外周血单核细胞的鞘脂组谱分析揭示：与正常体重健康受试者相比， essential obesity（肥胖症）患者和代谢综合征患者的免疫代谢特征存在显著差异 作者：Antonello E. Rigamonti, Michele Dei Cas, Paola Signorelli, Adele Bondesan, Diana Caroli, Silvano G. Cella, Alessandro Sartorio

《Journal of Clinical Medicine》：Sphingolipidomic Profiling of Peripheral Blood Mononuclear Cells Reveals a Distinct Immunometabolic Signature Across Patients with Essential Obesity and Metabolic Syndrome Compared to Normal-Weight Healthy Subjects Antonello E. Rigamonti, Michele Dei Cas, Paola Signorelli, Adele Bondesan, Diana Caroli, Silvano G. Cella and Alessandro Sartorio

　　摘要 背景：尽管肥胖和代谢综合征（MS）中的鞘脂变化已在血浆中得到广泛研究，但它们在免疫细胞内的调控机制仍不明确。本文介绍了一种基于外周血单核细胞（PBMC）的鞘脂组学方法，该方法提供了超越传统循环脂质分析的新型免疫代谢视角。方法：在正常体重健康（NWH）受试者以及患有必需型肥胖（EO）或MS的患者的外周血单核细胞中进行了靶向鞘脂组学研究。结合多变量分析（主成分分析[PCA]、层次聚类和偏最小二乘判别分析[PLS-DA]以及选定的单变量模型，探讨了脂质模式及其与心血管代谢变量的关联。结果：PBMC分析识别出一种选择性的细胞内鞘脂特征，有10种鞘脂在组间显著改变（FDR < 0.05），包括神经酰胺、二氢神经酰胺、糖鞘脂和神经酰胺比率指数。PCA显示前两个主成分解释了约72%的总变异，其中PC2负责组间分离。EO和MS之间存在部分重叠，表明它们具有共享的代谢表型，但两者都与NWH不同。多变量模型显示神经酰胺比率（如CER16/24和CER18/24）是关键的区分指标。与心血管代谢变量的关联有限且较弱（调整后的R2约为0.06–0.09），表明脂质变化反映了全面的代谢失调，而不仅仅是单一的临床驱动因素。结论：基于PBMC的鞘脂组学揭示了EO和MS中独特的细胞内免疫代谢重塑，这些特征在血浆中无法检测到。这些发现支持了免疫细胞脂质分析作为潜在综合生物标志物的相关性，并为理解免疫-代谢相互作用在代谢疾病中的作用提供了见解。

1. 引言
必需型肥胖（EO）和代谢综合征（MS）是全球主要的健康挑战，其特征是代谢失调、慢性低度炎症和免疫系统激活之间的复杂相互作用[1,2]。这些状况与心血管疾病、2型糖尿病（T2D）和死亡率的风险增加密切相关[3,4]。尽管进行了大量研究，但过量脂肪与系统性代谢功能障碍之间的分子机制仍不完全清楚[5]。在脂质类别中，鞘脂已被认为是代谢稳态的关键调节因子[6,7]。神经酰胺（Cers）作为鞘脂代谢的“生化中心”，通过抑制Akt信号传导、线粒体功能障碍和促进凋亡参与胰岛素抵抗[8,9]。下游代谢物，包括鞘磷脂（SMs）和糖鞘脂（如己糖基神经酰胺（HexCers）、乳糖基神经酰胺（LacCers）和神经节苷脂（GMs），参与膜组织、受体信号传导和炎症反应[10,11]。此外，从头合成的中间体（如二氢神经酰胺（DHCers）越来越被认为是代谢压力的早期指标[12]。总体而言，这些脂质类别表明在代谢失衡时鞘脂代谢发生了协调性的重塑，EO和更晚期的MS表型之间可能存在路径激活的差异。大多数研究EO和MS中鞘脂变化的研究都是在血浆或血清中进行的[13]。虽然循环脂质水平提供了重要信息，但它们主要反映了系统的脂质转运和器官间的流动，可能无法完全反映细胞内的代谢过程[14]。这是一个关键的知识空白，因为细胞内脂质重塑——特别是在免疫细胞中——可能直接将代谢压力与炎症联系起来。外周血单核细胞（PBMC）是一个参与免疫反应和炎症信号的生物学活跃区室[15]。在肥胖和MS中，PBMC经历功能和代谢重编程，包括底物利用和炎症激活的变化[16]。因此，基于PBMC的鞘脂组学提供了一个补充的、可能更具机制解释力的视角，相比循环脂质分析更有优势。尽管免疫细胞内的脂质分析相对有限，但新兴研究开始探索PBMC及相关免疫群体的脂质组学变化，强调了其对理解免疫代谢相互作用的重要性[15,16]。然而，对不同代谢疾病阶段PBMC中鞘脂代谢的全面表征仍然缺乏。特别是，尚不清楚EO和MS是否共享共同的细胞内脂质特征，或者它们是否表现出反映疾病进展的不同模式。

