中国新疆库尔勒香梨上Cacopsylla chinensis作为Erwinia amylovora潜在传播体的系统特征分析 袁玉琳、 何哲、 王鲁伟、 刘鑫璐、 刘珍雅、 李亚鹏、 刘慧敏、 张文斌

《Insects》：Systematic Characterization of Cacopsylla chinensis as a Potential Vector of Erwinia amylovora on Korla Fragrant Pear in Xinjiang, China Yulin Yuan, Zhe He, Luwei Wang, Xinlu Liu, Zhenya Liu, Yapeng Li, Huimin Liu and Wangbin Zhang

　　**简单摘要**
梨火疫病是一种破坏性细菌性疾病，会危害梨树及相关果树作物，给果农带来严重的经济损失。虽然这种疾病已知可以通过昆虫传播，但过去的大多数研究仅关注了如蜜蜂这样的传粉者，而对中国梨木虱——最常见的梨树害虫——关注甚少。长期以来，人们一直不清楚这种木虱是否能够传播导致梨火疫病的细菌。在这项研究中，我们探讨了木虱如何携带致病细菌，以及这种昆虫和细菌如何共同损害梨树。我们发现，木虱在其所有生命阶段和身体部位都能携带细菌；昆虫体内的细菌毒力显著更高（p < 0.05），尤其是在消化系统和雌性生殖器官中。这项研究提供了证据，证明中国梨木虱是中国新疆地区梨火疫病细菌的主要携带者。我们的发现为精准的害虫和疾病控制提供了科学依据，有助于保护梨树作物并保障果农的生计。

**摘要**
梨火疫病由细菌Erwinia amylovora引起，是一种危害蔷薇科植物的破坏性疾病。尽管昆虫传播机制已有充分记录，但大多数研究都集中在传粉者身上，对木虱的关注较少。中国梨木虱（Cacopsylla chinensis）是梨树的主要刺吸害虫，其在Erwinia amylovora传播中的作用仍不清楚。本研究调查了E. amylovora在C. chinensis体内的分布情况及其协同致病机制（即C. chinensis通过刺吸为病原菌创造入侵伤口和营养丰富的环境，而病原菌则增强载体的适应性以促进疾病传播）。田间和实验室实验均证实了这种协同作用的存在。从C. chinensis的所有生命阶段和身体部位都分离出了E. amylovora，其中体内携带的病原菌数量和毒力显著高于体外携带的。具体而言，若虫体内的病原菌数量明显高于成虫，来自消化系统和雌性生殖器官的菌株在接种后7天对梨叶造成的病害指数比体表菌株高3至9倍。这项研究为新疆地区梨火疫病的精准管理提供了理论基础。

