利用舒氏裂褶菌TMF3在农业工业废弃物上实现可持续性的漆酶生产，以高效降解染料并进行全面毒性评估 Nevena Ili?, Anja Antanaskovi?, Jelena Filipovi? Tri?kovi?, Miona Miljkovi?, Ana Milivojevi?, Marija Mili? 以及 Katarina Mihajlovski

《Processes》：Sustainable Laccase Production by Schizophyllum commune TMF3 on Agro-Industrial Waste for Efficient Dye Degradation and Comprehensive Toxicity Assessment Nevena Ili?, Anja Antanaskovi?, Jelena Filipovi? Tri?kovi?, Miona Miljkovi?, Ana Milivojevi?, Marija Mili? and Katarina Mihajlovski

　　摘要：本研究探讨了在纺织废水处理中采用可持续方法的需求，通过使用白腐菌Schizophyllum commune TMF3和农业工业废弃物作为底物来生产漆酶。在优化条件下（1.75克麦芽提取物、75%湿度、7天、25°C），通过固态发酵在啤酒糟中生产了漆酶，最大活性达到21.06 IU/g干底物。将粗酶应用于偶氮染料和三苯甲烷染料的脱色（浓度为50 mg/L）。在60分钟内，无需氧化还原介质即可实现超过80%的脱色效率，同时所有测试染料的化学需氧量（COD）降低了50%以上。HPLC分析显示原始染料峰值减小，转化产物出现。抗菌活性测试显示对大肠杆菌、鼠李糖乳杆菌、白色念珠菌和酿酒酵母没有抑制作用，而在某些情况下观察到轻微的生长促进。使用小麦（Triticum aestivum）进行的植物毒性试验未发现抑制效果，发芽指数值为77-124%。细胞毒性评估显示偶氮染剂没有影响，而三苯甲烷染剂的细胞毒性在处理后降低了30%。这些发现支持了利用农业工业废弃物生产漆酶作为可持续废水处理中有效去除染料方法的潜力。

1. 引言
快速城市化、人口增长和工业化加速加剧了全球范围内的环境污染[1]。在主要环境挑战中，工业废水的排放对水生生态系统和人类健康构成了严重威胁[2]。纺织业由于在染色和整理过程中大量使用合成染料，被认为是水污染的主要来源之一。据估计，该行业占全球工业废水污染的近20%，而每年全球生产的合成染料超过700万吨[3,4]。合成染料不仅广泛应用于纺织业，还应用于印刷、造纸、塑料、皮革加工、化妆品和食品相关行业。根据其发色结构，它们被分为几类，包括偶氮染料、蒽醌染料、靛蓝染料和三苯甲烷染料，其中偶氮染料和三苯甲烷染料在工业应用中最常用[4]。由于它们复杂的芳香结构和高化学稳定性，这些化合物通常表现出强烈的抗自然降解能力。因此，含有染料的废水通常具有持久性，即使在低浓度下也可能产生毒性、致突变性或致癌作用[5]。此外，长期接触合成染料及其转化产物与不良健康效应有关，包括器官毒性和潜在的内分泌干扰，主要是通过受污染的水和食物链[2,6]。特别是偶氮染料如酸橙7（AO）和直接蓝1（DB）在环境或生物条件下可能发生还原断裂，形成芳香胺类物质，其中许多被认为是潜在的致癌化合物。类似地，三苯甲烷染料如孔雀石绿（MG）以其对水生生物和人类的明显细胞毒性、遗传毒性和生物累积性而闻名。这些特性大大增加了它们在废水系统中持久性所带来的环境和人类健康风险。

在水生环境中，含染料的废水排放会减少光线穿透，干扰光合作用过程，并对水生生态系统产生负面影响[6]。此外，即使低浓度的染料也会显著改变关键水质参数，如颜色、化学需氧量（COD）和溶解氧水平，从而降低水的可用性[7]。这些变化降低了水的透明度，并限制了氧气传递，导致受影响水生系统的生态平衡失调。在常用的工业染料中，MG、DB和AO由于其广泛使用和持久性而特别令人担忧。MG是一种阳离子三苯甲烷染料，以其高毒性和潜在的致癌性而闻名[8]。DB和AO属于常用于纺织染色的偶氮染料，具有高水溶性和环境持久性[9]。

用于从工业废水中去除染料的传统物理化学处理方法包括混凝-絮凝、吸附、膜过滤和化学氧化。尽管这些技术可以有效，但它们通常涉及较高的运行成本、污染物未完全矿化以及需要进一步处理的二次污泥的产生[10,11]。相比之下，生物策略基于酶和微生物活性，在环境友好的条件下能够将复杂的染料结构分解为毒性较低或完全矿化的产物[2,6]。虽然物理化学方法主要依赖于相转移或化学转化过程，可能会产生二次污染，但生物处理方法通过直接生物降解和去毒提供了更可持续的解决方案[7]。此外，生物方法通常在较温和的条件下操作，需要较低的能源输入，并产生较少的有害副产物，使其成为更环保的替代方案。这些限制激发了对可持续和环保的生物去除染料方法的兴趣增加。在生物策略中，基于酶的处理系统因其高催化效率以及在温和反应条件下运行的能力而受到广泛关注[12]。漆酶（EC 1.10.3.2）是一种多铜氧化酶，使用分子氧作为最终电子受体催化广泛的酚类和非酚类化合物的氧化，唯一的副产物是水[2,13]。由于其广泛的底物特异性，漆酶在降解和脱色结构多样的合成染料方面显示出显著潜力[14,15]。除了脱色之外，漆酶介导的反应还可以将复杂的染料分子转化为更简单、毒性较低的代谢物，从而降低其环境影响[15]。

白腐菌被认为是重要的天然氧化酶生产者，能够转化复杂的芳香化合物，包括合成染料[13,16]。近年来，越来越多的研究关注使用农业工业废弃物作为发酵底物来生产真菌酶，因为这种方法可以降低酶的生产成本，同时有助于农业废弃物的增值和循环生物经济发展策略[17,18]。在这方面，使用农业工业副产品对于可持续废物管理和更环保的废水处理过程尤为重要[17]。在此背景下，S. commune是一种担子菌，其用于染料降解的酶潜力相对于Trametes和Pleurotus等广泛研究的白腐菌而言仍相对较少[18,19,20]。特别是，关于使用农业工业废弃物生产漆酶以及应用粗酶制剂快速降解染料的研究仍然有限。此外，虽然许多研究主要关注染料脱色，但较少的研究通过全面的毒性评估来评估降解产物的环境安全性。因此，本研究旨在开发一种使用啤酒糟（BSG）补充麦芽提取物的可持续方法来生产漆酶TMF3。这种策略旨在克服S. commune本身有限的漆酶生产潜力，使其在高效酶生产和降解结构多样的染料（如MG、DB和AO）方面的应用不足。因此，本研究评估所获得的粗漆酶是否可以有效降解这些染料，同时降低COD和毒性，从而评估所提出方法的环境适用性。