MS由一组临床和生化异常定义，包括中心性肥胖、血脂异常、动脉高血压和胰岛素抵抗[1,3]。这些特征与慢性炎症密切相关，通常表现为C反应蛋白（CRP）水平升高[17]。了解PBMC鞘脂代谢如何与这些组分整合，可能有助于揭示代谢和免疫途径之间的相互作用，并帮助识别新的综合生物标志物[18]。因此，本研究旨在同时具有探索性和区分性目标。首先，我们对正常体重健康（NWH）受试者和EO或MS患者进行了PBMC鞘脂组学特征的探索性分析，使用综合单变量和多变量方法来识别脂质重塑的模式。其次，我们探讨了选定的鞘脂物种与符合国际糖尿病联合会（IDF）MS标准的重点心血管代谢变量之间的关联，以评估其潜在的生物学相关性。第三，我们使用多变量模型评估了PBMC来源的鞘脂特征的区分能力——无论是单个物种还是复合指数——以确定它们在区分代谢表型方面的能力。

2. 材料与方法
2.1. 受试者
本研究招募了在意大利Piancavallo-Verbania的Istituto Auxologico代谢疾病部门住院的肥胖受试者（体重指数BMI > 35 kg/m2），他们参加了为期3周的多学科综合减肥计划（BWRP）。作为对照组，招募了年龄匹配的正常体重健康（NWH）受试者，这些受试者是从医务和护理人员的朋友和亲戚中选出的。肥胖和NWH受试者都有一定的活动量（每周两次，每次60分钟）。所有女性均为月经规律；研究在其月经周期的卵泡期进行。在确认排除标准（特别是是否存在除必需型肥胖以外的任何疾病或使用任何药物）后，收集了每位参与者的临床、生化和人体测量数据，包括通过生物阻抗分析评估体成分（详见下文）。
研究方案得到了意大利米兰Istituto Auxologico IRCCS伦理委员会（EC代码：2021_02_23_11；研究项目：01C126；缩写：SFINGOTRANSADIP）的批准。向受试者解释了研究方案，他们提供了书面知情同意书。参与者于2021年6月至2022年3月期间陆续招募，基于血液样本收集的日期。

2.2. 临床评估
2.2.1. 人体测量
使用身高计测量身高和体重（Wunder Sa.Bi., WU150, Trezzo sull’Adda, Italy）。 waist circumference（WC）在站立状态下用弹性带测量，位置位于肋骨下缘和脊柱上缘之间。在仰卧休息20分钟后，通过生物阻抗分析（Human-IM Scan, DS-Medigroup, Milan, Italy）测量体成分。所有受试者的BMI、脂肪质量（FM）和去脂质量（FFM）均被测定。
2.2.2. 血压
使用适当尺寸的袖带和血压计在右臂上测量血压，受试者需坐姿放松。该过程重复三次，每次间隔10分钟；记录三次测量的收缩压（SBP）和舒张压（DBP）的平均值。
2.2.3. 代谢综合征和必需型肥胖的定义
根据IDF对成人代谢综合征的诊断标准[19]，MS定义为存在中心性肥胖加上以下四个因素中的至少两个。中心性肥胖定义为男性腰围WC ≥ 94 cm，女性WC ≥ 80 cm（欧洲人群特定阈值）。此外，还需要满足以下至少两个标准：(i) 高甘油三酯血症：甘油三酯（TG）≥ 150 mg/dL（1.7 mmol/L），或对此脂质异常进行特定治疗；(ii) 低HDL胆固醇（HDL-C）：<40 mg/dL。
EO被定义为那些不符合IDF诊断标准所需最低数量的肥胖个体。

