比较传统水制和酒精制 Arnica (Chiliadenus glutinosus) 标本的体外生物活性：对海洋鱼类病原体、PLHC1 细胞以及金头鲷 (Sparus aurata) 白细胞的效应 作者：Jose Carlos Campos-Sánchez, Francisco A. Guardiola, María ángeles Esteban

《Fishes》：Comparative In Vitro Bioactivity of Traditional Aqueous and Alcoholic Preparations of Arnica (Chiliadenus glutinosus): Effects on Marine Fish Pathogens, PLHC1 Cells and Gilthead Seabream (Sparus aurata) Leucocytes Jose Carlos Campos-Sánchez, Francisco A. Guardiola and María ángeles Esteban

　　摘要
Arnica（Chiliadenus glutinosus (L.) Fourr.）是一种特有植物，在西班牙传统医学中广泛用于制作浸剂和酒精浸液，以治疗各种疾病。尽管如此，关于这些制剂在鱼类相关模型中的生物活性的信息仍然很少。在本研究中，我们评估了Arnica提取物的生物活性，测试了水提取物、乙醇提取物和甲醇提取物在不同剂量（0、0.001、0.01、0.125、0.25、0.5和1 mg mL?1）下的抗氧化活性、对四种海洋鱼类病原菌（Vibrio harveyi、Vibrio anguillarum、Photobacterium damselae 和 Tenacibaculum maritimum）的影响、对PLHC1肿瘤细胞系的细胞毒性，以及它们对金头鲷（Sparus aurata）头部肾脏白细胞（HKLs）免疫参数的影响。所有提取物均表现出剂量依赖性的抗氧化活性，而杀菌效果则取决于所用溶剂，并主要在高浓度下观察到。乙醇提取物和甲醇提取物显示出明显的细胞毒性，而水提取物的毒性较低，因此被选为进一步研究的对象。在卡拉胶刺激试验中，我们测试了水提取物的选定浓度（0、0.25和0.5 mg mL?1）在λ-卡拉胶（0和1000 μg mL?1）刺激下的白细胞中的效果，并分析了呼吸爆发和吞噬活性、细胞形态以及基因表达。水提取物降低了活化白细胞的呼吸爆发和吞噬能力，并与细胞激活的形态学迹象相关。此外，它还下调了crel和casp9的表达。这些结果提供了不同传统Arnica制剂体外生物活性的比较视角，并表明它们的生物效应在很大程度上取决于所用溶剂和测试浓度，为了解它们在鱼类中的细胞效应提供了初步的实验数据。

1. 引言
自古以来，植物及其衍生制剂就被广泛用于传统医学中治疗各种人类疾病，即使支持其使用的科学证据有限[1,2,3]。许多这些疗法至今仍以浸剂、浸液或外用形式使用，它们的持续使用促进了旨在记录其生物活性并评估其潜在益处和风险的实验研究。近年来，基于植物的产品也引起了水产养殖研究的关注，其中天然物质被探索作为具有抗氧化、抗菌或免疫相关作用的生物活性化合物的替代来源[4]。由于这些特性，植物提取物被认为可能是抗生素和疫苗的潜在替代品，用于治疗或预防水产养殖疾病[4,5,6,7]。这在集约化水产养殖中尤为重要，因为频繁使用抗生素可能导致抗菌耐药性和环境污染[8,9]。在这一背景下，植物提取物不仅因其可能的抗菌活性而受到关注，还因其调节鱼类免疫反应的能力而受到关注[10]。因此，有必要评估这些产品在鱼类病原体和免疫细胞上的作用，以识别对水产养殖健康管理有价值的植物。