2. 材料与方法
2.1. 样品材料和化学品
啤酒糟（BSG）是从塞尔维亚的一家当地啤酒厂获得的副产品。胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）、琼脂、酵母提取物、麦芽提取物肉汤和MRS肉汤从Torlak（贝尔格莱德，塞尔维亚）获得。酸橙7（AO）和孔雀石绿（MG）从Sigma-Aldrich（Merck KGaA，达姆施塔特，德国）购买，为商业染料制剂，规定染料含量分别为≥98%和≥90%。直接蓝1（DB）从MedChemExpress LLC（新泽西州蒙茅斯 junction，美国）购买，纯度为95%。愈创木酚（99+%）从Fisher Scientific（Acros Organics，比利时吉尔）购买。

2.2. 微生物
真菌菌株S. commune TMF3（登录号MW327505）、革兰氏阳性鼠李糖乳杆菌ATCC 7469、革兰氏阴性大肠杆菌ATCC 25922、白色念珠菌ATCC 10259和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae来自塞尔维亚贝尔格莱德技术与冶金学院生物化学工程与生物技术系的菌种库[21]。小麦种子（Triticum aestivum）从当地市场购买。

2.3. 接种物制备
S. commune TMF3培养物在麦芽提取物琼脂（20 g/L麦芽提取物和15 g/L琼脂）上维持，并在黑暗中25°C下培养6-7天。这个培养期确保了活性菌丝的生长，随后用作固态发酵的接种物。

2.4. 固态发酵
固态发酵（SSF）在含有20克干燥BSG的200毫升Erlenmeyer烧瓶中进行。根据表1中描述的实验设计，变化培养时间（天）、麦芽提取物（克）和湿度（%）。通过无菌蒸馏水调整湿度后，将底物在121°C下灭菌15分钟。冷却后，每个烧瓶接种5个1 × 1厘米的活性生长S. commune TMF3菌丝琼脂块，并在黑暗中25°C下静止培养规定的培养时间。漆酶提取按照Ili?等人的方法[22]进行。离心后获得的上清液被认为是粗漆酶提取物，随后按照Ili?等人[22]描述的方法进行部分纯化和浓缩。

表1. 独立变量及其水平。漆酶活性通过监测470 nm处的愈创木酚氧化来分光光度法测定，使用UV/Vis Ultrospec 3300 Pro分光光度计（Amersham Bioscience，英国白金汉郡Little Chalfont）。反应混合物由0.25毫升1 mM愈创木酚、0.75毫升醋酸钠缓冲液（pH 5.0）和0.25毫升粗真菌漆酶提取物组成。对照样品包含1.00毫升醋酸钠缓冲液（pH 5.0）和0.25毫升粗酶。所有测定在40°C下进行，该温度是美国Ili?等人[22]之前确定的最佳温度。漆酶活性（IU/mL和IU/g）根据Ili?等人[22]之前描述的方程计算。

2.5. 漆酶的表征
2.5.1. 漆酶的最佳温度和pH
使用愈创木酚作为底物，通过分光光度法评估漆酶的最佳pH，缓冲液pH范围从3到7，在30°C下进行。随后，在20-60°C范围内确定漆酶的最佳温度，使用0.1 M醋酸钠缓冲液（pH 5）中的愈创木酚。漆酶活性根据Ili?等人[23]之前描述的方程计算，酶活性以相对值表示，最大活性标准化为100%。所有实验重复三次，标准偏差小于±5%，所有结果代表三次测量的平均值。

2.5.2. 漆酶的热稳定性和pH稳定性
为了研究热稳定性，漆酶在0.1 M醋酸钠缓冲液（pH 5）中在不同温度（20-60°C）下培养240分钟。此外，通过在40°C下将酶在pH值从3到7的缓冲液中培养相同的时间来评估pH稳定性。漆酶活性根据Ili?等人[23]之前描述的方程计算，酶活性以残差形式表示，最大活性标准化为100%。所有实验重复三次，标准偏差小于±5%，所有结果代表三次测量的平均值。

2.6. 使用S. commune TMF3产生的漆酶降解染料
本研究评估了S. commune产生的粗细胞外漆酶在水介质中降解选定合成染料的适用性。酶活性测定使用了MG、AO和DB作为模型纺织品染料，每种染料的最初浓度均为50 mg/L，最终反应体积为10 mL。系统地研究了环境条件对染料去除效率的影响。脱色实验在pH值为3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和7.0的情况下进行，而反应温度则在30到60°C之间变化。所有测定持续了60分钟，以评估染料降解的程度和动力学。所有实验都重复三次，标准偏差小于±5%，所有结果代表三次测量的平均值。通过使用UV–Vis分光光度计测量每种染料特征最大波长处的吸光度降低来监测染料脱色情况。在整个反应过程中，每10分钟抽取一次样品。每个实验组中都包括了在相同实验条件下培养但未添加漆酶的染料溶液作为对照处理，以考虑非酶促染料去除情况。实验程序，包括样品处理和分光光度分析，以及计算脱色效率的方法，均按照我们之前研究[22]中描述的协议进行。脱色效率是根据吸光度相对于初始值的变化来确定的，如之前报道的[22]。脱色效率（%）= ((A0 ? At)/A0) × 100 (1)，其中A0是染料的初始吸光度，At是漆酶降解后的吸光度。

2.7. HPLC分析
样品使用Dionex Ultimate 3000 HPLC系统（ThermoScientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行分析，该系统配备有Zorbax Eclipse Plus C18反相柱（150 mm × 4.6 mm，粒径5 μm）（Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉）。流动相由（A）含0.1%甲酸的水和（B）丙烯腈组成。对于MG、AO和DB，分别使用80%、60%和40%的丙烯腈进行等度洗脱。流速为0.8 mL/min，柱温保持在30°C。进样量根据样品不同而有所变化，范围是5–40 μL。染料及其降解产物的检测使用UV/Vis检测器，在MG为600 nm和254 nm，AO为480 nm和248 nm，DB为594 nm和248 nm进行。