2.3. 实验室程序
2.3.1. 代谢变量
在BWRP开始时，大约在早上8:00采集空腹血液样本（约10 mL），此时已经禁食一夜（约12小时）。使用标准化实验室方法测量血清中的总胆固醇（T-C）、HDL-C、LDL胆固醇（LDL-C）、TG、葡萄糖、胰岛素、CRP和糖化血红蛋白（HbA1c）水平。
脂质参数（T-C、HDL-C、LDL-C和TG）和葡萄糖使用酶促比色法（Roche Diagnostics, Monza, Italy）进行测量。胰岛素使用化学发光免疫测定法（Elecsys Insulin, Roche Diagnostics）测量，CRP使用免疫浊度测定法（<1 mg/dL = 高心血管风险）。HbA1c通过基于阳离子交换原理的高效液相色谱（HPLC，Bio-Rad D-10系统）进行定量，校准可追溯至国际临床化学联合会（IFCC）标准。结果以总血红蛋白的百分比表示。检测灵敏度在标准分析范围内（脂质和甘油三酯≤9 mg/dL，葡萄糖2 mg/dL，胰岛素0.2 μIU/mL，CRP 0.03 mg/dL）。通过 intra-和 inter-assay 变异系数确认了分析精度，所有参数均低于5%。
胰岛素抵抗通过稳态模型评估（HOMA-IR）估算，计算公式为：胰岛素（μIU/mL）× 葡萄糖（mmol/L）/ 22.5 [20]。
2.3.2. 从全血中分离PBMC
根据制造商的标准方案，使用Ficoll-Paque通过密度梯度离心从新鲜全血中分离PBMC。收集在抗凝处理管（肝素）中的全血在静脉穿刺后2小时内进行处理，以最小化细胞降解和体外激活。血液样本与磷酸盐缓冲盐水（PBS）或等效缓冲盐溶液按1:1比例稀释后，在室温下小心分层覆盖在Ficoll-Paque PLUS（密度1.077 g/mL）上，然后在室温下以400× g离心30分钟。离心后，试管从上到下分别显示富含血浆、PBMC和红细胞的层次。去除血浆层后，小心吸取位于血浆-Ficoll界面的PBMC层并转移到干净的圆锥形试管中。细胞用PBS洗涤两次，每次离心300–400× g 10分钟以去除血小板和残留的Ficoll。最终的PBMC沉淀重新悬浮在PBS中，计数后立即用于鞘脂组学分析或储存在-80°C直至后续脂质提取（见下文）。该程序产生的PBMC富集组分主要由淋巴细胞和单核细胞组成，广泛用于下游免疫学和组学应用。
2.3.3. 脂质提取和鞘脂含量定量
鞘脂提取和靶向LC–MS/MS分析按照先前描述的方法进行[21,22]。在上述制备的25 μL PBMC悬浮液中检测鞘脂。将样品稀释至最终体积100 μL，加入850 μL甲醇/氯仿混合物（2:1 v/v），然后在38°C下孵育1小时。随后，通过加入75 μL 1 M氢氧化钾甲醇在37°C下进行碱性甲醇解裂2小时以增强回收率。中和后，用4 μL纯醋酸处理样品，离心（15分钟，13,400 rpm），然后蒸发。残留物溶于100 μL甲醇中，离心（10分钟，13,400 rpm），转移到玻璃小瓶中。最后，样品使用LC Dionex 3000 UltiMate（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）与AB Sciex 3200 QTRAP（AB Sciex, Marlborough, MA, USA）串联质谱仪联用进行分析。分离使用反相色谱，分别使用BEH C8 1.7 μm, 100 × 2.1 mm（对于神经酰胺、二氢神经酰胺和鞘磷脂）或Cortecs C18 1.6 μm, 100 × 2.1 mm（对于鞘脂醇）色谱柱（Waters, Milford, MA, USA），通过混合洗脱液A（0.2%甲酸，2 mM甲酸铵水溶液）和洗脱液B（甲醇，0.2%甲酸，1 mM甲酸铵）。定量分析通过使用每种鞘脂的校准曲线插值每种分析物峰面积与内标面积来进行。
2.3.4. 脂质组学测量的质量控制和分析验证
为了确保鞘脂组学数据的稳健性、可重复性和分析可靠性，在整个实验流程中实施了全面的质量控制（QC）程序，包括样本制备、LC–MS/MS采集和数据处理器理。首先，所有样本均使用标准化和完全协调的PBMC分离和脂质提取协议进行处理，以最小化分析前变异。样本处理时间严格控制，所有样本在采血后2小时内处理，以减少降解和体外代谢变化。定量脂质组学分析使用上述（2.3.3节）描述的内部标准校准方法进行。对于每种鞘脂类别，在提取前加入适当的内标，以校正提取效率、离子化变异性和仪器响应。为每种分析物生成了校准曲线，并且只考虑在线性动态范围内的信号进行定量分析。为了监测分析性能，通过合并多个PBMC提取物中的等分样本制备了汇总的质量控制样品，并在LC–MS/MS序列中定期注入这些样品。这些质量控制样品用于评估仪器稳定性、保留时间一致性和重复测定的信号再现性。监测了质量控制样品中主要定量鞘脂物种的变异系数（CV），并确认其处于可接受的分析范围内。通过按随机顺序分析样品来最小化批次效应。此外，还定期使用标准调整程序和评估关键参数（如质量精度、灵敏度和色谱分辨率）来检查仪器性能。尽管由于样品可用性的限制，在提取层面上的技术重复实验有限，但内部标准标准化、质量控制样品监测和控制分析条件的结合确保了所有研究组中脂质组学测量的可靠性和可比性。