Chiliadenus glutinosus (L.) Fourr.（=Jasonia glutinosa (L.) DC.）是一种属于菊科的本土植物，分布范围包括伊比利亚半岛的地中海沿岸地区（包括巴利阿里群岛）、法国南部、西西里岛、马耳他和摩洛哥北部[11,12]。在西班牙，它传统上被称为“arnica”、“té de roca”（岩石茶）或“té de monta?a”（山茶），不应与Arnica montana混淆[12,13,14]。其特有的披针形叶子和黄色的花朵世代被用来制作浸剂，主要用于治疗消化不适、呼吸道问题（如感冒、喉咙痛和哮喘）以及调节血压[11]。此外，酒精浸液还被外用于皮肤，以消毒小伤口和缓解疼痛[11]。在民间医学中，这些制剂被认为具有抗炎和抗菌特性[11]。尽管有如此悠久的使用历史，但大多数可用信息集中在其植物化学组成和在哺乳动物模型中观察到的生物效应上[15,16,17,18]。这些研究证实并鉴定出丰富的单萜类（樟脑、 borneol和nerolidol）、倍半萜类（lucinone、glutinone和kudtriol）、多酚类化合物（如黄酮类（quercetin和kaempferol）、内酯、单宁以及其他少量化合物（如酯类、烷烃和维生素）[15,16,17,18）。此外，这些生物活性化合物似乎在该植物所描述的各种功能中起着关键作用，如抗氧化、抗菌、抗炎、助消化、降血压、神经保护和抗糖尿病活性[15,16,17,18]。然而，它在鱼类中的活性尚未得到广泛研究。具体来说，只有一项先前的研究评估了在水头鲷样品中添加0%（对照）、10%和30%的Arnica饲料15天和30天后的抗氧化状态和免疫相关参数的变化，包括皮肤黏液、血清、头部肾脏白细胞（HKLs）、肝脏和肠道[19]。在这些免疫相关样本中，HKLs尤为重要，因为头部肾脏是硬骨鱼类的主要造血器官，在功能上可与哺乳动物的骨髓相媲美[20]。因此，HKLs为评估鱼类先天免疫反应提供了合适的细胞模型。然而，关于这种植物的不同传统制剂对鱼类细胞或水生病原体的直接影响知之甚少。从民族药学的角度来看，比较类似于常见传统用途的水提取物和酒精提取物可能有助于更好地理解制备方法如何影响生物活性。

基于这一背景，本研究的主要目的是比较Arnica的水提取物、乙醇提取物和甲醇提取物的体外生物活性。具体来说，我们旨在评估它们的抗氧化活性、对四种海洋鱼类病原菌的杀伤效果、对PLHC1肿瘤细胞系的细胞毒性，以及对金头鲷HKLs免疫细胞参数的影响，金头鲷是地中海水产养殖中最重要的鱼类之一。此外，还测试了水提取物的选定浓度在λ-卡拉胶（0和1000 μg mL?1）刺激下的白细胞中的效果，以探索其对细胞反应、超微结构形态和与炎症和凋亡相关的基因表达的影响。总体而言，本研究提供了不同传统Arnica制剂在鱼类相关体外模型中的生物活性的比较评估。

2. 材料与方法
2.1. 植物提取物的收集与制备
2019年8月在西班牙穆尔西亚省洛尔卡（Lorca，纬度37°49′27.8461″ N，经度1°40′50.5888″ W）采集了完整的Arnica植物（图1）。一个凭证标本被存放在穆尔西亚大学的标本馆中（编号：MUB 71209）。收集的材料在室温（RT）下空气中干燥15天。随后，将叶子和花朵研磨成细粉，并在4°C下避光保存以备后续使用。这种粉末材料用于通过水、乙醇和甲醇作为溶剂制备三种不同的提取物。水提取物的制备方式类似于传统浸剂，而乙醇提取物和甲醇提取物则反映了传统上用于治疗伤口和外部疾病的酒精浸液的使用方法。对于水提取物，将1克干燥植物粉与40毫升沸蒸馏水混合，在室温下摇晃4小时。悬浮液通过100微米尼龙网过滤器过滤两次，并进行冻干（CHRIST，型号Alpha 1-2 LD，101021，Inycom，西班牙）。干燥后的水提取物称重并重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水（PBS；11.9 mM磷酸盐、137 mM NaCl和2.7 mM KCl，pH 7.4）（Fisher Bioreagents，马德里，西班牙）中，得到储备溶液，储存在-20°C下[21]。对于乙醇提取物和甲醇提取物，将1克干燥植物粉分别与40毫升无水乙醇或甲醇（Sigma-Aldrich，马德里，西班牙）一起孵育48小时，并在室温下摇晃。这些提取物也按上述方法过滤、冻干，并储存在-20°C下。称重后，将两种干燥提取物溶解在二甲基亚砜（DMSO，Sigma-Aldrich，马德里，西班牙）中，制备10 mg mL?1的储备溶液[22]。两种提取物都过滤后储存在-20°C下。对于所有实验，三种Arnica提取物的工作溶液是在使用前立即通过将相应的储备溶液稀释到每种实验所需的培养基中制备的。最终的溶液浓度为0（对照；水提取物使用PBS，乙醇提取物和甲醇提取物使用DMSO）0.001、0.01、0.125、0.25、0.5和1 mg mL?1，并进行检测。

