Acheilognathus imberbis（辐鳍鱼纲、鲤形目、鲤科）的线粒体基因组结构：对其亚科系统发育的启示

《ACTA ICHTHYOLOGICA ET PISCATORIA》：Mitogenomic architecture of Acheilognathus imberbis (Actinopterygii, Cypriniformes, Cyprinidae): Implications for Acheilognathinae phylogeny

　　刘国洋|邓迪|张汉烨|宋丹|刘碧媛|程启群
上海海洋大学渔业与生命科学学院，中国上海
https://ror.org/04n40zv07

**摘要**
对栖息于长江和黄河流域支流中的小型淡水鱼类**Acheilognathus imberbis Günther, 1868**的完整线粒体基因组进行了测序和表征。该环状线粒体基因组长度为16,576个碱基对，包含13个蛋白质编码基因（PCGs）、22个转运RNA（tRNA）基因、2个核糖体RNA（rRNA）基因以及一个非编码调控区域。核苷酸组成分析显示，该基因组以AT碱基为主（A + T = 58.93%），但鸟嘌呤含量较低（15.88%），这与典型的脊椎动物线粒体基因组特征一致。为厘清**Acheilognathinae**亚科内的系统发育关系，我们采用了来自37个代表性物种的13个PCGs串联序列进行了系统发育分析。结果证实了**Acheilognathinae**的單系性，并将其分为两个主要支系：**Acheilognathus**支系和**Tanakia–Rhodeus**复合支系。值得注意的是，**Rhodeus**支系的單系性仅在部分节点上得到支持，提示可能需要进行分类修订。基于Tamura–Nei模型的成对遗传距离分析显示，该亚科内的物种间遗传距离范围为0.0071至0.2600。通过同源性分析发现，某些**Acheilognathinae**物种之间存在紧密亲缘关系，其遗传距离小于0.0406，这表明需要重新评估它们的分类标准。基于ND2基因的-positive selection分析未检测到统计学上显著的密码子位点受到正选择的影响。这一线粒体基因组资源为**Acheilognathinae**鱼类的分子系统学和进化研究提供了重要支持。

**引言**
鱼类是脊椎动物中多样性最丰富的类群，在不同水生环境中展现出显著的进化适应性（Nelson 2006）。了解它们的进化关系对于明确分类界限、生物地理历史和适应性分化至关重要（Betancur等人2013）。随着分子系统学的发展，线粒体基因组序列因其保守的基因内容、紧凑的大小和高替换率而成为重建鱼类进化历程的强大工具（Miya和Nishida 2000）。
脊椎动物的线粒体基因组（线粒体基因组）是一个大约16–17 kb的环状分子，通常编码13个蛋白质编码基因、22个tRNA和2个rRNA（Satoh等人2016）。线粒体基因组数据已被广泛用于鱼类系统学、群体遗传学和进化生物学研究（Curole和Kocher 1999；Bernt等人2013a）。与核标记相比，mtDNA具有母系遗传、快速进化和低重组率的特点，尤其适合用于解析硬骨鱼类的种间关系和谱系分化（Avise等人1987）。
**Acheilognathus imberbis Günther, 1868**是一种底栖-浮游生活的淡水鲫科鱼类，属于**Acheilognathinae**亚科（苦鱼）。它分布于长江和黄河系统的支流中（Günther 1871）。尽管已有研究利用线粒体基因片段探讨了**Acheilognathinae**亚科内的系统发育关系，但结果仍存在分歧。Arai和Akai在1988年提出的传统分类将苦鱼分为三个属：**Acheilognathus**、**Tanakia**和**Rhodeus**。后续基于线粒体12S rRNA（Okazaki等人2001）和细胞色素b（Bohlen等人2006；Kawamura等人2014）的分子分析支持**Acheilognathus**的單系性，但对**Tanakia**和**Rhodeus**的支持较弱或相互矛盾。这些差异可能与样本数量有限、序列片段较短或线粒体位点发生替换饱和有关。最近，随着更多鲫科鱼类的线粒体基因组数据的获得，一些研究强调了完整线粒体基因组在解决苦鱼属长期分类争议中的潜力（Zhu等人2014；Xu等人2016）。尽管**A. imberbis**已被包含在多项基于部分线粒体或核标记的分子系统学研究中（Okazaki等人2001；Chang等人2014；Kawamura等人2014），但其在线粒体基因组数据支持的**Acheilognathinae**亚科内的系统发育位置尚未明确，其属内关系也尚未完全解决。之前的**A. imberbis**线粒体基因组研究仅提供了简要的序列描述（Wang等人2016）。在本研究中，我们设计了引物，通过长PCR扩增和引物 walking测序方法获得了**A. imberbis**的完整线粒体基因组序列，并详细描述了其基因组结构、基因排列和特征。在此基础上，我们分析了其系统发育关系，这对丰富苦鱼类的基础数据和系统学研究具有重要意义。

