于不同的细胞结构。所提出的方法代表了一种简单、经济高效且可重复的替代方案，可替代那些需要临界点干燥系统等专业设备的制备方法。此外，改善的膜特征保存和长期的样品稳定性凸显了其在需要精确可视化细胞表面形态学研究中的潜在效用。总体而言，该工作流程为培养细胞的高质量SEM成像提供了一种实用且易于实施的策略，可能有助于在细胞生物学、生物工程及相关领域进行更可靠的形态学分析。