2.2. 总抗氧化活性
使用2,2′-azino-bis-3-(ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)（ABTS，Sigma-Aldrich，马德里，西班牙）测定法评估了上述制备的植物提取物的抗氧化能力[23]。该方法依赖于样品中存在的抗氧化化合物还原ABTS自由基阳离子的能力，通过ABTS+的褪色及其对应的吸光度下降来评估。通过将每个样品的数值与抗坏血酸标准曲线进行比较来确定抗氧化活性，结果以抗坏血酸当量（mM）表示。简要来说，将50 μL稀释至最终浓度（如上所述）的水提取物、乙醇提取物或甲醇提取物与950 μL ABTS+溶液混合。使用分光光度计（BOECO S-22 UV/Vis，汉堡，德国）在730 nm处测量吸光度扣除。所有样本均重复三次进行分析。

2.3. 杀菌活性
根据Guardiola等人描述的协议[24]并稍作修改，评估了三种Arnica提取物对四种革兰氏阴性海洋细菌（Vibrio harveyi菌株Lg 16/00、Vibrio anguillarum菌株CECT4344、Photobacterium damselae亚种piscicida菌株PP3和Tenacibaculum maritimum）的杀菌活性。在每次检测前，将一个V. harveyi、V. anguillarum或P. damselae的单个菌落接种到添加了1.5% NaCl的Tryptic Soy Broth培养基（TSB，Difco Laboratories，弗兰克林湖，新泽西州，美国）中，而T. maritimum的单个菌落则在Flexibacter maritimus培养基（FMM，Difco Laboratories，弗兰克林湖，新泽西州）中培养，培养液体积加至10%。所有培养瓶在25°C下连续搅拌100 rpm孵育过夜。将处于指数生长阶段的细菌重新悬浮在无菌PBS中，并调整至1 × 10^8 CFU/mL的浓度。为了评估杀菌活性，将20 μL预先稀释至上述最终浓度的水提取物或乙醇提取物或甲醇提取物分配到96孔U形板的三个孔中。培养基单独和PBS分别作为阴性和阳性对照。随后，将20 μL每种细菌悬浮液加入相应的孔中，培养板在25°C下孵育5小时。使用MTT试验测定细菌活力，该试验基于琥珀酸脱氢酶活性将可溶性黄色四唑盐（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide（MTT，Sigma-Aldrich，马德里，西班牙）还原为不溶性蓝色呈色剂[25,26]。向每个孔中加入25 μL MTT（1 mg mL?1，Sigma-Aldrich，马德里，西班牙），然后培养板孵育10分钟以形成呈色剂。然后培养板离心（2000× g，10分钟），并将产生的沉淀物溶解在200 μL DMSO中。使用微孔板读数器（SPECTROstar Nano，BMG LABTECH，奥滕贝格，德国）在570 nm和690 nm处记录溶解后呈色剂的吸光度。杀菌活性以相对于阳性对照组中细菌数量的百分比表示，阳性对照组设为100%。

