基于S/MAR表位载体与tRNA-sgRNA阵列技术的无转基因多基因CRISPR/Cas9编辑系统在猪细胞中的应用

《Biology》：An Episomal Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9 System for Transgene-Free Multiplex Gene Editing in Pig Cells Chaoqian Jiang, Dongyan Yang, Chengbo Sun, Xingrui Ren, Tianze Li, Jiayan Wu, Jian Tian, Mingjie Feng, Yuchang Yao and Yanshuang Mu + 2 authors

　　

尽管基因组编辑技术在过去十年中取得了显著进展，但在原代细胞中实现多个基因的同步CRISPR/Cas9基因组编辑仍然是一个主要挑战。在此项研究中，研究人员开发并构建了一种整合了表位（Episomal）载体与tRNA–sgRNA阵列技术的CRISPR多基因靶向系统。该方法利用支架/基质附着区（Scaffold/Matrix Attachment Region, S/MAR）序列，实现了Cas9和单引导RNA（single-guide RNAs, sgRNAs）在宿主基因组外的持续表位表达，从而避免基因组整合并提高基因编辑效率。为了同时编辑多个位点，研究人员采用了tRNA–sgRNA架构，从单一载体中加工出多个sgRNA。该系统在猪胎儿成纤维细胞（Porcine Fetal Fibroblasts, PFFs）中实现了单个细胞内六个基因（即ANXA7、GSK3A、ENTPD6、SIRT3、CYP20A1和SOCS2）的同步编辑。这些经过编辑的细胞在用于胚胎重构时保留了正常的发育能力。总体而言，本研究为生成具有多重精确遗传修饰的动物提供了一种高效且可靠的方法，在生物医学研究和农业领域具有潜在的应用价值。

该论文题为《基于S/MAR表位载体与tRNA-sgRNA阵列技术的无转基因多基因CRISPR/Cas9编辑系统在猪细胞中的应用》，由Chaoqian Jiang、Dongyan Yang等研究人员完成，发表于《Biology》期刊。论文针对当前猪基因工程领域在原代细胞中难以实现高效多重基因编辑的瓶颈，提出了一种结合非整合DNA载体与单一构建体生成多向导分子的基因编辑策略，旨在解决传统方法中因多次克隆导致的表观遗传异常及效率低下问题。

研究背景指出，基因编辑猪在农业和生物医学中具有巨大潜力，但现有的通过体细胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transfer, SCNT）生产多基因编辑猪的策略通常需要多轮克隆，过程繁琐且易导致表观遗传异常。虽然理论上可以通过CRISPR系统结合多个向导RNA（guide RNA, gRNA）实现多重编辑，但受限于递送方法和质粒载体容量，同时递送大量sgRNA至猪胎儿成纤维细胞（PFFs）仍具挑战。此外，传统递送系统存在载体组件意外整合到基因组中的风险。为此，研究人员开发了GTR-CRISPR系统，该系统融合了tRNA–sgRNA阵列技术与基于支架/基质附着区（S/MAR）的表位载体技术，以实现在猪基因组中无外源基因整合的高效多重修饰。

关键技术方法包括：构建包含sgRNA表达单元、Cas9编码序列、S/MAR元件及G418抗性盒的pCas9GS表位靶向载体；设计针对六个目标基因（SOCS2、ENTPD6、GSK3A、SIRT3、ANXA7和CYP20A1）的sgRNA；利用tRNA–sgRNA阵列技术将多个sgRNA串联构建pCas9GS-6sg载体；通过电穿孔法转染原代猪胎儿成纤维细胞（PFFs）；采用质粒拯救实验验证S/MAR载体的表位维持特性；以及利用体细胞核移植（SCNT）技术评估编辑细胞的发育能力。

研究结果分为四个部分：

1. 1.
   利用S/MAR基表位靶向载体建立用于多基因编辑的tRNA–sgRNA阵列系统：研究人员成功构建了pCas9GS重组载体，并通过转染PFFs验证了其对六个单基因的编辑效率，结果显示ANXA7和SOCS2的编辑效率分别达到71.4%和70%，证明了载体的有效性。
2. 2.
   S/MAR包含的非病毒载体在猪成纤维细胞中的表位持久性：通过比较含S/MAR与不含S/MAR的载体，发现S/MAR组在转染后48小时和96小时的绿色荧光细胞数量显著更高。质粒拯救实验进一步证实，含有S/MAR的质粒能在细胞内以游离状态存在至少14天，表明其具有持续的表位维持能力。
3. 3.
   结合表位CRISPR/Cas9系统与tRNA–sgRNA阵列在PFFs中实现多基因敲除：利用tRNA–sgRNA阵列技术构建的pCas9GS-6sg载体，成功在PFFs中实现了六个基因的同步敲除，编辑效率分别为：SOCS2（40%）、SIRT3（6%）、GSK3A（5%）、CYP20A1（16.6%）、ANXA7（33.3%）和ENTPD6（1.06%）。
4. 4.
   利用表位CRISPR/Cas9系统在单细胞克隆中同步敲除六个基因：将转染pCas9GS-6sg的PFFs用作SCNT的供体细胞，产生的囊胚发育率与对照组无显著差异。对单个囊胚的基因型分析显示，39.09%的阳性克隆实现了2个基因的同时编辑，28.2%为3个基因，19.09%为4个基因，9.09%为5个基因，另有9.09%的克隆实现了全部六个目标基因的同步编辑。

讨论部分强调，该研究提出的基于S/MAR表位载体与tRNA-gRNA阵列的多重CRISPR/Cas9编辑系统，有效克服了传统方法在PFFs中进行多基因编辑的限制。尽管不同靶点的编辑效率存在差异，这主要受染色质可及性和局部基因组环境等位点特异性因素影响，但该平台成功展示了单次编辑即可获得携带多基因修饰的细胞及胚胎的可行性。与以往将S/MAR载体用于递送治疗性转基因的研究不同，本研究创新性地将其作为促进基因编辑的工具，拓展了表位载体技术在基因组工程中的应用范围。

结论部分总结道，所述的表位多基因CRISPR编辑载体能够同步表达六个sgRNA，并在PFFs中诱导ANXA7、GSK3A、ENTPD6、SIRT3、CYP20A1和SOCS2编码区的靶向破坏。这种基于表位载体多基因编辑系统的方法仅需转染一个载体即可实现多基因编辑，简化了流程并提高了猪CRISPR/Cas9多基因编辑的效率。展望未来，这种基于表位载体与tRNA–sgRNA系统相结合的策略有望在猪模型及其他物种的多重基因组工程中广泛应用。