2.8. 化学需氧量的测定
化学需氧量（COD）使用Lovibond MD 610分光光度计（Tintometer GmbH，德国多特蒙德）进行测定。分析时，将2 mL的每种样品加入到含有10 mL预测量试剂的消化小瓶中，对应两个浓度范围：低范围（0–150 mg O2/L）和中范围（0–1500 mg O2/L）。对于这两个浓度范围，均用去离子水制备空白样品。小瓶密封后多次翻转以确保样品与试剂充分混合，然后将其放入Lovibond? RD 125热反应器（Tintometer GmbH，德国多特蒙德）中，在150°C下热消化2小时。消化结束后，将小瓶从反应器中取出，冷却至大约60°C，轻轻翻转几次以均匀化内容物，随后冷却至室温后进行分光光度测量。

2.9. 细胞毒性测试
2.9.1. 细胞培养和治疗
使用市售的人类胎儿肺成纤维细胞系MRC-5（CCL-17，ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯）进行细胞毒性评估。细胞在添加了10%胎牛血清（FBS，Capricorn Scientific，德国埃布斯多费尔格伦德）和1%抗生素-抗真菌剂（Gibco? Antibiotic-Antimycotic，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）的Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM，Gibco?，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）中培养，标准细胞培养条件为37°C和5% CO2。

2.9.2. 细胞毒性评估
根据标准程序[24]使用2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑ium-5-羧酸胺（XTT）测定法评估细胞毒性。简要来说，将细胞以每孔0.05 × 10^6个细胞的密度接种在24孔板中，并让其附着过夜。随后，细胞培养物与20% v/v的测试样品接触24小时。处理后，排掉细胞培养基，并用含有苯嗪甲硫酸盐（PMS）激活的XTT试剂洗涤细胞，然后在37°C下孵育，直至出现颜色变化。在微孔板读取器（Sunrise，Tecan Group Ltd.，瑞士门德多夫）上于470 nm处测量吸光度。结果以与未处理对照组的活细胞百分比（100%活细胞）表示。为了确认XTT测定结果，使用三目倒置显微镜（Optech，德国慕尼黑）和20倍放大物镜，配备OptikamB5 C-B5数字相机及Optika Proview成像软件（版本4.1）（Optika microscopes，意大利蓬特拉尼卡）监测细胞形态。

2.9.3. 统计分析
结果以平均值±标准误差的形式呈现。所有实验都设置了两个重复组，并重复进行了两次。统计分析使用SPSS 10统计软件包（IBM，美国阿蒙克）进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。p值< 0.05被视为显著性水平。

2.10. 微生物对染料及其漆酶衍生代谢物的反应评估
为了评估三种合成染料（MG、AO和DB）及其在漆酶介导的脱色后产生的转化产物的生物效应，选用了选定的微生物菌株。评估使用了L. rhamnosus ATCC 7469、E. coli ATCC 25922、C. albicans ATCC 10259和剩余的啤酒酵母S. cerevisiae。实验设计和测试程序遵循Ili?等人[23]之前报告的方法。染料溶液及其经漆酶处理的样品使用无菌介质制备，并在抗菌测试前在无菌条件下操作。

2.11. 漆酶处理染料的植物毒性评估
使用小麦种子（T. aestivum）研究了染料（MG、AO和DB）及其酶促降解产物的植物毒性潜力。该研究旨在确定漆酶介导的脱色如何影响植物的生长和发育。实验设置和程序遵循Ili?等人[22]描述的方法。

3. 结果
3.1. 漆酶的产生
3.1.1. 模型拟合和过程变量评估
为了优化S. commune TMF3的漆酶产生，应用了Box–Behnken实验设计来评估三个独立变量对酶活性的影响。系统地改变了培养时间（A）、麦芽提取物添加量（B）和水分含量（C），以评估它们对固态发酵过程中干BSG上漆酶活性的单独和组合效应（表2）。表2显示了Box–Behnken实验设计矩阵及实际因子水平和观察到的漆酶活性。根据实验结果，数据被拟合为一个二阶多项式模型，用编码变量表示如下：
Y = 20.36 + 2.77A + 1.08B ? 2.87C ? 3.43AC + 1.71BC ? 7.38A2 ? 6.70B2 ? 7.33C2 (2)
其中Y代表漆酶活性（IU/g），A是培养时间（天），B是麦芽提取物（g），C是水分含量（%）。ANOVA结果（表3）确认该模型具有高度显著性（F = 197.94，p < 0.0001）。高决定系数（R2 = 0.9961），以及调整后的R2（0.9911）和预测的R2（0.9704），表明实验值与预测值之间有极好的一致性。拟合不足不显著（p = 0.4980），证实该模型能够很好地描述该系统。Adeq. Precision值35.744表明信号与噪声比率令人满意，进一步支持了模型的稳健性。

3.2. 选定的过程变量对S. commune TMF3漆酶产生的影响
S. commune TMF3的漆酶活性显著受到培养参数的影响，特别是培养时间、麦芽提取物浓度和水分含量（表2和表3）。扰动图（补充材料图S1）显示水分含量具有最强的影响，其次是培养时间和麦芽提取物。观察到的曲线证实了存在二次效应和明确的最优值，而不仅仅是简单的线性关系。数值优化预测在培养9.54天、麦芽提取物1.80 g和水分含量71.38%时，漆酶活性达到最大值21.06 IU/g（可取性=1）。这个值明显高于之前使用BSG作为唯一底物在非优化条件下获得的2.79 IU/g的活性[25]。

3.2.2. S. commune TMF3的漆酶生产
S. commune TMF3的漆酶活性显著受到培养参数的影响，尤其是培养时间、麦芽提取物浓度和水分含量（表2和表3）。培养时间与麦芽提取物之间的交互作用（A × B）显示出统计学上的显著但中等效应（表3）。初始时，这两个变量的同时增加导致漆酶活性增加，但随后在较高水平时活性下降（图1a）。培养时间表现出明显的二次效应，活性先增加达到最大值，然后下降。图1展示了三种交互作用对漆酶活性的影响：(a) AB；(b) AC；(c) BC。培养时间与水分含量之间的交互作用（A × C）也非常显著（表3）。在定义的水分范围内，延长的培养时间增强了漆酶的产生，而在较高水分水平下则降低了酶活性（图1b）。