2.4. 对PLHC1肿瘤细胞系的细胞毒性
PLHC1细胞系（ATCC? CRL2406?）源自Poeciliopsis lucida肝脏细胞癌，接种在25 cm2的塑料培养瓶中，培养基为Eagle’s Minimum Essential Medium（EMEM，Sigma-Aldrich，马德里，西班牙），补充了5%胎牛血清（FBS，Life Technologies，卡尔茨巴德，CA，美国）、2 mM L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，MA，美国）、100 i.u./mL青霉素/链霉素（Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，MA，美国）和1.0 mM丙酮酸钠（Sigma-Aldrich，马德里，西班牙）。细胞在30°C、85%湿度和5%二氧化碳的湿润培养箱中培养。处于指数生长阶段的细胞通过使用胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，西班牙马德里）（0.05%的PBS溶液中，pH 7.2–7.4）短暂处理后从培养瓶中分离出来，遵循标准的胰蛋白酶处理程序。分离出的细胞通过离心（200×g，5分钟，30°C）回收，并通过台盼蓝排除法评估其存活能力。每种测试浓度的细胞毒性实验重复进行三次。当培养物达到大约80%的汇合度时，使用胰蛋白酶将细胞分离出来，并将每个孔中含有30,000个细胞的100微升 aliquots 种子在96孔组织培养板上培养（24小时，30°C）。这种接种密度之前已经过评估，可以提供适当的吸光度值以进行细胞毒性实验，同时防止细胞过度生长。这个培养期结束后，培养基被替换为每孔200微升含有水溶性、乙醇溶性或甲醇溶性山金车前草药提取物的EMEM（详见第2.1节）。然后细胞在30°C下继续培养24小时。单独的培养基作为阴性对照，而保持在相同培养基中的细胞作为阳性对照[27]。暴露期结束后，移除培养基，并加入200微升MTT溶液（在不含FBS的补充EMEM中，浓度为1 mg/mL）以确定细胞存活情况。在22°C下培养4小时后，丢弃MTT溶液，并用100微升DMSO溶解形成的甲瓒晶体。然后在黑暗中以100转/分钟的速度摇晃平板5分钟，使用微孔读数器在570和690纳米处测量吸光度。

2.5. 头肾白细胞（HKL）分离、存活能力和免疫参数
2.5.1. 动物
从西班牙马萨龙的一个当地渔场获得了十二条黄鲷鱼（Sparus aurata L.），平均体重为128.49 ± 3.84克，平均总长度为18.11 ± 0.25厘米，在穆尔西亚大学（西班牙）的海洋鱼类设施中适应了一个月。鱼类被饲养在一个循环系统中，系统中配有个人工呼吸器和生物及机械过滤器。水温维持在20 ± 2°C，盐度维持在28‰。每周监测水质参数，包括氨、硝酸盐和亚硝酸盐。光照周期调整为12小时光照和12小时黑暗。鱼类每天喂食商业饲料（Skretting，西班牙布尔戈斯），饲料量相当于总生物量的2%。所有实验程序均得到穆尔西亚大学伦理委员会的批准，批准号为A13160416。

2.5.2. HKL分离和培养
鱼类用丁香油（20 mg/L，Guinama?，西班牙瓦伦西亚）麻醉，并通过从尾静脉放血处以安乐死。切除的头肾被切成小块，然后根据Esteban et al. [28]的方法分离白细胞。所有提取物的渗透压使用Vapro 5520渗透计（Wescor，美国犹他州洛根）测量。随后将提取物重新悬浮在sRPMI（Sigma-Aldrich，西班牙马德里）中，并为每个浓度制备稀释液。λ-卡拉胶（Sigma-Aldrich，西班牙马德里，CAS编号：9064-57-7）在无菌PBS中稀释成10 mg/mL的储备溶液，然后重新悬浮在sRPMI中以获得最终剂量。对于每条鱼和每次实验，将500 μL的海鲷鱼HKLs（之前调整为2 × 10^7个细胞/mL）分配到24孔板（Nunc，丹麦罗斯基勒）中。进行两次连续实验。在山金车前草药提取物生物活性实验中，HKLs暴露于每种山金车前草药提取物溶液中，最终浓度分别为0、0.001、0.01、0.125、0.25和1 mg/mL。细胞在与每种提取物共同孵育24小时后，条件为25°C、85%湿度和5%二氧化碳。我们选择了水溶性山金车前草药提取物来开发卡拉胶刺激实验。在这种情况下，HKLs分别与250 μL的λ-卡拉胶（最终浓度为0 mg/mL，PBS稀释在sRPMI中；作为对照）和1000 μg/mL的水溶性山金车前草药提取物（最终浓度分别为0 mg/mL，PBS稀释在sRPMI中；作为对照）共同孵育，条件与山金车前草药提取物生物活性实验相同。选择λ-卡拉胶的浓度是基于其先前的体外实验中显示的白细胞激活能力[29,30,31]。从六条独立的鱼中分别获取HKLs用于这两种实验，不进行合并。