**材料与方法**
**样品采集与DNA提取**：**Acheilognathus imberbis**个体采自中国第三大淡水湖太湖东北部（图1、图2）。使用Column mtDNA out试剂盒（Sangon，上海）从肌肉中提取基因组DNA。通过Nanodrop 8000仪和1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA含量和质量，并将其储存在-20°C。提取的DNA作为模板，采用Sanger测序方法（Yamauchi等人2004）扩增较短的重叠片段（约600–1000 bp）。

**下载：**
- 下载高分辨率图片（174KB）
- 下载全尺寸图片

**图1. **中国江苏省无锡市太湖中**Acheilognathus imberbis**的采样地理坐标。
- 下载高分辨率图片（498KB）
- 下载全尺寸图片
**图2. **Acheilognathus imberbis**的照片。拍摄地点：中国江苏省无锡市太湖东北部。拍摄日期：2020年8月5日。标准体长（SL）：53.6毫米。

**引物设计与PCR扩增**：根据NCBI上**Acheilognathus**的线粒体基因组序列，我们使用其保守序列区域设计了引物6.0（这些引基于鱼类mtDNA的通用引物为基础，Simon等人1994；Ye等人2012）（表1）。PCR扩增在20 μL反应体积中进行，包含2 μL 10 × LA Buffer（Mg2+；Takara，日本）、1 μL模板DNA、3.2 μL 10 mmol·L–1 dNTPs、各1 μL引物、0.2 μL 2.5 U·μL–1 Taq DNA聚合酶和11.6 μL ddH2O。扩增条件为：首先在94°C下变性5分钟，然后进行35轮循环：94°C下变性30秒、55°C下退火30秒，72°C下延伸1分钟，最后在72°C下延伸15分钟。在1.0%琼脂糖凝胶上确认目标条带后，分离并纯化PCR产物，随后送至上海迈普生物技术有限公司进行测序。

**表1. **用于扩增**Acheilognathus imberbis**完整线粒体基因组的引物组合。**引物名称** | **引物序列（5'–3'）** | **位置**
|-----------------|-----------------|----------------)|
| AI-12S-1F | CAACATGAAATAGTGCTTGAAGGA | 831 (+1) |
| AI-12S-1R | CACTTACCATGTTACGACTTGCCT | 1572 (-1) |
| AI-CO1-1 | FTATCTTGTATTTGGTGCCTGAGC | 5538 (+1) |
| AI-CO1-1 | RCACAAGTCAGTTGCCAAATCCT | 10845 (-1) |
| AI-SER-1 | FACCAAGAAGGGATAAGAATCA | 11807 (+1) |
| AI-LEU-1 | RAGCTTCTGCTTGGATTTGCAC | 4626 (-1) |
| AI-COB-1 | FATGATGCACTAGTTGATCTTCCA | 1442 (+1) |
| AI-COB-1 | RCCGATGTTTCAAGTTTCTTTGTAGA | 1852 (-1) |
| AI003-2 | FGTTACCATTGGACTAAACCAGCC | 1291 (+1) |
| AI-ND5-1 | RGTGCTGGCTCATTCTGGAGTC | 4510 (-1) |
| AI003-1 | FTTTTATTGGTTGAGAAGGAGTAG | 1238 (+1) |
| AI003-1 | RGGGCTCTTTCTTGTCTCTAGTGTTG | 2412 (-1) |
| AI004-1 | FTTTTACACGAAACAGGATCGAA | 1497 (+1) |
| AI004-1 | RGTATATTCACATTAAAGCCACTTTC | 1610 (-1) |
| AI004-2 | FCCCGTAGAACATCCATACATC | 1542 (+1) |
| AI004-2 | RCGGATGTTTCAAGTTTCTTTGTAGA | 1852 (-1) |
| AI005-1 | FGTGCTTGGCTCATTCTGGAGTC | 386 (+1) |
| AI003-2 | FGTTACCATTGGACTAAACCAGCC | 1291 (+1) |
| AI-ND5-1 | RGTGCTGGCTCATTCTGGAGTC | 4510 (-1) |
| AI003-1 | FTTTTATTGGTTGAGAAGGAGTAG | 1238 (+1) |
| AI003-1 | RGGGCTCTTTCTTGTCTCTAGTGTTG | 2412 (-1) |