3.3. S. commune TMF3产生的漆酶的特性
3.3.1. 最适pH值和温度
使用间苯二酚作为酚类底物，研究了pH值对S. commune TMF3产生的漆酶活性的影响，pH范围为3.0–8.0。该酶显示出明显的钟形活性曲线（图2a）。在pH 3.0时，活性较低（18.7%），逐渐增加到pH 3.5时的42.3%，pH 4.0时为59.1%，然后在pH 4.5时显著上升至84.6%。最大活性（100%）出现在pH 5.0，表明这是S. commune TMF3漆酶的最佳pH值。图2显示了漆酶的最佳pH值和温度，以及pH值和热稳定性：(a) pH的影响；(b) 温度的影响；(c) pH稳定性；(d) 温度稳定性。超过最佳pH值后，活性逐渐下降，在pH 5.5时降至92.1%，pH 6.0时为73.8%，pH 6.5时降至60.1%，在更高pH值时急剧下降（pH 7.0时为39.2%，pH 8.0时为15.1%）。除了pH值，温度是影响漆酶活性的另一个关键因素。使用间苯二酚作为底物，在20–60°C范围内评估了温度对S. commune TMF3产生的漆酶相对活性的影响（图2b）。该酶显示出明显的温度依赖性活性模式，随着温度升高而逐渐增加，达到一个最佳值，然后在更高温度下急剧下降。在20°C时，漆酶活性相对较低（27.5%），但在25°C（51.2%）和30°C（68.9%）时显著增加。温度进一步升高时，活性进一步提高，在35°C时达到最大相对活性（100%），确定此温度为S. commune TMF3漆酶的最佳温度。超过这个温度后，酶活性逐渐下降，在45°C时为88.7%，在50°C时为65.4%。在更高温度下，活性显著下降，在55°C时仅剩20.8%，在60°C时降至23.9%，表明酶在其最佳温度以上具有温度敏感性。

3.3.2. 漆酶的pH稳定性和热稳定性
通过在不同的pH值（3.0–8.0）下孵育酶最多240分钟来评估S. commune TMF3产生的漆酶的pH稳定性，之后在标准测定条件下测量剩余活性（图2c）。在孵育开始时（0分钟），酶在所有测试的pH值下都保持了全部活性（100%）。然而，长时间孵育显示出依赖于pH值的稳定性差异。在强酸性pH 3.0下，酶活性随时间迅速下降，60分钟后剩余活性降至78.3%，120分钟后降至56.7%，240分钟后仅剩21.3%。在pH 3.5下观察到了类似但不太明显的趋势，240分钟后剩余活性为38.7%。相比之下，在中等酸性pH值（4.0–5.5）下孵育的漆酶表现出显著更高的稳定性。在pH 5.0时，这是酶活性的最佳pH值，漆酶在120分钟后仍保留了94.8%的初始活性，在240分钟后保留了85.6%的初始活性。在pH 4.5和5.5下也观察到了类似的稳定性，分别在240分钟孵育后保留了超过78%和81%的残余活性。在接近中性的pH值下，稳定性逐渐下降。在pH 6.0时，残余活性在240分钟后下降到74.6%；而在pH 6.5和7.0时，酶分别保留了57.8%和41.2%的活性。在所有测试条件下，pH 8.0下的稳定性最低，240分钟后残余活性下降到28.8%。这些结果表明，S. commune TMF3漆酶在微酸性pH范围内（特别是pH 4.5到5.5之间）最为稳定，而长期暴露在强酸性或碱性条件下会导致酶逐渐失活。在对pH稳定性进行评估后，通过将漆酶在不同温度（40–60 °C）下孵育240分钟，并在标准测定条件下测定残余活性，研究了S. commune TMF3产生的漆酶的热稳定性。在孵育开始时，酶在所有测试温度下都保持了完全的活性（100%）。然而，长时间暴露后活性随温度和时间的增加而下降。在酶活性的最佳温度40 °C下，漆酶在120分钟后仍保留了96.3%的初始活性，在240分钟后保留了91.7%的初始活性。在45 °C下也观察到了同样高的稳定性，120分钟后残余活性为92.8%，240分钟后为84.7%。在50 °C下，酶的稳定性有所下降，120分钟后保留了86.7%的活性，240分钟后为63.5%。在更高温度下，活性损失更为明显。在55 °C时，残余活性在120分钟后下降到79.6%，240分钟后进一步下降到42.7%。在60 °C下，热稳定性最低，120分钟后仅保留了68.9%的活性，长时间孵育后活性显著降低到25.4%。这些结果表明，S. commune TMF3漆酶在适中酸性范围内最为稳定，而长期暴露在强酸性或碱性条件下会导致酶逐渐失活。

接下来评估了S. commune TMF3产生的漆酶的热稳定性。通过将酶在不同温度（40–60 °C）下孵育240分钟，并在标准测定条件下测定残余活性来研究其热稳定性。在孵育开始时，酶在所有测试温度下都保持了完全的活性（100%）。然而，长时间暴露后活性随温度和时间的增加而下降。在酶活性的最佳温度40 °C下，漆酶在120分钟后仍保留了96.3%的初始活性，在240分钟后保留了91.7%的初始活性。在45 °C下也观察到了同样高的稳定性，120分钟后残余活性为92.8%，240分钟后为84.7%。在50 °C下，酶的稳定性有所下降，120分钟后保留了86.7%的活性，240分钟后为63.5%。在更高温度下，活性损失更为明显。在55 °C时，残余活性在120分钟后下降到79.6%，240分钟后进一步下降到42.7%。在60 °C下，热稳定性最低，120分钟后仅保留了68.9%的活性，长时间孵育后活性显著降低到25.4%。这些结果表明，S. commune TMF3漆酶在适中温度下相对稳定，但在高于50 °C的温度下长时间暴露会导致酶显著失活。

3.3 使用S. commune TMF3漆酶进行染料脱色
评估了温度和pH值对S. commune TMF3漆酶脱色效率的影响，使用了浓度为50 mg/L的AO、DB和MG染料（图3）。在30分钟和60分钟后评估了脱色效果，以便与之前报道的基于漆酶的系统进行直接比较，后者通常需要更长的处理时间。图3显示了pH值和温度对S. commune TMF3漆酶对AO、DB和MG脱色效率的影响：(a,b) AO；(c,d) DB；(e,f) MG。对于偶氮染料AO和DB，在40 °C和pH 5时观察到最佳脱色效果。DB在30分钟内脱色率达到75.5%，60分钟后达到81.1%；而在pH 7和30°C时脱色效果最差（14.25%）。AO也显示出相似的趋势，在30分钟后脱色率达到72.23%，60分钟后达到83.57%；而在pH 3和30°C时脱色效果最差（17.8%）。对于MG，在45 °C和pH 5时达到最大脱色效果，30分钟后脱色率达到78.79%，60分钟后达到88.07%；而在pH 3时60分钟后脱色效果仅为8.18%。