2.5.3. HKL存活能力
使用流式细胞术（FACScan，Becton Dickinson，美国新泽西州富兰克林莱克斯）和碘化丙啶（PI，Sigma-Aldrich，西班牙马德里）通过propidium iodide来评估两种实验中HKLs的存活能力，以确定存活白细胞的数量，具体方法如Cuesta et al. [32]所述。阳性对照为空腹处理的细胞，即用50 μL的0.02%溴化倒丁基三甲铵（CTAB，Sigma-Aldrich，西班牙马德里）处理10分钟（在黑暗中旋转60转/分钟），然后与50 μL的PI混合。死亡细胞以PI阳性细胞的百分比来量化。对于每个样本，分别确定总白细胞存活能力和嗜酸性粒细胞（AGs，R1）、单核细胞/巨噬细胞（MM，R2）以及淋巴细胞（R3）的特异性存活能力，并根据SSC和FSC在点图中表示这些群体。

2.5.4. 免疫细胞参数
使用Quade & Roth [33]描述的方法测量HKLs中的过氧化物酶活性，没有HKLs的标准样本作为空白对照。通过化学发光法[34]检测HKLs的呼吸爆发活性，并通过计算每条曲线的斜率（min^-1）来评估反应的动力学。使用流式细胞术和荧光素异硫氰酸酯（FITC，Sigma-Aldrich，西班牙马德里）标记的热灭活的酿酒酵母（菌株S288C）来研究HKLs的吞噬活性，具体方法如Rodríguez et al. [35,36]所述。每个吞噬实验中都包含了FITC标记的S. cerevisiae和HKLs的标准样本。吞噬能力表示为吞噬细胞群体中包含一个或多个酵母（绿色-FITC荧光细胞）的百分比，而吞噬能力表示为平均荧光强度。

2.5.5. HKL超微结构
为了确定HKLs在与λ-卡拉胶和水溶性山金车前草药提取物孵育后的可能形态变化，根据Reynolds [37]的方法对样本进行透射电子显微镜（TEM）处理。孵育24小时后，HKLs离心（400×g，5分钟，22°C），用250 μL的sRPMI洗涤，然后用200 μL的2.5%戊二醛溶液固定，该溶液在0.1 M的碳酸钙缓冲液中配制（pH 7.2–7.4，5–10分钟，4°C）（Sigma-Aldrich，西班牙马德里）。随后在1%的OsO4中后固定2小时（Sigma-Aldrich， Spain Madrid），并用Kit Resina Embed-812（Aname， Spain Madrid）包埋。使用Reichert-Jung Ultracut超薄切片机（Wien，奥地利）制备半薄切片和超薄切片。半薄切片用甲苯胺蓝染色，而超薄切片则用醋酸铀和柠檬酸铅对比染色。超薄切片用透射电子显微镜（TEM，Zeiss EM 10C，Oberkochen，德国）观察。