**1. 引言**
库尔勒梨（Pyrus sinkiangensis Yü）是中国新疆特有的果树，具有重要的经济价值[1]。梨火疫病是影响库尔勒梨的主要疾病之一，对当地梨产业的发展构成了严重威胁[2]。Erwinia amylovora是该病的致病菌，可感染蔷薇科植物的花、叶、枝条和树干，导致受感染组织呈现黑色烧焦状，类似火灾造成的损伤[3]。此外，该病原菌还会导致果实畸形或腐烂，大幅降低库尔勒梨的产量和质量[4]。Erwinia amylovora的传播途径多种多样，包括自然因素（风、雨和昆虫媒介）以及人为活动[4,5]。值得注意的是，昆虫取食造成的机械性伤口会显著增加病原菌的感染概率[6,7,8,9]。昆虫的入侵对植物病害的爆发有显著影响[10,11,12]。植物病原体进化出了多种传播策略，包括利用昆虫作为媒介以适应不良环境[13]。在昆虫取食过程中，大量病原体会侵入昆虫体内并依赖昆虫生存[14]。这一过程通常会引起昆虫的形态、生理或行为变化，从而促进病原体的生长和繁殖[15]。许多植物病原体能够在昆虫体内存活并传播，例如蚜虫和木虱可以通过循环传带来将病原体传播给健康宿主[11,16,17]。
昆虫介导的植物病原体的致病性是植物病学中控制病害流行的关键因素[18]。然而，并非所有在昆虫体内定植的病原体都能在其宿主体内引发疾病。例如，Candidatus Liberibacter asiaticus（柑橘黄龙病的致病菌）可以在粉虱的多种内部和外部组织中稳定存在，但会失去致病性[19]。先前的研究表明，Erwinia amylovora可以被多种昆虫携带并保持致病性。例如，蜜蜂可以在体表携带该病原体并将其传播给植物[20]；地中海果蝇（Ceratitis capitata）可以在体内和体表同时携带该病原体并保持其致病性[21]；黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）可以从污泥中获取该病原体并通过取食进行传播[22]。C. chinensis是新疆库尔勒香梨 orchards 的主要害虫，并已被证实可以携带E. amylovora[23]，但不同携带方式（外部附着和内部定植）对病原体生物学特性及后续致病性的影响尚不清楚。现有研究多关注E. amylovora对其昆虫媒介的影响，而忽视了病原体在这种独特生态环境下的适应性变化。因此，本研究旨在：(1) 明确C. chinensis在不同生命阶段（若虫与成虫）和携带方式（内部定植与外部附着）下的病原体携带能力；(2) 比较从C. chinensis不同组织和器官分离出的E. amylovora菌株的致病性差异；(3) 揭示C. chinensis与E. amylovora对库尔勒香梨的协同损害机制。这项工作对于阐明梨火疫病的传播机制和制定针对性防控策略具有重要意义。具体提出了三个可验证的假设：(1) E. amylovora可以在C. chinensis的所有生命阶段同时定植于其内部组织和外部表面；(2) 内部定植的E. amylovora具有更高的繁殖能力和毒力；(3) 来自C. chinensis不同器官的E. amylovora菌株因组织特异性微环境选择而表现出致病性差异。

**2. 材料与方法**
**2.1. 样本采集与处理**
为了评估C. chinensis携带E. amylovora的能力，2024年6月至9月期间在塔里木大学附属的库尔勒梨园（40°3′29′′ N, 81°17′32′′ E）进行了野外调查和样本采集。通过将1.5 mL离心管倒置在叶片上来捕捉静止的成虫C. chinensis，同时使用密封袋收集带有C. chinensis若虫和疑似梨火疫病症状的叶片。采集后，所有样本均通过PCR扩增和细菌分离培养进行E. amylovora的定性检测。另外，收集的叶片在人工气候箱（GXZ-436B，宁波凯盛实验仪器有限公司，宁波）中以28°C和相对湿度65% ± 5%的条件培养。

**2.2. 昆虫及其饲养条件**
携带E. amylovora的C. chinensis个体来自塔里木大学的库尔勒梨园，其中宿主植物为受E. amylovora感染的15–20年生梨树。无E. amylovora的C. chinensis样本则来自陕西省咸阳市的梨园（该地区非E. amylovora流行区）。所有样本均通过物种特异性PCR检测确认不含E. amylovora（34°32′39′′ N, 107°17′10′′ E）。携带和不含E. amylovora的C. chinensis分别接种到网状笼中的健康梨树上。所有昆虫都在受控条件下饲养：光照周期为12小时光照：12小时黑暗（12L:12D），温度为25°C ± 1°C，相对湿度为65% ± 5%。使用温湿度计（LYWSD02MMC，北京小米科技有限公司，北京）持续监测温度和湿度。