**线粒体基因组组装与注释**：使用SeqMan（Misener和Krawetz 1999）对完整线粒体基因组序列进行排列和拼接，并手动修正不准确的测序部分。通过MITOS软件（http://mitos.bioinf.uni-leipzig.de/index.py）（Bernt等人2013b）预测线粒体基因组的编码蛋白质、tRNA和rRNA基因。使用Mega 11.0软件（Tamura 2021）分析碱基组成、密码子偏好和系统发育关系。核苷酸组成偏斜分析采用公式：
AT-skew = [A ? T] × [A + T]–1
GC-skew = [G ? C] × [G + C]–1
（Cui等人2009）。使用DNAMAN软件分析核苷酸组成、密码子使用情况和碱基组成（氮碱基百分比：A、T、G和C）。
利用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）（Xu等人2014）识别蛋白质编码基因（PCGs）的边界。使用Tandem Repeats Finder程序（http://tandem.bu.edu/trf/trf.advanced.submit.html）（Benson 1999）分析串联重复序列。在线程序tRNA scan-SE 2.0（http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/）（Lowe和Eddy 1997）预测tRNA的位置和结构，并进行手动校正。使用在线软件Ogdraw（https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）（Lohse等人2007）绘制**A. imberbis**线粒体基因组的基因图谱，rRNA则使用RNAmmer v.1.2（Lagesen等人2007）进行注释。

**序列比对与系统发育分析**：为比较苦鱼物种间的差异，从GenBank下载了其他31种苦鱼的线粒体基因组序列并纳入本研究（表2）。对于某些分类单元，当前的分类基于后续的 taxonomic修订，而非GenBank记录中的原始属名（例如，Arai等人1995；Kim等人2014）。使用Clustal X 1.83（Wallace等人2007）对所有完整序列进行多序列比对，并手动检查蛋白质编码区域的密码子对齐情况。使用Gblocks v0.91b（Castresana 2000）去除间隙和 alignment 不明确的区域。根据脊椎动物线粒体遗传密码验证起始和终止密码子，不完整的终止密码子（如“T-”、“TA-”）假定为翻译后多聚腺苷酸化完成。ND6基因位于轻链上，在比对前将其转换为互补序列以保持一致的编码方向。然后提取13个蛋白质编码基因数据集用于后续的系统发育分析。使用IQ-TREE v3（Minh等人2020）对苦鱼物种的完整线粒体基因组进行最大似然（ML）分析，以**Cyprinus carpio Linnaeus**、**Misgurnus anguillicaudatus**（Cantor, 1842）、**Pseudogobio esocinus**（Temminck和Schlegel, 1846）、**Zacco platypus**（Temminck和Schlegel, 1846）和**Tanichthys albonubes**（Lin, 1932）作为外群。使用ModelFinder（Kalyaanamoorthy等人2017）在IQ-TREE v3中实现了基于贝叶斯信息准则（BIC）的最佳拟合核苷酸替换模型TIM2+F+R4。分支置信度通过超快速自举方法重复5000次。