3.4 HPLC分析
在不同波长下记录的MG色谱图显示，经过漆酶处理后母体染料的含量明显减少。在600 nm波长（MG的特征波长）下，对照样品显示出一个主要峰，而在处理后的样品中该峰显著减弱（补充材料图S2）。这证实了染料有一部分被去除。在254 nm波长下，处理后的样品中出现了几个额外的峰，表明形成了降解产物。然而，这些信号应谨慎解释，因为可能还有来自酶制备的化合物的干扰。AO也表现出类似的趋势。在480 nm波长下，处理后主峰明显减弱，并出现了新的峰（补充材料图S3），表明染料发生了转变。在248 nm波长下，峰的位置向较短保留时间移动，这可能表明形成了更极性的产物。与MG的情况类似，这一波长下的解释不够具体，因为可能存在基质干扰。

3.5 化学需氧量（COD）
在本研究中，通过酶促脱色后的COD测量评估了S. commune TMF3漆酶降低含染料溶液有机负荷的有效性。对于MG，初始COD值为1472 mg/L，经过漆酶处理后降低到239.4 mg/L，减少了84.0%。这一显著减少不仅表明了有效的颜色去除，还表明有机化合物的广泛降解，这些有机化合物是污染负荷的来源。对于偶氮染料，处理前的初始COD值分别为AO的1632 mg/L和DB的2002 mg/L。经过漆酶介导的脱色后，COD值分别降至810 mg/L和618 mg/L，分别减少了50.37%和69.13%。这些结果表明，S. commune TMF3漆酶能够显著降低偶氮染料溶液的有机负担，尽管COD的减少程度取决于染料的结构。

3.6 细胞毒性
在本研究中，测试的染料及其降解产物对细胞活力有明显的影响（图4和补充材料图S5）。未经处理的AO、降解后的AO、DB以及降解后的DB相对于对照组显示出了促进细胞生长的效果，而MG及其降解产物显著降低了细胞活力。在所有测试样本中，MG的细胞毒性最强，使细胞活力降低了近50%（p < 0.001）。尽管漆酶处理显著降低了MG的毒性，使细胞活力增加了近30%（p < 0.001），但仍有残留的毒性，表明某些转化产物可能仍保留有生物活性。AO和DB在经过漆酶处理后细胞活力的增加可能是由于复杂的染料分子转化为了毒性较低、分子量较小的化合物。这种效果在降解后的AO中尤为明显，其细胞活力比未经处理的染料提高了约20%（p < 0.001）。相比之下，DB及其降解产物之间没有显著差异，这表明在测试条件下其细胞毒性没有显著改变。

3.7 抗微生物测试
在本研究中，评估了选定的染料（AO、DB和MG）在漆酶介导的降解前后对大肠杆菌（E. coli）、鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）、白色念珠菌（C. albicans）和酿酒酵母（S. cerevisiae）生长的影响。结果以生长抑制或促进的百分比表示（表4）。表4显示了初始染料及其降解产物对微生物的影响。AO对所有测试的微生物都表现出抑制作用，其中对大肠杆菌的抑制作用最强（21.86%），对白色念珠菌的抑制作用最弱（5.94%）。降解后，这种作用发生了变化，大肠杆菌的生长略有促进（2.75%），而酿酒酵母的生长受到了显著促进（34.21%）。DB对大肠杆菌和白色念珠菌的抑制作用分别为7.58%和9.25%。降解后，所有测试微生物的生长抑制作用都转变为促进作用，包括大肠杆菌（4.79%）、鼠李糖乳杆菌（9.41%）、白色念珠菌（5.15%）和酿酒酵母（9.68%）。MG在所有测试染料中表现出最强的抑制作用，特别是对鼠李糖乳杆菌（98.14%）和白色念珠菌（96.89%），对大肠杆菌的抑制作用为58.19%。降解后，抑制作用显著减弱，大肠杆菌和酿酒酵母的生长分别得到了促进（24.43%和17.37%），而大肠杆菌的促进作用较弱（4.79%和3.83%）。

3.8 植物毒性
在本研究中，使用发芽指数（GI）评估了植物毒性。GI值在25–65%之间表示植物毒性，超过65%表示无植物毒性，超过101%表示具有植物促进作用[22]。在酶处理前，所有测试的染料都表现出植物毒性。用AO和DB处理的小麦种子的GI值分别为27.91%和59.06%，而MG的GI值为43.62%，证实了其对发芽的抑制作用（补充材料图S5）。经过S. commune TMF3粗漆酶处理后，植物毒性显著降低。AO的GI值增加到77.57%，表明植物毒性完全消失。此外，DB和MG的降解产物表现出植物促进作用，GI值分别为124.09%和103.12%（补充材料图S5）。这些发现表明，粗漆酶处理不仅可以解毒染料，还可以产生促进种子发芽的代谢物。

4. 讨论
S. commune是一种能够产生木质素分解酶（包括漆酶）的木质腐生担子菌[19,25]；然而，与Trametes和Pleurotus等属相比，对其的研究较少[19,20]。关于S. commune在固态发酵中产生漆酶的研究相对有限，且经常需要使用化学诱导剂来刺激酶的合成[26]。另一方面，目前的结果表明，在优化条件下（孵育时间9.54天，1.80克麦芽提取物，水分含量71.38%），BSG可以作为漆酶生产的有效底物，最大活性为21.06 IU/g（表2）。与之前的研究相比，在优化条件下漆酶活性的显著增加突显了SSF系统工艺优化的重要性。例如，在非优化条件下（30 °C，6天，无麦芽提取物），S. commune TMF3仅产生2.79 IU/g的漆酶[25]。酶生产依赖于孵育时间的特性反映了典型的真菌生长动力学，即漆酶合成与活跃的菌落形成有关，并在后期由于营养耗尽而减少[23]。虽然BSG本身为真菌生长提供了营养基础，但其组成并不一定能确保最佳的酶合成。因此引入了麦芽提取物作为易于吸收的碳源来支持真菌生长和漆酶生产[25]。麦芽提取物的添加表现出非线性效应：适量浓度（约1.80克）增强了漆酶的生产，而过高浓度则导致了抑制（图1c）。这种行为与担子菌中的碳代谢物抑制机制一致，即过量的易代谢碳会抑制次级代谢，包括木质素分解酶的合成[20]。水分含量被认为是影响酶生产的最关键因素[27,28]。最佳的水分含量（约71–75%）确保了足够的营养溶解度和真菌代谢，同时保持了底物的多孔性和氧气传递。过高的水分含量（例如90%）会显著降低酶活性至2.20 IU/g（图1b），可能是由于氧气供应受限，因为分子氧是漆酶活性所需的最终电子受体[29,30]。工艺变量之间的显著相互作用进一步强调了SSF系统的复杂性。强烈的A × C相互作用（孵育时间 × 水分）表明孵育时间的影响高度依赖于水分水平，而B × C相互作用（麦芽提取物 × 水分）表明碳补充的效率受底物水合程度的影响。例如，在1.75克麦芽提取物条件下，60%水分时的漆酶活性为14.89 IU/g，而在75%水分时增加到21.06 IU/g，然后在90%水分时急剧下降（图1c）。这些发现证实了实现最大漆酶生产需要平衡的工艺条件。与文献数据的比较显示，根据底物类型、培养模式和诱导剂的使用情况，结果存在相当大的变异性。例如，在耶路撒冷洋蓟茎的SSF（固态发酵）过程中未检测到漆酶活性[31]，而在经过碱性预处理的木质纤维素基底上进行 submerged cultivation（浸泡培养）时仅观察到低活性（1-4 IU/mL）[32]，并且在纯纤维素（Avicel-PH101）上未观察到任何活性。有报道称，在香蕉茎的SSF中可以观察到较高的活性（6天后可达367 IU/mL），但这仅在铜和ABTS等诱导剂存在的情况下才能实现[26]。本研究证明，在无诱导剂条件下，BSG（细菌固态发酵）也可以实现竞争性漆酶的产生（21.06 IU/g），这支持了农业工业废弃物在可持续生物加工策略中的潜在价值。