2.5.6. HKL基因表达
从黄鲷鱼数据库[38]中检索了选定基因的序列。使用ExPASy翻译软件（SIB生物信息学资源门户：https://web.expasy.org/translate/，访问日期2021年6月4日）识别开放阅读框（ORF），并通过NCBI BLAST（NIH）（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，访问日期2021年6月4日）进行序列比对分析进一步验证。引物（表1）使用Thermo Fisher OligoPerfectTM工具设计，遵循以下标准：（i）每个寡核苷酸由20个核苷酸组成，（ii）扩增子长度在100到120个核苷酸之间，（iii）鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）%在55%到60%之间，（iv）退火温度（熔解温度）尽可能接近60°C，（v）避免选择可能自我抑制形成发夹结构的引物，以免妨碍扩增反应。HKLs与λ-卡拉胶和水溶性山金车前草药提取物孵育24小时后，通过离心（400×g，10分钟，22°C）收集细胞，并在-80°C下保存直至分析。按照制造商的说明使用Pure Link? RNA Mini Kit（Life Technologies，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）提取总RNA。使用Nanodrop?分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）评估RNA的数量和纯度，260:280比率介于1.8到2.0之间。随后用DNase I（Promega，美国威斯康星州麦迪逊）处理RNA样品以消除基因组DNA的污染。从1 μg的总RNA中使用SuperScript IV逆转录酶（Life Technologies，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）和寡聚-dT18引物合成互补DNA（cDNA）。在本研究中，使用QuantStudio? Real-Time PCR System Fast（Life Technologies，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）通过实时qPCR分析选定基因的表达。每个反应混合物包含5 μL的SYBR Green supermix、2.5 μL的引物（每个0.6 μM）和2.5 μL的cDNA模板。扩增条件包括初始95°C孵育10分钟，随后40个循环，每个循环15秒在95°C，1分钟在60°C，最后一步15秒在95°C，1分钟在60°C，15秒在95°C。基因表达使用2?ΔCt方法计算，并进行了修改[39,40]。简要来说，在计算ΔCt之前，首先对每个样本的技术重复样品的Ct值进行平均。然后使用参考基因进行归一化，表达相对表达为2?ΔCt。没有cDNA的反应作为阴性对照，所有样品重复三次。对于每个mRNA，表达水平使用每个样本中的核糖体蛋白（18s）和延伸因子1-alpha（ef1a）RNA水平的几何平均值进行归一化。基因名称遵循斑马鱼的公认命名法（http://zfin.org/，访问日期2021年6月4日）。

2.6. 统计分析
结果以平均值±标准误差（SEM）表示。在山金车前草药提取物生物活性实验中，数据使用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）进行分析，然后使用Tukey事后检验来识别实验组之间的差异。在卡拉胶刺激实验中，数据使用双因素方差分析（TWO-WAY ANOVA）进行分析，然后使用Tukey事后检验来评估λ-卡拉胶和增加的山金车前草药浓度的效应。数据正态性使用Shapiro–Wilk检验进行评估，方差同质性使用Levene检验进行验证。所有统计分析均使用SPSS软件（版本25.0；SPSS Inc.，美国伊利诺伊州芝加哥）进行。所有分析的统计显著性设置为p < 0.05。

3. 结果
3.1. 山金车前草药提取物生物活性实验
3.1.1. 总抗氧化活性
水溶性、乙醇溶性和甲醇溶性的山金车前草药提取物表现出剂量依赖性的抗氧化活性。然而，水溶性提取物的两个最高浓度（0.5和1 mg/mL）显示出比其他测试浓度更高的抗氧化活性（图2A）。同样的水溶性提取物的0.25 mg/mL浓度比较低浓度（0、0.001和0.01 mg/mL）具有更高的活性。对于乙醇溶性提取物，只有最高浓度显示出比其他浓度更高的抗氧化活性（图2B）。此外，接下来的两个乙醇溶性提取物浓度（0.25和0.5 mg/mL）也比同一提取物的较低浓度具有更高的抗氧化活性。另一方面，三个较高的甲醇溶性提取物浓度比0、0.001和0.01 mg/mL的浓度具有更高的抗氧化活性（图2C）。
图2. 不同浓度（0、0.001、0.01、0.125、0.25、0.5和1 mg/mL）的水溶性（A）、乙醇溶性（B）和甲醇溶性（C）山金车前草药提取物的总抗氧化活性（以抗坏血酸当量计算）。误差条代表平均值的标准误差（n = 6）。不同字母表示对照组（0 mg/mL；PBS/DMSO稀释在PBS中）和实验浓度之间的显著差异（ANOVA；p < 0.05）。