2.4 数据分析
2.4.1 统计分析和软件
使用Shapiro–Wilk检验测试连续变量的正态性。由于大多数鞘脂浓度不符合正态分布，数据以中位数和四分位距（IQR）的形式呈现，并使用非参数方法进行组间比较。使用Kruskal–Wallis检验评估组间差异（正常体重（NWH）受试者与患有Essential Obesity（EO）或Metabolic Syndrome（MS）的患者之间的差异，随后使用Dunn的事后检验进行成对比较。在适当的情况下，为了考虑鞘脂物种间的多重检验，使用Benjamini–Hochberg错误发现率（FDR）程序调整p值。分类变量以计数或百分比的形式呈现。使用卡方检验评估组间差异。
对完整的鞘脂变量集合进行主成分分析（PCA），以探索数据集的全局结构并可视化样本聚类。在PCA之前，对数据进行了对数转换以减少偏度，并进行了自动缩放（均值居中并除以标准差），以确保具有不同动态范围的变量之间的可比性。报告了每个主成分解释的方差比例。对于在单变量组间比较后经过FDR校正仍具有统计学意义的鞘脂子集，使用欧几里得距离和Ward的链接方法进行了层次聚类分析。在聚类之前，数据已进行对数转换和标准化。生成热图以可视化样本间的相对丰度模式，其中行代表受试者，列代表脂质物种。
使用在单变量分析中被识别为显著的鞘脂子集进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA），以评估组间的多变量区分。使用交叉验证评估模型性能，并计算投影中的变量重要性（VIP）得分，以确定对组间分离最具影响力的变量。进行单变量线性回归分析，以研究鞘脂物种与心血管代谢参数（包括BMI、WC、SBP和DBP、胰岛素抵抗（HOMA-IR）、HDL-C、TG和CRP）之间的关联。每种鞘脂分别在单独的普通最小二乘（OLS）回归模型中被作为因变量进行建模。报告了回归系数（β）、标准误差（SE）、95%置信区间（CI）、标准化系数（Std. β）和调整后的R2值。为了考虑回归分析中的多重检验，使用Benjamini–Hochberg程序分别对每个预测因子内的所有鞘脂进行p值调整，从而控制每个测试家族内的比较次数。选择这种方法是为了在I型错误控制与脂质组学和临床变量的相关性之间取得平衡。
当适当时，双侧p值<0.05或FDR调整后的p值<0.05被认为是统计学上显著的。所有统计分析均使用Python（v. 3.14.4；Python软件基金会，美国特拉华州威尔明顿）进行。数据处理和预处理使用Pandas（v. 3.0.2）和NumPy（v. 2.4.4）。组间比较使用SciPy库（v. 1.17.1）进行。多变量线性回归模型使用Statsmodels（v. 0.15.0）计算。PCA使用Scikit-learn（v. 1.8.0）进行。层次聚类和PLS-DA/VIP使用SciPy（v. 1.17.1）和Matplotlib（v. 3.10.9）生成。火山图、热图和箱线图使用Matplotlib（v. 3.10.9）生成。上述所有软件均为开源社区软件。