**2.3. E. amylovora DNA提取与PCR扩增**
收集的成虫和若虫C. chinensis个体先用无菌水冲洗，然后使用细菌基因组DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech，北京）提取基因组DNA。提取的DNA储存于-20°C备用。基因组DNA扩增使用特定引物RS24580-205F/R[24]和优化后的PCR程序进行：95°C预变性5分钟；35个循环：95°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒；最后72°C延伸10分钟。用于鉴定E. amylovora菌株的六个菌株（Y-1, RN, RW, CN, CW, ML）分别来自C. chinensis的内部/外部表面和梨叶，以及一个阳性对照株（LHY）（共7个菌株）。使用无菌水作为阴性对照，确认的致病菌株LHY作为阳性对照。每个PCR反应重复三次以确保结果可靠性。使用引物RS24580-205F/R[24]扩增后，得到约205 bp的目标基因片段，确认这些菌株属于欧洲株系的E. amylovora。所有PCR反应均重复三次。为防止污染，所有PCR试剂均在无菌生物安全柜中制备，并使用带滤头的专用移液器进行操作。每项PCR反应均包含三个技术重复。

**2.4. C. chinensis携带的E. amylovora分离**
细菌分离采用Mollaei SN等人的方法进行改进[25]：(1) 将昆虫样本表面的消毒时间从30秒缩短至5秒以保留活菌；(2) 消毒后添加三次无菌水冲洗，并将最终冲洗液接种于LB培养基上以验证彻底消毒；(3) 将连续稀释倍数扩展至10^-1–10^-7以改善单菌落分离效果。样本来自受梨火疫病影响的库尔勒香梨园。E. amylovora从C. chinensis（成虫和若虫）的外部表面和内部组织及病果叶片中分离出来。简要流程如下：清洗后的C. chinensis成虫和若虫用0.5%次氯酸钠消毒5秒，再用无菌水冲洗三次，然后研磨成匀质液。准备了五种类型的样本用于细菌分离：两种内部组织样本（成虫匀质液、若虫匀质液）、两种外部表面样本（昆虫冲洗液、具有协同症状的野外采集叶片浸泡液）以及一种蜜露样本（若虫分泌的蜜露），这些样本分别梯度稀释至10^-1–10^-7。每种稀释液涂布于LB固体培养基上，并在恒温培养箱中培养。

**2.5. 来源不同的E. amylovora菌株CFU计数比较**
为了量化C. chinensis内部和外部携带的E. amylovora的数量，将不同来源的纯化菌株分别接种于LB液体培养基中摇匀12小时。每种细菌悬浮液的OD600值用无菌水调整至1.0以制备标准溶液。为了便于移液，将标准溶液用移液器转移至2 mL无菌离心管中。随后，依次编号九个新的2 mL无菌离心管，每个管中加入900 μL无菌PBS缓冲液。从标准溶液中取100 μL移液至其中一个管中，得到1 mL细菌悬浮液。通过涡旋混合制备第一个稀释梯度（10^-1）。然后，将100 μL的10^-1稀释液进一步梯度稀释至10^-5、10^-6和10^-7。此梯度稀释方法适用于所有来源的菌株。每种稀释液的100 μL样品均匀涂布于NSA培养基（Nutrient Sucrose Agar, PM 7/20 (3) Erwinia amylovora; EPPO Bulletin）表面。每个稀释梯度重复三次。接种后的培养皿被放置在温度为28°C、相对湿度为65%±5%的细菌培养箱中进行培养。培养48小时后，对每个稀释梯度的三个生物学重复样本进行了菌落形成单位（CFU）的计数。计数工作由两名独立的研究人员以双盲方式进行，最终计算CFU时使用了含有30–300个菌落的培养皿。两名研究人员的平均计数结果用于后续的统计分析。数据使用IBM SPSS Statistics 20.0软件进行了单因素方差分析（ANOVA），并利用Tukey’s HSD检验进行了多重比较。差异在p < 0.05时被认为具有统计学意义。