3.1.2. 杀菌活性
关于杀菌活性，尽管在与水溶性提取物孵育时没有观察到对V. harveyi和V. anguillarum的杀菌活性有统计学差异，但这种提取物的最高浓度（1 mg/mL）对P. damselae的杀菌活性高于其他浓度，除了0.5 mg/mL的浓度没有统计学差异（图3A）。相比之下，相同浓度（1 mg/mL）的乙醇提取物和甲醇提取物在杀灭V. harveyi细菌方面表现出比其他所有浓度更高的活性，除了0.5 mg/mL的浓度。此外，当使用三种最高浓度的乙醇提取物（0.25、0.5和1 mg/mL）或甲醇提取物进行培养时，观察到其对V. anguillarum的杀菌活性呈剂量依赖性增加。相反，与对照组和其他实验剂量相比，使用0.5和1 mg/mL的乙醇提取物培养后，对P. damselae的杀菌活性有所下降。最高浓度的甲醇提取物也对这种病原菌显示出显著的杀菌活性降低。在本研究中使用的任何提取物剂量下，均未检测到对T. maritimum的杀菌活性变化。图3显示了（A）对Vibrio harveyi、V. anguillarum、Photobacterium damselae和Tenacibaculum maritimum的杀菌活性热图；（B）对PLHC1肿瘤细胞系的细胞毒性活性；以及（C）用不同浓度（0、0.001、0.01、0.125、0.25、0.5和1 mg/mL）的水提取物、乙醇提取物和甲醇提取物培养的欧洲鲽鱼头部肾脏白细胞的存活率。热图右侧的颜色刻度代表毒性水平，绿色、白色和蓝色分别表示提取物对测试细菌/细胞的低、中和高毒性。不同的字母表示对照组（0 mg/mL；PBS/DMSO稀释于PBS）与实验浓度之间的显著差异（ANOVA；p < 0.05）。

3.1.3 细胞毒性
细胞毒性测定结果显示，水提取物没有影响PLHC1细胞系的存活率（图3B）。相比之下，最高浓度的乙醇提取物显示出最高的细胞毒性。此外，四种最高浓度的甲醇提取物（0.125、0.25、0.5和1 mg/mL）在PLHC1细胞系中表现出剂量依赖性的细胞毒性，而使用较低浓度提取物培养的细胞则没有这种效应。

3.1.4 总头部肾脏白细胞（HKL）存活率
我们的结果显示，与使用其他实验剂量（0、0.001、0.01、0.125、0.25和0.5 mg/mL）培养的HKL相比，使用1 mg/mL水提取物培养24小时后，HKL的总存活率下降（图3C）。此外，使用较高浓度乙醇提取物（0.25、0.5和1 mg/mL）或甲醇提取物培养的HKL的存活率也呈剂量依赖性下降。相比之下，虽然使用任何浓度的水提取物培养的AGs和淋巴细胞的存活率没有显著差异，但使用1 mg/mL相同提取物培养的MM的存活率与其他测试剂量相比下降（表2）。有趣的是，使用M. alba的乙醇提取物和甲醇提取物培养24小时后，所有类型细胞的存活率都显著下降。此外，这种存活率的下降对于MM和淋巴细胞都是剂量依赖性的。

3.1.5 免疫细胞参数
与使用0（对照组）、0.001和0.01 mg/mL相应提取物培养的HKL相比，使用1 mg/mL水提取物、乙醇提取物和甲醇提取物培养24小时后，HKL的过氧化物酶活性下降（图4A–C）。此外，使用0.125、0.25和0.5 mg/mL甲醇提取物培养的HKL的过氧化物酶活性也显著下降，而使用相同浓度的水提取物和乙醇提取物培养的HKL则没有这种下降。HKL的呼吸爆发活性也呈剂量依赖性下降，当使用0.5和1 mg/mL水提取物以及0.125、0.25和0.5 mg/mL乙醇和甲醇提取物培养时，这种活性完全被抑制（图4D–F）。图4显示了使用不同浓度（0、0.001、0.01、0.125、0.25和1 mg/mL）的（A,D）水提取物、（B,E）乙醇提取物和（C,F）甲醇提取物培养24小时后，欧洲鲽鱼头部肾脏白细胞的过氧化物酶活性（U 107白细胞）和呼吸爆发活性（斜率/分钟）（a.u.（发光强度）的变化。误差条代表平均值的标准误差（n = 6）。不同的字母表示对照组（0 mg/mL；PBS稀释于RPMI培养基）与实验浓度之间的显著差异（ANOVA；p < 0.05）。