**表2. **用于系统发育研究的苦鱼（Acheilognathinae）及其外群的线粒体基因组。**
| 属 | 种 | 长度 [bp] | 访问编号 |
|--------------|-------------|------------|-------------|
| Acheilognathus | A. barbatus | 16 770 | NC_026872 |
| | A. chankaensis | 16 926 | MK380726 |
| | A. gracilis | 16 988 | NC_028416 |
| | A. hypselonotus | 16 706 | MZ334545 |
| | A. imberbis | 16 576 | OL542519 |
| | A. macropterus | 16 773 | KJ499466 |
| | A. meridianus | 16 563 | NC_031152 |
| | A. omeiensis | 16 774 | NC_037404 |
| | A. rhombeus | 16 780 | NC_028433 |
| | A. tonkinensis | 16 767 | NC_042407 |
| | A. typus | 16 778 | AB239602 |
| | A. yamatsutae | 16 703 | NC_013712 |
| Rhodeus | R. albomarginatus | 16 764 | MW896838 |
| | R. cyanorostris | 16 580 | MZ981722 |
| | R. fangi | 16 733 | NC_027437 |
| | R. lighti | 16 677 | NC_024885 |
| | R. notatus | 16 735 | NC_029718 |
| | R. ocellatus | 16 675 | MW007386 |
| | R. pseudosericeus | 16 574 | KF425517 |
| | R. sericeus | 16 581 | NC_025326 |
| | R. shitaiensis | 16 774 | KF176560 |
| | R. suigensis | 16 733 | NC_013709 |
| | R. uyekii | 16 817 | DQ155662 |
| Tanakia | T. himantegus | 16 575 | NC_027084 |
|可能性比值检验（LRT）是基于对数似然值差异的两倍（2ΔlnL）和自由度在嵌套模型之间进行的。在使用贝叶斯经验贝叶斯（BEB）方法并在显著性阈值Pr(ω > 1) > 0.95的条件下，识别出在M8模型下被正向选择的密码子位点。结果包括基因组结构和核苷酸组成。我们获得了Acheilognathus imberbis的线粒体基因组序列，并将其上传至NCBI，基因库访问号为OL542519。对OL542519与之前发表的序列KP015738进行了成对比较，以评估序列相似性（补充材料1）。所有13个蛋白质编码基因（PCGs）显示出高序列相似性（平均识别率≥98%）。A. imberbis的线粒体基因组结构和基因排列顺序与大多数鲤科鱼类一致（Li等人，2019年），总长度为16,576 bp，包含13个PCGs、22个tRNAs、2个rRNAs和2个非编码区域（图3）。A. imberbis线粒体基因组的总碱基组成分别为A:30.54%、C:25.18%、T:28.39%、G:15.88%，并表现出正向的AT偏斜（0.036）和GC偏斜（0.226），这与典型硬骨鱼类线粒体基因组中G含量的最低频率一致（Perna和Kocher，1995年；Broughton等人，2001年）。

在37个被编码的基因中，28个位于重链（H链），而其他9个基因，即ND6基因和8个tRNAs基因（tRNA-Gln、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Ser、tRNA-Pro和tRNA-Glu），位于轻链（L链）（表3）。此外，发现了四个基因重叠，其中三个位于蛋白质编码基因之间，分别是ATP8/ATP6（6 bp）、ND4L/ND4（7 bp）和ND5/ND6（4 bp），最后一个位于tRNA-Ile和tRNA-Gln之间（2 bp）。有12个基因间间隔区，长度从1 bp到31 bp不等，其中tRNA-Asn和tRNA-Cys之间的间隔最长。控制区代表了另一个大的非编码间隔区，使得整个线粒体基因组中共有13个基因间区域，其余22个基因紧密相连（表3）。

在37个被编码的基因中，28个位于重链（H链），而其他9个基因，即ND6基因和8个tRNAs基因（tRNA-Gln、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Ser、tRNA-Pro和tRNA-Glu），位于轻链（L链）（表3）。此外，发现了四个基因重叠，三个位于蛋白质编码基因之间，分别是ATP8/ATP6（6 bp）、ND4L/ND4（7 bp）和ND5/ND6（4 bp），最后一个位于tRNA-Ile和tRNA-Gln之间（2 bp）。有12个基因间间隔区，长度从1 bp到31 bp不等，其中tRNA-Asn和tRNA-Cys之间的间隔最长。控制区代表了另一个大的非编码间隔区，使得整个线粒体基因组中共有13个基因间区域，其余22个基因紧密相连。

在37个被编码的基因中，28个位于重链（H链），而其他9个基因，即ND6基因和8个tRNAs基因（tRNA-Gln、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Ser、tRNA-Pro和tRNA-Glu），位于轻链（L链）（表3）。此外，发现了四个基因重叠，三个位于蛋白质编码基因之间，分别是ATP8/ATP6（6 bp）、ND4L/ND4（7 bp）和ND5/ND6（4 bp），最后一个位于tRNA-Ile和tRNA-Gln之间（2 bp）。有12个基因间间隔区，长度从1 bp到31 bp不等，其中tRNA-Asn和tRNA-Cys之间的间隔最长。控制区代表了另一个大的非编码间隔区，使得整个线粒体基因组中共有13个基因间区域，其余22个基因紧密相连。