pH值对漆酶活性的影响是一个关键参数，它决定了酶的性能及其在生物技术过程中的应用潜力。获得的结果与先前的研究一致，表明真菌漆酶通常在酸性pH范围（3.0–5.5）内对酚类底物表现出最大活性，随后在中性和碱性pH值下活性迅速下降[23,33]。表5总结了文献中报道的S. commune漆酶的pH最适值和活性谱。其他S. commune菌株的漆酶也显示出类似的pH依赖性活性谱，尽管具体的最适pH值因菌株、培养条件和底物而异。例如，当使用ABTS作为底物时，S. commune IBL-06的漆酶在pH 6.0时表现出最大活性，而在更高pH值下活性降低[34]。相比之下，S. commune NI07产生的漆酶在浸泡发酵条件下显示出一个较窄的最适pH范围（4.43至4.46），并且当pH值高于4时活性急剧下降[11]。此外，同一菌株的固定化漆酶在pH 5.5下使用ABTS时表现出最大活性[11]。这些发现证实了漆酶的pH最适值强烈依赖于酶的来源和底物类型。

S. commune TMF3漆酶的pH谱（图2a）可以通过pH依赖性的酶催化变化来解释。在酸性条件下，酚类底物与类型I铜中心之间的氧化还原电位差促进了有效的电子转移[23,35]。随着pH值的增加，氢氧根离子与类型II/III铜簇相互作用，破坏了内部的电子转移并降低了催化效率[23,35]。此外，底物与酶活性位点之间的氧化还原电位变化也导致了在较高pH值下的活性下降[35]。

观察到的温度-活性谱与真菌漆酶的典型行为一致（图2b），其中催化效率随温度升高而提高，因为分子移动性和酶与底物之间的碰撞频率增加，直到超过某个阈值后会发生热变性及结构不稳定[36]。S. commune TMF3漆酶的最佳温度为40°C，表明其具有中等的热稳定性（图2b,d），这有利于在温和的加工条件下使用。其他S. commune菌株产生的漆酶也报道了相似的最佳温度，尽管存在相当大的变异性[11,34]。在浸泡发酵条件下产生的S. commune NI07漆酶在30°C时表现出最大活性，而同一菌株的固定化形式在更宽的温度范围（25–65°C）内表现出增强的热耐受性，最佳活性为35°C[11]。同样，S. commune IBL-06纯化的漆酶的最佳温度也为40°C[34]，与本研究中观察到的值非常接近。虽然许多真菌漆酶的最佳温度在50至70°C之间，但也有报道指出一些酶具有较低的最佳温度，特别是在担子菌来源的漆酶中[37]。S. commune TMF3漆酶的相对较低的最佳温度可能反映了该菌株的特定结构特征，以及所使用的酚类底物邻苯二甲酸的改变，这也可能影响表观的最佳温度。

随着温度的升高，酶的活性下降，再加上其酸性的pH最适值，表明这种酶在涉及温和条件下酚类化合物氧化的过程中具有潜在的应用性。除了对催化活性的影响外，pH值还可以通过改变对维持蛋白质天然构象至关重要的氨基酸残基的离子化状态来显著影响酶的稳定性[38]。极端pH条件下的暴露可能导致酶分子的水解或化学修饰，从而导致部分或完全失去活性[38]。如先前所报道的，真菌漆酶可以在相对较宽的pH范围内保持结构稳定，即使它们在某些pH值下可能失去催化活性[23]。本研究中观察到的pH稳定性谱（图2c）与之前的关于S. commune漆酶的报告一致。例如，据报道，S. commune IBL-06纯化的漆酶在pH 5.0–8.0范围内孵育1小时后仍保持稳定，但在更碱性的条件下长时间暴露后活性显著降低，在35°C下24小时后只剩下约22%的残余活性[34]。同样，固定化的S. commune NI07产生的漆酶表现出较高的pH耐受性和更高的稳定性[11]。短期孵育研究表明，这种酶在温和的酸性pH下保持高活性，而在强酸性和碱性条件下则显著失活[11]。

尽管不同S. commune菌株的漆酶最佳pH值存在差异，并且取决于所用的底物，但现有文献一致表明，这种酶在酸性到接近中性的pH范围内表现出更高的稳定性[11,34]。S. commune TMF3的结果支持了这一观察结果，表明尽管在较高pH值下催化活性降低，但该酶在广泛的pH范围内仍保持相当程度的结构稳定性。本研究中观察到的热稳定性谱（图2d）与真菌漆酶的一般特性一致，其热稳定性通常与其产生菌株偏好的温度范围相关。与细菌漆酶不同，真菌漆酶在超过60°C的温度下通常会迅速失去活性。据报道，许多真菌漆酶在70°C下的半衰期少于一小时，在80°C下仅为几分钟，这突显了它们对高温胁迫的有限耐受性[20,39]。不同S. commune菌株的漆酶在热稳定性方面也存在类似的变化。例如，S. commune NI07在浸泡发酵条件下产生的漆酶在30°C时表现出最佳活性，而在固定化后则在更宽的温度范围内（25–65°C）表现出增强的热耐受性，最佳活性为35°C[11]。同样，S. commune IBL-06纯化的漆酶的最佳温度也为40°C[34]，与本研究中观察到的值非常接近。尽管许多真菌漆酶的最佳温度在50至70°C之间，但也有报道指出一些酶具有较低的最佳温度，尤其是在担子菌来源的漆酶中[37]。S. commune TMF3漆酶的较低最佳温度可能反映了该菌株的特定结构特征以及所使用的酚类底物邻苯二甲酸的影响。

