《Genes》：The WAKL10 Gene Promotes Flg22-Triggered Immunity by Interacting with FLS2 and BAK1 in Arabidopsis
Lu Zhang,
Jiale Gao,
Lingya Yao and
Yunxia He
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背景/目的：细胞壁相关激酶（Wall-Associated Kinases, WAKs）及WAK样蛋白（WAK-like proteins, WAKLs）构成了植物中独特的类受体激酶亚家族，已知其通过感知细胞壁衍生组分（如果胶或果胶片段）调控植物发育与防御反应
背景/目的：细胞壁相关激酶（Wall-Associated Kinases, WAKs）及WAK样蛋白（WAK-like proteins, WAKLs）构成了植物中独特的类受体激酶亚家族，已知其通过感知细胞壁衍生组分（如果胶或果胶片段）调控植物发育与防御反应。本研究旨在阐明WAKL10在拟南芥flg22触发免疫中的作用。方法：通过对拟南芥WAKL基因的功能分析，研究人员发现WAKL10是响应flg22处理诱导最显著的WAKL成员。研究采用了功能获得和功能缺失遗传分析，评估其在flg22触发的免疫反应（包括丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK）激活、活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）爆发和防御基因诱导）中的作用。构建了表达激酶结构域缺失突变体（WAKL10-ΔK）的转基因拟南芥植株，并通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）实验检测其与FLAGELLIN-SENSITIVE 2（FLS2）和BRI1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE 1（BAK1）的相互作用。此外，还在番茄中进行了WAKL10的异源过表达以测试细菌病害抗性。结果：WAKL10正向调控flg22触发的免疫反应。有趣的是，WAKL10-ΔK保留了增强这些反应的能力。Co-IP实验表明，野生型WAKL10和WAKL10-ΔK均组成型地与FLS2和BAK1结合。在番茄中过表达WAKL10可赋予增强的细菌病害抗性。结论：WAKL10的细胞外结构域促进了FLS2-BAK1复合物的形成，从而有助于flg22信号传导。该研究揭示了WAKLs除感知细胞壁组分之外的全新功能。WAKL10的功能保守性表明其在作物抗病工程改良中具有潜在应用价值。
研究背景
植物拥有一套复杂且多层的免疫系统，使其能够应对病原体侵染并维持生长发育。该系统主要由模式触发免疫（Pattern-Triggered Immunity, PTI）和效应因子触发免疫（Effector-Triggered Immunity, ETI）两个相互关联的防御层级构成。PTI作为植物免疫的第一道防线，由质膜驻留的模式识别受体（Pattern Recognition Receptors, PRRs）感知保守的微生物分子模式（Pathogen-Associated Molecular Patterns, PAMPs）或损伤相关分子模式（Damage-Associated Molecular Patterns, DAMPs）所启动。在拟南芥中，富含亮氨酸重复序列的类受体激酶（Leucine-Rich Repeat Receptor-Like Kinases, LRR-RLKs）FLS2和EFR分别是鞭毛蛋白衍生肽flg22和延伸因子Tu表位elf18的特异性受体。当配体结合后，PRRs通常会与共受体（如BAK1/SERK家族成员）结合，形成活性复合物以激活下游信号级联反应，引发钙内流、活性氧（ROS）爆发、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）激活等一系列细胞反应，最终重编程防御基因表达以建立有效的抗病屏障。
在众多PRR家族中，细胞壁相关激酶（WAKs）及相关的WAK样激酶（WAKLs）构成了一个独特的类受体激酶亚家族，其功能被描述为细胞壁完整性的关键传感器，介导细胞壁与细胞质间的通讯。然而，尽管已知某些WAK成员能够识别细胞壁果胶衍生的损伤相关分子模式（如寡聚半乳糖醛酸），但WAKLs在PTI信号中的具体作用机制仍不完全清楚。本研究聚焦于WAKL10，旨在深入解析其在flg22触发的PTI信号通路中的功能及分子机制。
技术方法概述
