单核细胞来源的巨噬细胞通过线粒体活性氧驱动神经系统组织损伤

《Science Immunology》：Monocyte-derived macrophages drive neurological tissue damage through mitochondrial reactive oxygen species

　　

单核细胞吞噬细胞（mononuclear phagocytes, MPs）产生的活性氧（reactive oxygen species, ROS）被广泛认为是多发性硬化（multiple sclerosis, MS）中组织损伤的核心驱动因素，但中枢神经系统（central nervous system, CNS）驻留型与浸润型MPs在介导氧化性神经元损伤中的特异性作用尚未明确。本研究结合单细胞谱系分析（single-cell profiling）与条件性基因靶向技术，在MS临床前小鼠模型中系统解析并调控了CNS MPs的ROS生成模式。研究结果显示，相较于小胶质细胞（microglia, Mglia），单核细胞来源的巨噬细胞（monocyte-derived macrophages, MdMs）表现出更高的氧化应激基因特征评分，且产生更多ROS。研究挑战了既往认知，证实吞噬细胞NADPH氧化酶2（NADPH oxidase 2, NOX2）活性对ROS生成及疾病严重程度无决定性作用。相反，由MdMs而非Mglia产生的线粒体ROS（mitochondrial ROS, mtROS）驱动了急性神经炎症，并发挥直接神经毒性效应。这些发现明确了MdMs是神经炎症期间氧化性组织损伤的主要驱动者。

研究背景与意义

多发性硬化（MS）是全球最常见的慢性炎性脱髓鞘性中枢神经系统（CNS）疾病，影响着近300万人。该病的核心病理特征是自身反应性T细胞启动后，吞噬细胞与反应性胶质细胞、炎症介质及神经内源性易损因子共同介导的组织损伤，最终进展为神经退行性变与严重神经功能障碍。氧化应激被认为是连接炎症与神经退行性变的关键环节，在MS患者及临床前动物模型中，氧化应激水平与CNS组织损伤呈强相关性——过量的活性氧/氮物种（ROS/RNS）会导致脂质过氧化、蛋白质硝基化及核酸氧化，进而破坏髓鞘膜、损伤线粒体功能，触发少突胶质细胞损伤与轴突变性。既往研究已证实降低ROS水平可缓解MS模型小鼠的疾病严重程度，因此靶向ROS生成或增强抗氧化活性被视为极具潜力的治疗策略。然而，CNS驻留的小胶质细胞（Mglia）与浸润的单核细胞来源的巨噬细胞（MdMs）在ROS生成与氧化性损伤中的细胞类型特异性贡献长期存在争议，且吞噬细胞ROS是否通过调控细胞固有生物学功能参与病理进程亦未明确。该研究发表于《Science Immunology》，通过高分辨率单细胞分析与条件性基因靶向技术，首次明确了MdMs是神经炎症中ROS介导组织损伤的核心驱动者，为MS的精准治疗提供了新的靶点方向。

主要关键技术方法

研究整合了5项已发表的人类MS死后脑组织单核RNA测序（snRNA-seq）数据集，以及3项小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE，MS经典临床前模型）CNS免疫细胞单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集，通过Harmony整合消除批次效应，利用Louvain算法聚类并结合经典标记基因手动注释细胞亚群。采用流式细胞术结合二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFDA）、MitoSOX探针分别检测细胞总ROS与线粒体ROS（mtROS）水平。运用两种他莫昔芬诱导型Cre-loxP系统：Ccr2^CreERT2特异性靶向单核细胞及其衍生的MdMs，Cx3cr1^CreER特异性靶向驻留Mglia与边界相关巨噬细胞（BAMs）。构建混合骨髓嵌合体模型，实现野生型与mCAT（线粒体靶向过氧化氢酶）表达巨噬细胞的同环境对比。通过bulk RNA测序分析mCAT表达MdMs的转录组变化，结合神经元-胶质细胞共培养体系评估MdMs的直接神经毒性。所有EAE实验均设置同窝 littermate对照，临床评分采用盲法评估。

研究结果

MS is associated with a high ROS signature in damage-associated MPs

研究人员首先对人类MS脑组织免疫细胞的snRNA-seq数据进行整合分析，发现MS患者MPs的平均ROS模块评分显著高于对照组，且在慢性活动性与非活动性白质病变区域升高最为显著。进一步亚群分析显示，疾病相关MPs（DA-MPs，包含活化的Mglia与MdMs）的ROS特征评分高于稳态MPs（hMPs）。在可区分Mglia、疾病相关小胶质细胞（DAMs）与MdMs的独立数据集中，MdMs与DAMs的ROS相关基因表达均高于稳态Mglia，证实人类MS病灶中MPs存在显著的氧化应激激活。