2.6. C. chinensis携带的E. amylovora菌株的致病性比较
为了模拟C. chinensis内部和外部携带的E. amylovora菌株的自然生长环境，将第2.5节中准备的每个样本（成虫匀浆液、若虫匀浆液、成虫/若虫冲洗液、若虫分泌的蜜露以及田间采集并出现协同病害症状的叶片浸泡液）各取1 mL接种到LB液体培养基中并进行摇动培养。培养12小时后，吸取10 mL细菌悬浮液并在5000 rpm下离心5分钟。弃去上清液，将沉淀物用无菌PBS缓冲液洗涤三次，然后重新悬浮在PBS缓冲液中以调整OD600值至1.0。收集了Korla芳香梨的嫩枝、健康叶片和果实。将来自不同来源的OD600 = 1.0的细菌悬浮液各取100 μL使用1 mL注射器接种到相应的梨组织中。每个菌株在三个独立的生物学组中进行测试，每组有10个生物学重复样本（独立的梨组织样本）。所有接种的梨组织通过随机数表随机分配到不同的处理组中，并且每天随机调整每个样本在人工气候室中的位置以避免位置效应。接种后的叶片、枝条和幼果在温度为28°C、相对湿度为65%±5%的人工气候室中培养。接种后，每24小时记录一次枝条、叶片和果实的病害指数。病害指数的评估基于Paprstein等人的改良方法[26]，详细的改良标准见补充表S2。病害指数和发病率数据使用重复测量ANOVA进行分析，并使用Tukey’s HSD检验进行多重比较（p < 0.05），具体方法见第2.8节（统计分析）。

2.7. 系统发育树的构建与分析
扩增的PCR产物被送到上海桑贡生物技术有限公司（中国上海）进行Sanger测序。获得的序列被提交到GenBank数据库进行序列比对，并从同一数据库下载了密切相关的物种的序列。系统发育分析通过MEGA 11软件的Neighbor-Joining（NJ）方法进行，使用了1000次自助法重复以评估节点的稳定性。每个测序序列的登录号已在GenBank中申请。参与系统发育分析的序列的详细信息见补充表S3。

2.8. 统计分析
所有统计分析均使用SPSS 20.0软件（IBM公司，美国纽约阿蒙克）进行，图表绘制使用GraphPad Prism 9.0软件（GraphPad软件公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥）。对于CFU计数数据，使用单因素ANOVA比较各组间的差异，然后使用Tukey’s HSD检验进行多重成对比较，显著性阈值设定为p < 0.05。对于多个时间点收集的病害指数和发病率数据，进行了重复测量ANOVA分析。使用Tukey’s HSD检验进行各时间点之间的多重比较（p < 0.05）。对于系统发育分析，基于1000次重复计算自助值以评估树节点的稳健性。在整个研究中，生物学重复样本定义为使用不同批次的昆虫和植物材料进行的独立实验，而技术重复样本定义为同一样本的重复测量。所有实验至少包括三个独立的生物学重复样本，具体重复次数详见相应的实验方法部分。每个实验的样本数量根据先前的关于昆虫媒介-病原体相互作用的研究[23]确定，以确保足够的统计功效。每个实验中使用的所有阳性对照和阴性对照都在相应的实验方法部分有明确描述，所有对照处理都包含在每次实验中以验证检测系统的可靠性。

3. 结果
3.1. C. chinensis和E. amylovora引起的协同损害症状的观察与验证
在Korla梨园中，观察到大量被C. chinensis侵染的叶片表现出类似梨火疫病的症状（图1A）。这些叶片上出现随机分布的坏死黑斑；在有利的气候条件下，这些病斑持续扩展并最终融合，导致叶片组织大面积坏死。收集了一些被C. chinensis侵染但无可见坏死病斑或叶脉变黑的叶片（图1B(a)）。对9棵梨树上的180片受侵染叶片进行了田间调查，结果显示，在室内潮湿培养7天后，43.3%的无症状叶片出现了典型的火疫病症状（图1B(b)）。将携带或不携带E. amylovora的C. chinensis若虫（n = 5）分别放置在健康的Korla梨叶片上（n = 90）。经过7天的观察，被携带E. amylovora的C. chinensis若虫啃食的叶片出现叶脉变黑，这种变黑逐渐扩展到周围组织，形成了与梨火疫病特征相符的症状。在此期间，梨叶片保持正常状态，没有萎蔫（图1B(c)）。相比之下，被不携带E. amylovora的C. chinensis若虫啃食的叶片仅在叶脉两侧出现黑斑，且叶脉颜色保持正常（无变黑）。随着C. chinensis若虫的长期侵染，梨叶片逐渐萎蔫（图1B(d)。
图1. C. chinensis和E. amylovora对Korla梨的协同损害症状。（A）田间症状：叶片损害、蜜露分泌和类似火疫病的病斑。（B）室内验证：（a）无症状的田间叶片；（b）潮湿培养后的叶片；（c）同时被C. chinensis和E. amylovora侵染的叶片；（d）仅被无菌C. chinensis侵染的叶片。共从9棵梨树上收集了180片无症状的受侵染叶片用于室内实验。