在37个被编码的基因中，28个位于重链（H链），而其他9个基因，即ND6基因和8个tRNAs基因（tRNA-Gln、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Ser、tRNA-Pro和tRNA-Glu），位于轻链（L链）（表3）。此外，发现了四个基因重叠，三个位于蛋白质编码基因之间，分别是ATP8/ATP6（6 bp）、ND4L/ND4（7 bp）和ND5/ND6（4 bp），最后一个位于tRNA-Ile和tRNA-Gln之间（2 bp）。有12个基因间间隔区，长度从1 bp到31 bp不等，其中tRNA-Asn和tRNA-Cys之间的间隔最长。控制区代表了另一个大的非编码间隔区，使得整个线粒体基因组中共有13个基因间区域，其余22个基因紧密相连。

在37个被编码的基因中，28个位于重链（H链），而其他9个基因，即ND6基因和8个tRNAs基因（tRNA-Gln、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Ser、tRNA-Pro和tRNA-Glu），位于轻链（L链）（表3）。此外，发现了四个基因重叠，三个位于蛋白质编码基因之间，分别是ATP8/ATP6（6 bp）、ND4L/ND4（7 bp）和ND5/ND6（4 bp），最后一个位于tRNA-Ile和tRNA-Gln之间（2 bp）。有12个基因间间隔区，长度从1 bp到31 bp不等，其中tRNA-Asn和tRNA-Cys之间的间隔最长。控制区代表了另一个大的非编码间隔区，使得整个线粒体基因组中共有13个基因间区域，其余22个基因紧密相连。

在37个被编码的基因中，28个位于重链（H链），而其他9个基因，即ND6基因和8个tRNAs基因（tRNA-Gln、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Ser、tRNA-Pro和tRNA-Glu），位于轻链（L链）（表3）。此外，发现了四个基因重叠，三个位于蛋白质编码基因之间，分别是ATP8/ATP6（6 bp）、ND4L/ND4（7 bp）和ND5/ND6（4 bp），最后一个位于tRNA-Ile和tRNA-Gln之间（2 bp）。有12个基因间间隔区，长度从1 bp到31 bp不等，其中tRNA-Asn和tRNA-Cys之间的间隔最长。控制区代表了另一个大的非编码间隔区，使得整个线粒体基因组中共有13个基因间区域，其余22个基因紧密相连。R. ocellatus和R. lighti在Tanakia和Rodius两个主要谱系分化之前就已经分叉，而Pseudorhodeus tanago（Tanaka, 1909）则属于Rodius/Pseudorhodeus分支。这些结果表明该亚科具有复杂的进化历史，并暗示目前的属划分与线粒体系统发育结果并不完全一致。如此早期的分化与多基因位点分析框架（Chang et al. 2014）的结果一致，该框架显示多个Rodius物种根据不同标记类型的有所不同，可能反映了该科早期的快速辐射现象。另一个意外结果是R. albomarginatus被归入Acheilognathus分支，而非与其他Rodius物种聚类。鉴于目前GenBank中仅存一个完整的R. albomarginatus线粒体基因组，这一异常结果需要谨慎解读。

与早期的线粒体分析相比，本研究中属级别的分辨能力有所提高，这可能归因于使用了完整的线粒体基因组数据而非部分基因片段（Curole and Kocher 1999）。然而，线粒体基因组仅代表一个母系遗传的位点，其系统发育信号可能受到不完全的谱系分化、杂交事件的干扰或线粒体捕获过程的影响（Funk and Omland 2003）。因此，尽管当前的结果阐明了Acheilognathinae的主要进化框架并减少了分类上的不确定性，但不应将其视为解决该类群所有系统学问题的决定性证据。

线粒体遗传距离分析显示，苦鱼属物种间的遗传差异较大，通常符合硬骨鱼类物种间的遗传距离阈值（<0.0400）。当线粒体基因组的遗传距离是物种内部的10倍时，亚种或物种间的差异已经显著（Hickerson et al. 2006）。Rodus suigensis（Mori, 1935）与Rodus notatus Nichols, 1929（0.0162）和Rodus fangi（Miao, 1934）（0.0153）有轻微的分化，而A. gracilis与A. rhombeus之间的遗传距离仅为0.0071。近年来对动物线粒体cytochrome b基因的研究表明，同一物种内个体的序列差异通常在0至0.0406之间，而序列差异超过0.0406的个体则表现出显著的物种或亚种分化（Yang et al. 2002）。因此，有必要重新审视上述物种的分类。