综上所述，S. commune TMF3漆酶的pH和热稳定性特性表明，这种酶非常适合在温和的酸性和中等温度条件下需要持续催化性能的生物技术应用。这些特性特别适用于涉及酚类化合物氧化的过程，其中长期的酶活性和操作稳定性至关重要。随后，从S. commune TMF3中表征出的漆酶被用于三种染料（AO、DB和MG）的脱色，展示了其在生物技术染料去除过程中的实际潜力（图3）。与文献数据相比，S. commune TMF3产生的漆酶表现出更快的脱色动力学。例如，使用T. trogii产生的漆酶并在氧化还原介质HBT存在下仅需48小时即可去除87.9%的AO[40]。类似地，DB的去除通常需要更长的反应时间或介质辅助系统，使用固定化漆酶的去除率约为40%[41]，或者使用T. versicolor产生的粗漆酶在24小时后去除率约为81%[42]。而在本研究中，无论染料浓度（50 mg/L）如何，在60分钟内即可实现AO和DB的类似脱色效果（>80%），且无需添加任何氧化还原介质（图3a–d），这突显了S. commune TMF3漆酶的催化效率。文献报道表明，使用更高活性的漆酶和氧化还原介质（如HBT）在大约110 mg/L的染料浓度下需要120–180分钟才能达到90–91.6%的MG脱色效果[43]。此外，MG去除的最佳温度通常达到55°C，从能效角度来看这并不理想[43]。值得注意的是，有研究还表明，HBT的存在可以使MG的脱色效率在1小时内提高到约90%，而在无介质系统中脱色效果显著较慢或不完整[43]。尽管如此，Cerrena sp.产生的漆酶也报告了类似的或略高的脱色效率[44]。然而，这些结果是在更为苛刻的条件下获得的。具体来说，使用2.8 IU/mL的漆酶、109.9 mg/L的初始染料浓度和大约172分钟的反应时间，预测的最大MG脱色效率为91.6%[44]。相比之下，S. commune TMF3漆酶在60分钟内无需添加介质即可实现接近90%的MG去除率，这是该酶的一个关键优势（图3e,f）。为了进一步突出这种酶的性能，表6提供了与文献报告相比的染料脱色效率的比较概览（表6）。本研究中观察到的高脱色效率，特别是在无介质条件下，不仅可以归因于漆酶本身的催化特性，还归因于用于其生产的木质纤维素底物。BSG富含木质素和酚类化合物，包括阿魏酸和对香豆酸，这些化合物在真菌生长和木质素修饰过程中会被释放[45,46]。这些低分子量的酚类化合物可作为天然的氧化还原介质，促进漆酶催化反应中的电子转移[37,47]。这可能进一步提高了电子转移效率，即使在没有外部添加介质的情况下也能支持有效的染料降解。在木质纤维素系统中也报道了类似的现象[48]。