2.4.2 多变量分析中变量选择的理由
在本研究中，对鞘脂组学数据集应用了探索性和目标性统计策略，以平衡全面的模式发现与模型的可解释性和稳健性。对于无监督的探索性分析（包括PCA和火山图可视化），保留了所有量化的鞘脂变量（n = 38个单独物种加上3个比值指数；总n = 41个变量）。这一选择是基于这些方法的无假设性质，它们旨在在不做任何先验假设或变量选择的情况下捕获脂质组学数据集的全局结构。通过包括所有测量的鞘脂变量，这些分析保留了数据的内在协方差结构，并能够识别反映协同代谢重塑的主要变异轴。相比之下，对于有监督或结构增强分析（如层次聚类和PLS-DA），变量空间被限制为在FDR校正后单变量组间比较中具有统计学意义的鞘脂变量子集（n = 10个变量）。这种选择是为了相对于样本大小减少维度，提高模型稳定性，并限制可能掩盖生物学意义上的模式的噪声或无信息变量的包含。鉴于研究的样本量适中，这种方法被认为适合减轻过拟合并提高聚类和区分结果的可解释性。
同样，对心血管代谢变量的单变量回归分析仅使用了之前具有显著性的鞘脂子集（n = 10个变量）。这种有针对性的方法旨在关注最有可能具有生物学相关性的脂质物种，并减少高维数据集中固有的多重检验负担。为了进一步控制I型错误率，如上文第2.4.1节所述，在每个测试家族内应用了FDR校正。

2.4.3 缺失数据
临床和人体测量变量的缺失数据比例通常较低（<5%），而选定的生化和鞘脂测量的缺失数据比例略高（大约5–15%），这可能反映了技术和分析的变异性。缺失数据处理策略
鉴于缺失数据的比例相对较低以及某些变量的非正态分布，使用中位数插补处理缺失值。与中位数插补相比，选择中位数插补是为了减少偏态分布和异常值的影响。这种方法保留了完整的样本量，并避免了与全案例分析相关的潜在偏差。

3. 结果
3.1 人口统计、临床和生化参数的比较
表1总结了NWH、EO和MS组的人口统计、生化和临床特征以及比较结果。表1显示了正常体重（NWH）受试者和患有Essential Obesity（EO）或Metabolic Syndrome（MS）的患者在人口统计、生化和临床参数上的描述性统计和组间比较。三个研究组在年龄和性别分布上相当，表明这些变量的匹配适当，最小化了潜在的混杂效应。正如预期的那样，主要差异体现在人体测量和代谢参数上，反映了代谢受损的明显梯度。EO和MS组与NWH组相比，体重、BMI和体脂（FM）显著增加，证实了严重的脂肪堆积。值得注意的是，WC进一步区分了MS和EO，突出了MS表型中更为明显的中心脂肪分布，与其较高的心血管代谢风险谱一致。
心血管参数也显示出类似的渐进模式。EO组的HR和BP已经高于NWH组，并且在MS组中进一步增加，表明沿着代谢连续体，血液动力学调节逐步恶化。生化变量加强了这一梯度。HDL-C水平从NWH组到EO组再到MS组逐渐下降，而TG和胰岛素水平以及HOMA-IR在各个组中增加，表明胰岛素敏感性和脂质代谢恶化。重要的是，MS患者表现出最显著的变化，这与更严重的代谢紊乱一致。HbA1c仅显示出轻微差异，在MS组中显著升高，表明早期血糖受损而不是EO组的明显糖尿病。
炎症状态通过CRP反映，EO和MS组与NWH组相比显著升高，两种情况之间没有差异。这一发现表明，在肥胖状态下已经存在低度炎症，并且随着向MS的转变并未进一步显著增加。在补充材料中，表S1报告了NWH、EO和MS组中糖尿病、高血压和血脂异常的患病率以及药物使用情况。