ND2基因的适应进化方面，我们数据集中缺乏正向选择的密码子，这与先前多项研究的发现一致，即许多硬骨鱼类的ND2基因主要经历纯化选择。在所研究的Acheilognathinae分支中，ω > 1的比值不显著，表明ND2基因的进化受到限制，各谱系间的适应性分化有限。这种模式可能反映了氧化磷酸化（OXPHOS）基因的保守性质，特别是在相对稳定的热环境和生态条件下。尽管本研究中仅使用了ND2基因进行选择分析，但其作为线粒体编码基因的功能和进化代表性使其成为检测苦鱼属适应性进化的合适标志物。未来结合其他线粒体基因的分析可能提供更全面的谱系特异性选择模式。

**结论**
本研究生成并鉴定了Acheilognathus imberbis的完整线粒体基因组，为该物种提供了全面的线粒体基因组资源。线粒体基因组具有典型的鲤科基因内容和组织结构，包括标准蛋白质编码基因、tRNA、rRNA以及结构明确的调控区域。基于13个线粒体蛋白质编码基因的串联序列的系统发育分析强烈支持Acheilognathinae的单系性，并揭示了两个主要进化支系：Acheilognathus和Tanakia–Rhodeus复合群。虽然大多数被归入Acheilognathus的物种形成了一个连贯的支系，但线粒体系统发育表明Tanakia和Rodius之间的属界限并非严格意义上的单系群。当前的分类可能未能完全反映线粒体基因组层面的进化历史。遗传距离分析 further 显示苦鱼属物种间存在显著异质性。某些名义上的物种对（如A. gracilis和A. rhombeus）之间的低分化程度表明，需要采用结合分子、形态和生态证据的综合性分类方法来重新评估Acheilognathinae的物种界限。ND2基因的正向选择分析未检测到显著的支持适应性进化的位点，表明该线粒体基因在Acheilognathinae中主要经历纯化选择。这种模式与氧化磷酸化基因的功能限制相符，暗示线粒体能量代谢的谱系特异性适应性分化有限。总体而言，本研究使用完整的线粒体基因组数据细化了Acheilognathinae的系统发育框架，同时也强调了线粒体基因组分析的优点和局限性。尽管线粒体基因组相比部分标记提供了更高的分辨率，但观察到的拓扑不一致性表明未来研究需要结合核基因组数据和更广泛的分类单元采样，以获得更稳定和全面的苦鱼属进化和分类理解。

**利益冲突声明**
作者声明不存在利益冲突。

**伦理声明**
本研究未涉及伦理问题。

**人工智能使用**
作者对稿件内容承担全部责任，包括任何人工智能的使用情况。在撰写过程中未使用任何人工智能工具。

**资助**
本研究得到了上海市农业科学技术创新项目（项目编号：2024-02-08-00-12-F00009）的支持。

**作者贡献**
Cheng Qiqun构思了这项研究并设计了实验。Zhang Hanye和Cheng Qiqun负责样本采集。Peng Di、Song Dan和Cheng Qiqun实施了实验。Liu Guoyang、Peng Di、Song Dan、Zhang Hanye和Cheng Qiqun共同进行了数据分析。Liu Guoyang和Peng Di撰写了初稿。Liu Guoyang、Peng Di、Song Dan、Zhang Hanye和Cheng Qiqun共同讨论了研究结果。Liu Biyuan负责绘图。Cheng Qiqun监督了整个研究并筹集了资金。所有作者均对稿件进行了修订，并同意对工作的所有方面负责。

**作者的ORCID编号**
D. Peng：https://orcid.org/0000-0002-5570-401
H. Zhang：https://orcid.org/0000-0002-1645-6796
B. Liu：https://orcid.org/0009-0004-5657-705
XQ. Cheng：https://orcid.org/0000-0002-3736-9552

**数据可用性**
支持本研究的所有数据均可在正文或补充信息中找到。

**补充材料**
- 补充材料1：10.3897/aiep.56.181178.suppl1D4C5CD00-44EC-51DA-9226-CB1F587B341B（下载方式：下载zip文件，大小186KB，作者：Liu Guoyang, Peng Di）
- 补充材料2：10.3897/aiep.56.181178.suppl2D33E6BAE-7EF9-577C-9765-DA4048E32C6F（下载方式：下载 spreadsheet，大小42KB，作者：Liu Guoyang）