MdMs are the dominant ROS-producing MPs in preclinical neuroinflammation

对小鼠EAE模型的scRNA-seq数据重分析显示，MdMs的ROS模块评分显著高于DAMs与稳态Mglia，且该差异在疾病始发期、高峰期及慢性期持续存在。流式细胞术功能验证进一步证实，MdMs的ROS生成水平是Mglia的5倍以上，且在EAE不同阶段均维持这一优势。免疫荧光染色显示，硝基酪氨酸（3NT，蛋白硝基化标志物）沉积主要富集于MdMs浸润的白质区域，直接证明MdMs是神经炎症中ROS的主要来源。

Cybb deletion in CNS MPs does not affect neuroinflammation

既往认为吞噬细胞主要通过NOX2（由Cybb基因编码）产生ROS，且Cybb缺陷小鼠EAE症状减轻。但本研究发现，无论是特异性敲除MdMs、Mglia还是同时敲除两类细胞的Cybb，均未降低细胞ROS水平，也未改善EAE的临床严重程度与CNS免疫细胞浸润。流式验证证实Cybb缺失不影响ROS生成，提示NOX2并非神经炎症中MPs ROS生成的主导途径，其功能可被其他ROS生成机制代偿。

Mglia play a redundant role in mtROS-mediated tissue damage

转录组分析显示，人类MS与小鼠EAE中，MdMs的线粒体复合物I（mtCI）与复合物III（mtCIII）基因模块评分均显著高于Mglia。流式检测证实MdMs的mtROS生成水平更高。特异性在Mglia中过表达线粒体靶向过氧化氢酶（mCAT，可降低mtROS）虽能有效减少Mglia的mtROS与总ROS，但对EAE疾病严重程度、CNS免疫细胞浸润、髓鞘完整性及轴突损伤均无影响，表明Mglia来源的mtROS在急性神经炎症中为冗余致病因素。

Reduction of mtROS in MdMs ameliorates neuroinflammation

特异性在MdMs中过表达mCAT可显著降低其mtROS与总ROS水平，但不改变MdMs的线粒体膜电位、核心表面标记物表达及CNS浸润数量。该干预可显著缓解EAE的临床严重程度，减少脊髓脱髓鞘与神经轴突损伤。即使在过继转移EAE模型（绕过外周T细胞 priming）中，MdMs特异性mCAT表达仍可有效改善疾病表型，证实靶向MdMs的mtROS是缓解神经炎症的有效策略。

MdM-derived mtROS drive neurotoxicity

混合骨髓嵌合体转录组分析显示，mCAT表达的MdMs中氧化磷酸化（OXPHOS）通路与线粒体呼吸链组分表达下调，但抗原提呈、吞噬作用、趋化因子/细胞因子分泌等核心巨噬细胞功能未受影响。神经元共培养实验证实，MdMs的神经毒性显著高于Mglia，而mCAT表达的MdMs或经N-乙酰半胱氨酸（NAC，谷胱甘肽前体）处理的MdMs神经毒性显著降低，直接证明MdMs来源的mtROS是其发挥直接神经毒性的核心效应分子。

讨论与结论总结

该研究解决了神经炎症领域长期存在的争议：既往普遍认为驻留Mglia是ROS介导组织损伤的主要来源，而本研究通过高分辨率细胞分型与条件性靶向技术，明确骨髓来源的MdMs才是mtROS依赖的神经损伤核心驱动者。研究同时推翻了NOX2是吞噬细胞致病性ROS主要来源的传统认知，证实mtROS的核心致病作用。尽管单独靶向Mglia mtROS无治疗效果，但同时靶向Mglia与MdMs的mtROS可产生协同获益，这与既往研究结论一致。研究的局限性在于未能完全排除微量gp91phox蛋白残留的影响，且Mglia来源的ROS可能在慢性或隐匿性进展型疾病阶段发挥作用，未来需在人类MS病灶中验证mtROS阳性MdMs的空间分布特征。该研究为MS治疗提供了全新方向：靶向MdMs的mtROS生成或线粒体代谢通路，有望成为阻断氧化组织损伤、延缓疾病进展的精准策略。