3.2 鞘脂物种和比值的比较
如表2所示，在 ceramides 中，Cer 18和Cer 24:1在FDR校正后显示出显著差异。这两种物种从NWH组到EO组再到MS组逐渐增加，MS组的水平始终最高。成对比较表明，这些差异主要由NWH组和MS组之间的对比驱动，而EO组的值通常处于中间位置。

3.3 单变量回归分析
限制在先前在研究组间被识别为显著改变的鞘脂物种上的单变量线性回归分析揭示了与特定心血管代谢参数的一组有限但一致的关联（表3）。特别是，CER24:1/24与BMI和WC显示出显著的正相关。此外，DBP成为唯一与多个鞘脂物种显著相关的血液动力学参数。事实上，观察到了Cer 18、Cer 24:1和DHCer 18之间的正相关关系。在所有显著的模型中，标准化回归系数的幅度适中（标准β约为0.27–0.32），调整后的R2值在大约0.06到0.09之间，表明这些单独的预测因子解释了鞘脂水平变化的一小部分。值得注意的是，所有观察到的关联都是正相关的，反映了心血管代谢状态恶化（脂肪增多或舒张压升高）与较高鞘脂浓度或鞘氨醇组成改变之间的一致的方向性关系。表S2（在补充材料中）列出了包括非显著关联在内的所有关联。

3.4. 浮深度分析可视化：所有鞘脂变量
在比较EO与NWH时，火山图识别出7个在FDR校正后仍然显著的鞘脂变量。与NWH相比，所有显著特征在EO中都向上移动，且没有脂质的对数变化倍数呈负值且达到显著性阈值。最强的EO相关信号是鞘氨醇比率指数CER18/24（log2FC 0.737，FDR 0.0019）和CER24:1/24（log2FC 1.038，FDR 0.0020）。此外，观察到LacCer 24:1、DHCer 18:0、Cer 24:1、HexCer 24:1和CER16/24也显著升高。总体而言，EO的比较主要表现为极长链鞘氨醇的重塑增加以及糖鞘脂相关物种或比率的增加，而不是整个鞘脂组的普遍升高（图3A）。

（A）火山图显示EO和NWH之间白细胞鞘脂表达的差异。x轴代表基于中位数的对数变化倍数（EO/NWH），y轴代表Benjamini–Hochberg FDR调整后的p值的负对数。显著的脂质（FDR < 0.05）被突出显示并标记。（B）火山图显示MS和NWH之间白细胞鞘脂表达的差异。x轴代表基于中位数的对数变化倍数（MS/NWH），y轴代表Benjamini–Hochberg FDR调整后的p值的负对数。显著的脂质（FDR < 0.05）被突出显示并标记。虚线水平表示FDR显著性阈值（FDR = 0.05）。在比较MS与NWH时，对比显示出更广泛的不同特征，有10个鞘脂变量在FDR校正后仍然显著。同样，所有显著的脂质都显示出正的对数变化倍数，表明MS中的含量高于NWH。最显著的信号是LacCer 16（log2FC 1.050，FDR 0.0051）和DHCer 18:0（log2FC 1.037，FDR 0.0051），其次是Cer 24:1、DHCer 16、LacCer 24:1和CER18/24。与EO相比，MS的特征扩展到了Cer 18、Cer 20、Cer 16和SM 18:1，这与代谢更严重的表型相关的更广泛的鞘脂扰动一致（图3B）。

在进行PCA分析时（图4），总体上，PC1解释了总方差的61.2%，PC2解释了10.8%，累积的双组分方差为72.0%。因此，整个鞘脂数据集的主要结构主要由一个強大的第一组分和一个虽然较为温和但仍然可解释的第二组分捕获。

4.1. PBMC鞘脂组学与免疫代谢重塑
本研究证明，PBMC中的鞘脂分析可以识别出与EO和MS相关的独特细胞内免疫代谢特征[23]。与反映系统脂质运输和器官间交换的循环脂质测量不同，PBMC鞘脂组学提供了对免疫细胞内脂质代谢的直接洞察，从而更紧密地捕捉与炎症和代谢重编程相关的过程[24]。在这种情况下，观察到的变化并不影响整个鞘脂组，而是局限于特定的脂质种类，表明代谢功能障碍表现为选择性和协调性的重塑，而不是脂质含量的普遍增加[25]。