3.2. 从C. chinensis的内部和外部表面检测、分离E. amylovora及其致病性
从六个来源分离出了E. amylovora菌株：C. chinensis成虫的外部表面（CW）、C. chinensis成虫的内部组织（CN）、若虫分泌的蜜露（ML）、出现协同损害的田间采集叶片（Y-1）、若虫的内部组织（RN）以及若虫的外部表面（RW）。使用已知的致病性E. amylovora菌株作为阳性对照（PC），无菌水作为阴性对照（NC）。使用特异性引物RS24580-205F/205R进行PCR检测，以检测C. chinensis内部/外部表面、蜜露以及协同受损叶片中的E. amylovora（图2A）。每个样本含有10个C. chinensis个体。收集了三个样本组，每个组进行三次独立的PCR检测。结果显示，E. amylovora在成虫内部组织（CN）和若虫（RN）中的检出率为100%，在成虫外部表面（CW）中为77.8%，在若虫外部表面（RW）中为66.7%，在若虫蜜露（ML）中为88.9%，在田间感染的叶片（Y-1）中为100%，证实E. amylovora广泛存在于C. chinensis的内部和外部表面以及被昆虫侵染的叶片中。从不同来源分离出的所有E. amylovora菌株在LB固体培养基上的菌落形态一致：乳白色、中心凸起、质地粘稠、半球形、边缘整齐。各菌株之间没有明显的形态差异（图2B）。所有来自不同来源的E. amylovora菌株对Korla梨都具有致病性。具体来说，叶柄接种部位迅速出现黑色坏死病斑，伴随细菌分泌物的渗出，病斑沿叶柄和叶脉迅速扩散到叶片叶片。幼果表面渗出大量白色细菌分泌物。嫩枝上的接种部位变黑，幼叶顶端的幼叶上观察到红棕色细菌分泌物（图2C）。
图2. 从C. chinensis携带的E. amylovora的检测、菌落分离及致病性。（A）在C. chinensis和梨叶片中检测到E. amylovora。（B）来自C. chinensis内部和外部部分的E. amylovora菌落。（a–f）分别对应于ML、RW、CW、RN和Y-1的来源。（C）接种相应E. amylovora菌株的梨组织上的病害症状：（a）梨枝条，（b）幼果，（c）嫩叶。