通过HPLC分析了所有三种染料的降解产物，以进一步阐明转化过程。染料特异性波长处主峰的减少以及额外信号的出现表明了染料的结构变化和中间产物的形成（补充材料图S2–S4）。漆酶催化的染料降解主要基于单电子氧化反应，这些反应产生高活性自由基中间体。这些中间体进一步经历非酶促转化，导致发色团（包括偶氮键）的断裂和复杂芳香结构的分解。因此，染料分子转化为更小、更极性的化合物，对细胞膜和大分子的亲和力降低，这解释了观察到的细胞毒性和抗菌效应的减弱。这一趋势与本研究中的实验数据一致（表4），其中更高的脱色效率（>80%在60分钟内）对应于抗菌活性的显著降低。这表明酶处理不仅去除了颜色，还改变了负责微生物抑制的功能基团。芳香结构的氧化断裂，包括偶氮键（–N=N–）和共轭芳香体系，导致形成了较小、更极性的化合物，其毒性和与微生物细胞膜及细胞内靶标的相互作用能力降低。在某些情况下，这种转化可能会导致从抑制作用转变为轻微的生长刺激。这种行为与先前描述的漆酶介导的降解途径[49,50]一致。这些关于分子水平上染料转化的发现促使人们进一步通过总有机负荷的变化来评估该过程的效率，这体现在COD（化学需氧量）的去除上。纺织废水的特点是其复杂的组成，其中包括高浓度的染料、有机物、悬浮固体和各种辅助化学物质，这些共同导致了COD值的升高[23]。COD被广泛认为是有机污染的关键指标，通常用于通过比较处理前后的数值来评估废水处理过程的有效性[23]。与文献数据相比，本研究获得的COD去除效率非常有竞争力，特别是考虑到较短的处理时间（≤60分钟）和无媒介条件的情况下。例如，使用Pseudomonas plecoglossicida MG2在较高染料浓度（150 mg/L）下报告了95.95%的COD去除率[51]。然而，这种去除是通过通常需要更长培养期的细菌降解过程实现的。同样，使用包含固定化漆酶和金属氧化物材料的复杂混合系统也报告了非常高的COD去除率（高达98.84%），其中酶促降解与吸附过程相结合，且通常在较低的染料浓度（约5 mg/L）下进行[52]。相比之下，来自S. commune TMF3的漆酶在仅一小时内就实现了84%的COD去除率（针对MG染料），并且不需要额外的吸附剂、固定化基质或氧化还原媒介。这突显了该酶作为独立生物催化剂的高效率。进一步与产生木质素分解酶的微生物系统进行比较，也突出了S. commune TMF3漆酶的优势。例如，Bacillus aryabhattai DC100对纺织染料的降解在48小时后的最大COD去除率仅为43%，这显著低于本研究中观察到的效果[52]。此外，使用原始细菌酶制剂处理CI Acid Black 210和CI Acid Black 234染料分别在96小时后才实现了93.47%和92.17%的COD去除率[53]。相比之下，S. commune TMF3的漆酶在60分钟内就实现了显著的COD去除，显示出更好的过程动力学和效率。这些发现表明，S. commune TMF3的漆酶能够快速有效地减少含染料溶液中的颜色和有机负荷。结合较短的处理时间、相对较高的COD去除效率以及无需额外处理组分的特性，使这种酶区别于许多先前的系统，显示出未来废水处理应用的巨大潜力。除了这些物理化学参数的改进外，还必须评估处理后的染料溶液的生物学影响，以便全面评估该过程的环境相关性。已知合成染料，特别是偶氮染料和三苯甲烷染料，由于其持久性和诱导氧化应激及细胞损伤的能力，会影响细胞活力[54,55,56]。偶氮染料可能发生还原性断裂，产生与细胞毒性和遗传毒性相关的芳香胺，而三苯甲烷染料可以与细胞成分（如膜、蛋白质和核酸）相互作用，从而破坏正常的细胞功能[54,56]。MG染料表现出明显的细胞毒性，可能是由于其与细胞成分的相互作用及其诱导氧化应激的能力[56]。这些发现表明，漆酶处理可以降低染料的毒性，尽管并不总能完全解毒，尤其是在结构复杂的染料（如MG）的情况下。合成染料由于其化学结构和潜在毒性可能会影响微生物，可能导致生长抑制或细胞活性改变。在本研究中，所有测试的染料在处理前都表现出抑制作用，而漆酶介导的降解显著减少了这种抑制作用。微生物反应的差异也可能与所测试生物体的结构和生理特性有关。大肠杆菌（E. coli）作为一种革兰氏阴性细菌，具有可以充当渗透屏障的外膜，从而减少有毒化合物的吸收。相比之下，鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）是一种革兰氏阳性细菌，缺乏这种外膜，因此更容易受到外部因素的影响。像白色念珠菌（C. albicans）和酿酒酵母（S. cerevisiae）这样的真核微生物具有更复杂的细胞结构，这可能会影响它们对染料及其降解产物的反应。这些结构差异可能部分解释了本研究中观察到的L. rhamnosus和C. albicans对孔雀石绿的更高敏感性。此外，一些微生物，特别是乳酸菌和酵母，能够利用低分子量的有机化合物，这可能解释了漆酶处理后从抑制作用转变为生长刺激的现象。对于大肠杆菌来说，初始的抑制作用在降解后明显减弱，同时观察到轻微的生长刺激。这可能表明降解产物毒性较低，可以作为可代谢的底物。评估植物毒性是评估染料及其降解产物环境影响的重要步骤[23]。由于种子萌发试验的敏感性和相关性，常用于此类研究，因为萌发代表了植物发展的早期阶段[57]。文献中也报告了类似的趋势。例如，经过漆酶处理的AO51染料的萌发率比未经处理的染料有所增加；然而，GI（发芽指数）值仍然相对较低（在100、75和20 mg/L的染料浓度下分别为8.8%、10.8%和29.0%），仅表明部分解毒[40]。此外，虽然媒介HBT的应用提高了脱色效率，但也导致了植物毒性的增加，如GI值所示。这突显了媒介辅助系统的潜在局限性[57]。相比之下，本研究的结果表明在无媒介条件下植物毒性显著降低。对MG染料的体内研究进一步支持了生物解毒的有效性。未经处理的MG溶液可使种子萌发率降低到大约20%。经过假单胞菌（Pseudomonas putida）产生的原始或纯化漆酶处理后，萌发率增加到约40%[58]。此外，Bacillus pacificus ROC1对MG的生物降解在未经处理的样品中50 ppm浓度下仅为60%，而在1000 ppm浓度下为13%；而ROC1处理过的样品在所有测试浓度下的萌发率均超过80%，同时根和茎的生长也得到了改善[59]。与这些报告相比，本研究使用未纯化漆酶获得的结果特别值得注意，因为MG的GI值超过了100%，表明了明显的植物促进作用而不仅仅是简单的解毒。在某些情况下，这些转化产物也可能变得更加易于生物利用和代谢，这可能有助于观察到的生长刺激效果。本研究的结果，特别是处理后观察到的高GI值，表明植物毒性得到了有效降低，并表明原始漆酶可以生成环境影响较低的转化产物。同时，缺乏氧化还原媒介是一个额外的优势，因为某些系统中的这些化合物可能会增加毒性。尽管本研究表明原始S. commune TMF3漆酶在染料降解、COD去除和植物毒性去除方面具有高效率，但未评估酶的稳定性和可重复使用性。这些参数对于实际应用和大规模应用非常重要。在这种情况下，酶固定化是一种成熟的技术，可以提高操作稳定性，增强可重复使用性，并使漆酶能够在废水处理系统中反复应用。已经报道了各种固定化方法，特别是基于聚合物基质的固定化方法，可以提高生物催化剂的稳定性、对环境压力的抵抗力和长期适用性。例如，基于聚合物的系统（如PVP/PEG/琼脂基质）已在废水处理中成功应用，显示出在操作条件下更好的稳定性和可重复使用性[60]。未来的研究可以集中在开发固定化漆酶系统上，以进一步提高本研究中研究的酶促过程的运行性能和适用性。5. 结论 本研究的结果表明，农业工业废弃物可以作为S. commune TMF3生产漆酶的有效底物，支持在循环生物经济框架内对BSG（生物质固体）的再利用。在优化的固态发酵条件下，获得了高酶活性。所产生的原始漆酶在pH 5.0和40°C下表现出最佳活性，并能够快速脱除偶氮染料和三苯甲烷染料，短时间内去除率超过80%，且无需添加氧化还原媒介。处理还降低了染料溶液的化学需氧量，表明有机化合物得到了有效降解。毒理学评估显示处理后没有增加抗菌或细胞毒性作用，而植物毒性测试确认了对小麦种子萌发的抑制作用不存在，某些情况下还观察到了轻微的刺激作用。这些发现表明，在农业工业废弃物上无媒介生产漆酶可以作为一种可持续的方法来去除染料，将废弃物再利用与更安全的染料污染废水处理相结合。补充材料 以下支持信息可以从以下链接下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/pr14101531/s1，图S1：S. commune TMF3产生漆酶的测试变量扰动图，图S2：MG的HPLC分析；图S3：AO的HPLC分析；图S4：DB的HPLC分析；图S5：(a)未经处理的MRC-5细胞，以及用20%体积比的(b) AO、(c)降解的AO、(d)降解的DB、(e)降解的DB、(f) MG和(g)降解的MG处理的细胞的代表性显微照片；图S6：未经处理和经过漆酶处理的染料（AO、DB、MG）对种子萌发的植物毒性影响。