4.2. 鞘氨醇、二氢鞘氨醇及其从头合成途径
在改变的脂质类别中，鞘氨醇和二氢鞘氨醇成为代谢特征的核心成分[26]。Cer 18和Cer 24:1的增加，以及DHCer 16和DHCer 18的升高，与从头合成鞘脂途径的激活一致，这种途径在营养过剩和脂毒应激条件下会被上调[27]。二氢鞘氨醇作为这一途径的中间产物，越来越被认为是代谢紊乱的早期指标，其在PBMC中的积累表明免疫细胞在应对系统代谢失衡时发生了代谢重编程[28]。这种模式支持这样一种假设：免疫细胞内的鞘氨醇代谢可能积极地促进了与EO和MS相关的炎症反应的传播[29]。

4.3. 糖鞘脂与免疫细胞激活
与鞘氨醇的增加同时，糖鞘脂（包括HexCer 24:1、LacCer 16和LacCer 24:1）的显著升高表明下游鞘脂代谢途径的激活[30]。这些分子在膜组织和信号转导中起着关键作用，特别是在免疫细胞中[31]。特别是乳糖鞘氨醇已被牵涉到促炎信号级联和氧化应激途径的激活中[32]。因此，它们在PBMC中的水平升高表明，鞘脂重塑不仅是一种代谢现象，还与免疫激活功能相关，可能有助于EO和MS所特征的慢性低度炎症[33]。

4.4. 鞘氨醇比率指数作为综合标志物
本研究的一个特别相关发现是鞘氨醇比率指数的持续变化，包括CER16/24、CER18/24和CER24:1/24[34]。这些指数反映了鞘氨醇种类相对组成的变化，而不是它们的绝对浓度，提供了对鞘脂重塑质量方面的洞察[35]。观察到的这些比率的增加表明向较短链或单不饱和鞘氨醇的转变，这种模式可能会影响膜 properties 和细胞内信号通路[36]。值得注意的是，这些基于比率的变量在多变量模型中贡献显著，突显了它们作为代谢功能障碍敏感综合标志物的潜力[37]。

4.5. 从EO到MS的代谢连续体
多变量分析，包括PCA和聚类方法，揭示了NWH受试者和EO/MS患者之间的明显分离，同时也显示了EO和MS之间的显著重叠[38]。这种模式表明这些状况并不代表离散的类别，而是代谢失调连续体上的不同阶段[39]。从NWH受试者到EO和MS的鞘脂改变逐渐增加进一步支持了这一解释，表明随着代谢状态的恶化，细胞内脂质重塑加剧[40]。

4.6. 有限的单变量关联和多变量复杂性
尽管在群体层面观察到了明显的差异，但在适当校正多重检验后，单变量回归分析仅揭示了少数几个鞘脂与心血管代谢参数之间的显著关联[41]。特别是，CER24:1/24与脂肪指标（如BMI和WC）相关，而舒张压（DBP）与Cer 18、Cer 24:1和DHCer 18相关[42]。虽然这些关联在统计上显著且在生物学上是合理的，但它们的效应大小较小，仅解释了一小部分方差[43]。这种大群体水平差异与单变量关联之间的明显差异表明，PBMC中的鞘脂重塑并非由单一临床变量驱动，而是反映了多个相互作用因素的综合影响，尽管在本研究中仅考虑了有限的（主要是心血管代谢）因素[44]。多变量脂质特征的主导性
与这一解释一致，多变量分析表明，研究组之间的差异是由复合脂质特征而非单一脂质种类所驱动的[45]。主成分分析（PCA）显示，总体脂质丰度对主要变化轴有贡献，而神经酰胺组成的细微变化则是导致组间分离的原因[46]。同样，偏最小二乘判别分析（PLS-DA）仅显示出中等程度的分类性能，EO（炎症性关节病）和MS（多发性硬化症）之间存在部分重叠，进一步支持了这些病症背后存在共同代谢途径的概念[47]。这些发现强调，鞘脂代谢作为一个协调的网络运作，其失调可以通过多变量方法更有效地捕捉到[48]。