3.3. C. chinensis内部和外部携带的E. amylovora菌株的CFU计数和致病性差异
从C. chinensis的不同发育阶段（成虫和若虫）以及不同身体部位（内部组织与外部表面）分离出的E. amylovora菌株在NSA培养基上的菌落数量有所不同。如图3A所示，在10^-5至10^-7的稀释度下，成虫和若虫内部携带的菌株的CFU数量没有统计学上的差异（Student’s t检验，p > 0.05）。然而，若虫来源的菌株在内部和外部群体的CFU负荷显著高于成虫来源的菌株（单因素ANOVA，p < 0.05）。总体而言，来自蜜露（ML）的菌株具有最高的CFU值，并且与其他大多数组别存在明显差异，阳性对照（PC）除外；而来自成虫外部表面（CW）的菌株记录的CFU水平最低。例如，在10^-6的稀释度下，ML的CFU含量是CW的4.7倍（图3A(b)）。接种在Korla梨枝条上的病害指数在不同来源的E. amylovora菌株之间表现出显著的时间变化（图3B(a)）。接种后3天（dpi），来自蜜露的菌株（ML）引起的病害指数显著高于其他菌株；在5–7 dpi时，蜜露来源的菌株与成虫外部表面（CW）的菌株之间的差异变得不明显。从接种后3天到5天，来自成虫内部组织（CN）的菌株始终表现出较低的致病性，而来自若虫内部组织（RN）的菌株表现出明显的较高病害指数。在接种的梨叶片上，不同来源的菌株的病害指数模式也随时间显示出明显差异（重复测量ANOVA，p < 0.05，图3B(b)）。在接种后3天，来自蜜露（ML）、若虫外部表面（RW）和若虫内部组织（RN）的菌株引起的病害指数高于其他菌株（p < 0.05）。从接种后3天到7天，RN菌株的致病性始终高于CN菌株（p < 0.05），且ML菌株在整个观察期间保持了较高的致病性。在接种的梨果实上，不同来源的菌株在1至3 dpi期间的病害指数也有明显差异（重复测量ANOVA，p < 0.05，图3B(c)）。在接种后1天，来自蜜露（ML）的菌株引起的症状最为严重。RN菌株的致病性在统计上高于CN菌株，RW菌株的致病性高于CW菌株（p < 0.05）。到接种后3天，CW菌株引起的病害指数明显低于ML和RN菌株（p < 0.05）。
图3. 从C. chinensis携带的E. amylovora的CFU定量和致病性。（A）在三种稀释条件下从C. chinensis不同发育阶段和身体部位分离出的E. amylovora的CFU计数：（a）10^-5稀释，（b）10^-6稀释，（c）10^-7稀释。（B）接种不同E. amylovora菌株的Korla梨组织在接种后7天（dpi）的病害指数：（a）梨枝条，（b）嫩叶，（c）嫩果。数据为平均值±标准差（n = 3）。不同字母表示通过Tukey’s HSD检验（SPSS 20.0）得到的显著差异（p < 0.05）。

3.4. 成虫C. chinensis不同器官中携带细菌的状态和E. amylovora的致病性差异
为了进一步了解成虫C. chinensis器官中携带E. amylovora的状态，我们对雌性和雄性成虫以及解剖组织使用了特定物种引物（RS24580-205F/205R）进行了PCR检测。两性样本都对E. amylovora检测呈阳性（图4A），并且在该细菌存在于所有检查的组织中，包括头部、前翅、后翅、前腿、中腿、后腿、消化系统以及雄性和雌性的生殖系统。从这些组织中分离出了10个菌株（QC、HC、QD、ZD、HD、TB、CJ、LC、JC、XHD）：前翅（QC）、后翅（HC）、前腿（QD）、中腿（ZD）、后腿（HD）、头部（TB）、触角（CJ）、雌性生殖系统（LC）、雄性生殖系统（JC）和消化系统（XHD）。所有分离株在LB培养基上的菌落形态相同——乳白色、粘稠、半球形、边缘光滑、中心隆起——与阳性对照（PC；图4B）无法区分。所有菌株在嫩化的库尔勒梨叶上均引发了典型的梨火疫病症状，并且在所有观察时间点上疾病指数存在显著差异（重复测量方差分析，p < 0.05；图4C）。在接种后3至5天（dpi），LC菌株（雌性生殖系统）引起的疾病指数显著高于其他所有菌株（p < 0.05），而在接种后7天（dpi），LC菌株与XHD菌株（消化系统）之间没有显著差异（p > 0.05）。HD菌株（后腿）、HC菌株（后翅）和CJ菌株（触角）在所有时间点上的疾病指数始终最低（p < 0.05），而TB菌株（头部）、QD菌株（前腿）和ZD菌株（中腿）在整个观察期间保持了相对较高的致病性。从消化系统和雌性生殖系统分离出的菌株在接种后7天在梨叶上引起的疾病指数是来自体表的菌株的3到9倍。图4. 成年C. chinensis解剖部位中E. amylovora的检测及其致病性。（A）成年C. chinensis解剖部位中E. amylovora的检测。（B）相应E. amylovora分离株的疾病症状、菌落和显微图像：(a) 细菌分离株的显微形态，(b) LB培养基上的菌落形态，(c) 接种后的库尔勒梨叶上的疾病症状，(d) 用于细菌分离的解剖组织。（C）不同解剖部位接种E. amylovora后梨叶的疾病指数随时间的变化。数据为平均值±标准差（n = 3）。不同字母表示通过Tukey’s HSD检验（SPSS 20.0）进行的显著差异（p < 0.05）。