研究人员主要通过生物信息学分析鉴定了受flg22诱导的WAKL家族成员。利用遗传学手段构建了WAKL10的过表达株系（Est:WAKL10-HA）和T-DNA插入突变体（wakl10-1），以及激酶结构域缺失突变体（Est:WAKL10-ΔK-HA）。通过免疫共沉淀（Co-IP）和免疫印迹（Immunoblotting）技术分析蛋白间的物理相互作用。采用RT-qPCR检测基因转录水平，利用发光法测定ROS爆发，通过气相色谱法定量乙烯产生，并使用磷酸化ERK抗体检测MAPK激活情况。此外，通过农杆菌介导的花器官侵染法获得了转基因番茄植株，并在拟南芥和番茄中进行了丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae pv. tomato, Pst）DC3000的抗病性测定。
研究结果
3.1 WAKL10是flg22处理后响应最强烈的WAKL成员
通过对拟南芥基因组中14个含有典型N端WAK结构域的WAKL家族成员进行系统发育分析和保守结构域注释，研究人员发现它们共享多个保守域。进一步的RT-qPCR分析显示，flg22处理能显著诱导多个WAKL基因（如WAKL2, WAKL4, WAKL6和WAKL10）的转录表达。其中，WAKL10的诱导最为显著，在处理后30分钟达到峰值，约为处理前基础水平的75倍，表明WAKL10可能在flg22触发的免疫中发挥关键作用。
3.2 WAKL10正向调控flg22触发的免疫
利用可诱导的过表达株系（Est:WAKL10-HA）和突变体（wakl10-1）进行的遗传分析表明，WAKL10是flg22触发免疫的正向调节因子。在过表达植株中，外源性诱导WAKL10表达能够显著增强flg22诱导的MPK3和MPK6激活、ROS爆发、乙烯生物合成以及防御标记基因PR1和PDF1.2b的上调。相反，在wakl10-1突变体中，flg22触发的MAPK激活、ROS爆发以及PR1和PDF1.2b的诱导均受到削弱，证实了WAKL10在促进PTI信号输出中的必要性。
3.3 WAKL10促进拟南芥中FLS2-BAK1受体复合物的组装
鉴于FLS2和BAK1是flg22信号的核心受体复合物，研究人员探究了WAKL10是否与该复合物存在物理联系。Co-IP实验结果显示，WAKL10在有无flg22刺激的情况下均能组成型地与FLS2和BAK1相互作用。进一步分析表明，在过表达植株中诱导WAKL10增加了flg22诱导的FLS2-BAK1复合物丰度，而在wakl10-1突变体中，这种复合物的形成则受到损害。这提示WAKL10通过促进FLS2与BAK1的组装来增强flg22信号感知。
3.4 WAKL10促进flg22触发免疫的功能不依赖于其细胞内激酶结构域
为了探究WAKL10发挥功能的域结构基础，研究人员构建了激酶结构域缺失突变体WAKL10-ΔK。Co-IP实验证实，WAKL10-ΔK仍能像全长蛋白一样与FLS2和BAK1相互作用。功能分析显示，诱导表达WAKL10-ΔK同样能够显著增强flg22诱导的MAPK激活、ROS爆发、乙烯产生以及防御基因的转录。这表明WAKL10的细胞内激酶结构域并非其促进flg22触发免疫所必需，暗示其细胞外结构域在促进FLS2-BAK1复合物组装中起主导作用。
3.5 在拟南芥和番茄中过表达WAKL10赋予对细菌病原体Pst DC3000的抗性增强
基于WAKL10在增强拟南芥PTI和抗性中的作用，研究人员进一步评估了其应用潜力。在拟南芥中，诱导WAKL10表达显著提高了对Pst DC3000的抗性。此外，将Est:WAKL10-HA构建体转化到番茄（Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom）中，获得的转基因番茄植株在诱导WAKL10后，不仅对flgII-28（另一种鞭毛素表位）触发的MAPK激活、乙烯诱导和防御基因SlPR1b、SlWRKY33的上调有显著增强，而且对Pst DC3000的抗性也显著提高，证明了WAKL10在跨物种间的功能保守性。
讨论与结论
本研究揭示了WAKL10在植物免疫中的一种新机制，即不同于传统认知中WAKs/WAKLs作为细胞壁果胶传感器的角色，WAKL10通过其细胞外结构域促进LRR-RLK型PRR（FLS2）与共受体（BAK1）的复合物组装，从而增强flg22信号的感知与转导。这一发现拓展了人们对WAKL家族功能的认知。尽管WAKL10-ΔK保留了大部分功能，但全长WAKL10引发的免疫反应略强于突变体，提示激酶结构域可能具有细微的调节作用。此外，WAKL10在番茄中的成功应用展示了其在作物抗病遗传改良中的巨大潜力。该研究由Lu Zhang, Jiale Gao, Lingya Yao和Yunxia He共同完成，已发表于《Genes》期刊。