4.8. 生物学和临床意义
从生物学角度来看，观察到的鞘脂谱可能反映了脂肪酸可用性增加、从头合成途径的激活、酰基链组成的变化以及免疫细胞内膜结构的改变的综合效应[49]。这些过程与炎症信号传导密切相关，表明鞘脂代谢可能是代谢应激和免疫激活之间的关键接口[50]。
从临床角度来看，识别出特定的细胞内鞘脂特征表明，外周血单核细胞（PBMC）的脂质分析可能提供代谢功能障碍的新生物标志物[51]。重要的是，结果表明，复合脂质特征或基于比率的指数可能比单一脂质种类更具信息量，这可能对风险分層和治疗靶向具有潜在意义[52,53,54]。

4.9. 局限性和未来方向
应考虑几个局限性。横断面设计排除了因果推断的可能性，尽管样本量足以进行探索性脂质组学分析，但它可能限制了较弱关联的检测。本研究的另一个局限性是选择NWH（正常健康）对照者来自医疗和护理人员的朋友和亲属，这可能会引入选择偏倚，并限制研究结果在更广泛人群中的普遍性。此外，PBMC代表了一个异质性的免疫细胞群体，无法分辨特定细胞的脂质变化。未来需要结合细胞类型特异性分析和纵向设计的研究，以进一步阐明鞘脂代谢在免疫代谢调节中的作用。本研究的最后一个局限性涉及讨论中采用的解释框架。虽然我们试图将发现置于一个合理的病理生理学框架内，将PBMC鞘脂重塑与免疫代谢功能障碍联系起来，但其中一些解释仍然是初步的、部分基于机制的。鉴于研究的横断面设计，无法建立时间或因果关系，观察到的关联不应被视为潜在生物机制的证据。相反，这些解释应被视为假设生成，需要在未来的纵向或前瞻性研究中得到确认，这些研究更适合定义因果关系并验证所提出的机制联系。

5. 结论
本研究显示，PBMC的鞘脂组学分析识别出与EO和MS相关的一种选择性和协调的细胞内脂质特征。与传统基于血浆的分析不同，这种方法能够捕捉到免疫细胞特异性的代谢重塑，提供了关于代谢与炎症相互作用的补充性和更具信息量的视角。一个关键发现是，鞘脂的变化并不是普遍的，而是涉及有限的神经酰胺、二氢神经酰胺、糖鞘脂和神经酰胺比率指数，表明细胞内脂质代谢发生了结构性的重新编程。特别是，神经酰胺比率在组间区分中起着重要作用，支持它们作为鞘脂重塑的综合指标。多变量分析进一步表明，EO和MS在脂质组学谱上有显著重叠，符合代谢连续性的概念，但仍可与NWH受试者区分开来。重要的是，该研究强调了两个概念上不同但互补的意义：从生物标志物的角度来看，PBMC鞘脂特征——尤其是基于比率的指数和多变量模式——可能作为代谢功能障碍的综合指标，反映了脂肪沉积、炎症和心血管代谢改变的综合影响；从机制角度来看，观察到的脂质变化提供了细胞内免疫代谢重塑的证据，支持鞘脂代谢在代谢应激和免疫激活之间的联系。然而，鉴于研究的横断面和探索性设计，这些机制性见解应被视为假设生成，而不是定论性的。值得注意的是，单变量回归分析中观察到的有限关联表明，鞘脂变化并非由单一临床变量驱动，而是反映了复杂的多维代谢相互作用，这加强了多变量方法在脂质组学研究中的重要性。总的来说，本研究的主要结论是，基于PBMC的鞘脂组学为研究免疫代谢功能障碍提供了一个新颖且有信息量的框架，揭示了仅通过循环脂质测量无法检测到的细胞内过程。未来的研究需要在独立且更大的队列中验证这些发现，开发整合脂质组学和临床数据的预测模型，并探索靶向鞘脂途径的治疗潜力，特别是与神经酰胺代谢和免疫细胞激活相关的途径。纵向和机制性研究对于阐明因果关系和确立这些生物标志物在代谢疾病中的临床效用至关重要。

补充材料
以下支持信息可在以下网址下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/jcm15103634/s1
- 表S1：各研究组中药物治疗和代谢综合征标准的分布；
- 表S2：所有回归分析（显著脂质，每个预测因子的FDR值）。