3.5. 对C. chinensis携带的E. amylovora遗传序列差异的分析
使用针对E. amylovora的物种特异性引物对RS24580-205F/205R扩增了从成年C. chinensis不同解剖部位分离出的菌株的序列，随后进行了系统发育分析（图5）。将测试菌株的序列与NCBI数据库中的E. amylovora参考序列（CP063688.1、CP063691.1来自美国；CP104022.1、CP104025.1来自中国新疆）进行比对，显示所有测试菌株与参考序列之间的序列相同性为99%，证实所有分离株均属于E. amylovora。基于比对序列构建了邻接聚类（Neighbor-Joining, NJ）系统发育树，以Pseudomonas syringae作为外群。结果表明，所有测试菌株和E. amylovora参考菌株形成了一个具有99%bootstrap支持度的独立单系群，完全与外群分离。在这个主要分支内，ZD、TB、QC、LC、JC、HC、CJ和QD菌株与参考分离株聚类在一起，而XHD和HD菌株形成了一个独立但密切相关的亚群，两者也都具有99%的bootstrap支持度。结合菌落形态、致病性和系统发育关系的综合分析证实，成年C. chinensis的不同身体部位可以携带活的且具有致病性的E. amylovora。值得注意的是，此处观察到的99%序列相同性确认了这些分离株的分类学身份为E. amylovora，但并未表明存在新的遗传变异，因为高相似性本身不足以支持新变种的主张。图5. 来自成年C. chinensis不同解剖部位的E. amylovora菌株的系统发育树。节点处的bootstrap值（1000次重复）已显示；刻度尺表示0.05的遗传距离。Pseudomonas syringae作为外群。

4. 讨论
本研究系统地描述了E. amylovora在C. chinensis不同发育阶段和解剖组织中的携带情况，以及媒介携带菌株的致病性变异。我们的结果直接回答了预定义的研究目标和假设：我们证实C. chinensis可以通过机械（外部附着）和生物（内部定殖）途径携带活的且具有致病性的E. amylovora，并识别出来自不同来源的菌株之间的致病性显著差异（p < 0.05）。这些发现填补了关于C. chinensis与E. amylovora相互作用的关键知识空白，并为梨火疫病的流行动态提供了新的见解。害虫-病原体之间的协同损害在全球农业中导致了巨大的经济损失[27,28,29,30]，因为害虫和病原体通常形成相互促进、相互依赖的关系，从而放大疾病流行[31,32]。与经典的媒介-病原体系统（包括由粉虱传播的柑橘黄龙病[33]、叶蝉/蚜虫传播的植物病原体[16]和蓟马传播的病毒性疾病[34]）一致，我们的田间观察发现被C. chinensis侵染的库尔勒梨叶出现了类似火疫病的症状，这一点通过实验室检测得到了进一步验证。我们确认C. chinensis和E. amylovora通过双重机制对梨树宿主造成协同损害：刺吸取食造成的机械伤口促进了病原体的侵入，而媒介分泌的蜜露为E. amylovora的定殖和增殖提供了营养丰富的环境。其他物种中也报道了E. amylovora在昆虫媒介中的存活和致病性[35,36]，但在这项工作之前，C. chinensis中E. amylovora的携带特征和致病性变异尚未得到描述。在这里，我们提供了系统证据，证明E. amylovora可以定殖成年C. chinensis的所有检测解剖组织，并且从媒介的内部和外部表面都分离出了活的菌株。我们还在C. chinensis的若虫和成虫阶段检测到了活的E. amylovora，表明媒介-病原体之间的相互作用比以前认为的更为密切。关键的是，越冬的成年C. chinensis可能在宿主稀缺的非生长季节成为E. amylovora的关键储库[37]，这对于理解梨火疫病在田间的越冬和年度复发具有重要意义。本研究中的所有E. amylovora分离株在NA培养基上的菌落形态一致，但在不同宿主组织（枝条、叶片、果实）中的致病性表现出显著差异。这一现象与先前的报告一致，即植物病原体会调节毒力因子表达和代谢途径以适应媒介微环境[38,39]，从而促进在C. chinensis中的存活和传播。我们发现来自若虫（无论是内部还是外部）的菌株通常比成虫来源的菌株具有更高的毒力。这可能是因为若虫在嫩组织上的取食时间更长[40]、病原体获取效率更高[41,42]，或者若虫的免疫系统不如成虫发达，从而对病原体的增殖施加了较低的选择压力[43]。这可能有几个潜在的原因，需要进一步验证。值得注意的是，从C. chinensis蜜露中分离出的菌株具有最高的CFU计数，并在所有检测中表现出持续的强致病性。C. chinensis若虫分泌的蜜露富含糖分、氨基酸和其他营养物质，为E. amylovora的生长提供了天然培养基[44]，这可能是蜜露来源菌株高致病性和强毒力的原因，这一点需要进一步验证[45,46]。我们还发现来自C. chinensis不同解剖部位的菌株之间存在显著的毒力差异：来自头部、消化系统和雌性生殖系统的菌株具有最高的毒力，而来自后腿、后翅和触角的菌株则始终具有较低的毒力。这种差异很可能是由不同媒介组织的定向选择驱动的：成功定殖特定生态位需要病原体的适应性进化，包括上调抗逆性、组织粘附性和免疫逃避基因[47,48,49,50]，这需要通过进一步的转录组分析来确认。E. amylovora与C. chinensis之间的潜在相互作用——病原体促进媒介的繁殖[23]，而媒介促进病原体的传播和增殖——形成了一个正反馈循环，使梨火疫病的管理变得复杂。我们的发现强调了需要开发同时针对媒介和病原体的综合管理策略。具有双重杀虫和抑菌活性的药剂可能有效地阻断这种互利循环，从而提高田间梨火疫病的控制效率。

5. 结论
本研究提供了系统证据，证明C. chinensis作为梨火疫病的致病菌E. amylovora的有效媒介，通过生物学和机械途径进行传播。该病原体在成年粉虱的10个器官中被检测到，来自若虫的菌株比来自成虫的菌株具有更高的致病性，这可能归因于若虫的取食习性和不成熟的免疫系统。若虫分泌的营养丰富且弱酸性的蜜露显著促进了E. amylovora的增殖并增强了其毒力。系统发育分析证实所有分离株与典型的E. amylovora菌株具有高同源性。我们还揭示了一种潜在的协同作用机制：C. chinensis为E. amylovora提供了侵入伤口和营养，而病原体可能提高了其昆虫媒介的适应性。作为首份关于C. chinensis在新疆梨园中E. amylovora传播作用的系统报告，这项工作填补了该地区梨火疫病流行动态的关键知识空白。这些发现为综合害虫-疾病管理奠定了理论基础，并为开发具有双重功能的杀虫和抑菌剂以阻断传播周期提供了关键参考。

补充材料
以下支持信息可在以下链接下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/insects17050487/s1，包括病原体鉴定、疾病指数分级标准和系统发育分析的补充表格。表S1：本实验中使用的菌株；表S2：分离叶片的疾病指数分级标准；表S3：系统分析涉及的序列信息。