3.2 卡拉胶刺激试验
3.2.1 白细胞存活率
总体存活率结果显示，使用任何剂量的λ-卡拉胶或欧芹水提取物培养的HKL之间没有显著差异。关于白细胞亚群的存活率，当在没有λ-卡拉胶的情况下使用欧芹提取物（0.25和0.5 mg/mL）培养时，AGs的存活率呈剂量依赖性下降（表3）。然而，当使用最高剂量的欧芹提取物（0.5 mg/mL）培养时，AGs的存活率下降。与对照组相比，使用欧芹提取物（0.5 mg/mL）培养的MM的存活率也下降。相比之下，无论是否含有λ-卡拉胶，使用欧芹水提取物（0.25和0.5 mg/mL）培养的淋巴细胞的存活率略有增加。

3.2.2 细胞免疫参数
与使用0 μg/mL λ-卡拉胶和0 mg/mL欧芹提取物培养的HKL相比，使用λ-卡拉胶和欧芹的组合培养的HKL的过氧化物酶活性没有变化（图6A）。然而，随着欧芹剂量和1000 μg/mL λ-卡拉胶剂量的增加，这种活性呈剂量依赖性下降。HKL的吞噬能力没有受到λ-卡拉胶的影响（图6C）。相比之下，与不使用欧芹的HKL（0 mg/mL）相比，使用λ-卡拉胶和欧芹的组合培养的HKL的吞噬能力下降（图6D）。此外，随着欧芹剂量和不含λ-卡拉胶的HKL（0 μg/mL）剂量的增加，这种能力也呈剂量依赖性下降。然而，仅在使用最高浓度欧芹提取物（0.5 mg/mL）和λ-卡拉胶的组合培养的HKL中，这种能力降低（图5A–C）。此外，与使用最低剂量培养的HKL相比，使用0.25、0.5和1 mg/mL这些提取物培养的HKL的吞噬能力也下降（图5D–F）。

3.2.3 白细胞的超微结构
电子显微镜研究未发现使用两种混合物（λ-卡拉胶或欧芹）的对照溶液培养的AGs、MM和淋巴细胞存在形态学变化（图7A–C）。然而，使用λ-卡拉胶（1000 μg/mL）和欧芹（0.5 mg/mL）培养的AGs和MM显示出明显的超微结构改变（图7D,E）。这两种细胞类型从更圆形的形状变为更细长、不规则且较大，细胞质有延长部分，细胞质中有次级溶酶体，甚至可以看到细胞碎片的吞噬现象。暴露于相同混合物的淋巴细胞没有观察到形态学变化（图7F）。

3.2.4 基因表达分析
分析了NF-κB亚基（rela、relb、crel、nfkb1和nfkb2）、两种促炎症细胞因子（il1b和tnfa）、两种抗炎症细胞因子（il10和tgfb）以及四种参与细胞凋亡的caspase（casp1、casp3、casp8和casp9）的基因表达谱。数据总结在图8中。首先，与对照组相比，使用λ-卡拉胶（1000 μg/mL）培养的HKL中crel和casp9的表达下调。此外，使用欧芹（0.5 mg/mL）培养也下调了这两种基因的表达。相比之下，使用欧芹（0.5 mg/mL）培养上调了il1b的表达。在使用任何组合提取物培养的HKL中，rela、relb、nfkb1、nfkb2、tnfa、il10、tgfb、casp1、casp3和casp8基因的表达值没有显著变化。

4. 讨论
本研究比较了不同传统欧芹制剂在鱼类体内外实验中的生物活性，旨在确定提取溶剂是否会影响病原体和宿主细胞的反应。包含水提取物是为了模拟草药浸剂，而包含乙醇提取物和甲醇提取物是为了代表酒精浸出液，因为已知溶剂和提取条件会影响回收化合物的化学成分[43]。浓度范围（0.001–1 mg/mL）是基于之前使用Origanum vulgare和Lavandula sp.等药用植物提取物对欧洲鲽鱼白细胞和鱼类细胞系的体外研究选择的，其中反应强烈依赖于提取物类型和剂量[27,44]。迄今为止，大多数关于欧芹的研究集中在其植物化学成分上，但在鱼类中的研究较少[15,45,46,47]。在这种情况下，通过比较牛膝草（Arnica montana L.）以及其他物种如迷迭香（Rosmarinus officinalis L.）、百里香（Thymus vulgaris L.）和牛至（O. vulgare L.）的溶剂提取物，发现水提取物通常能回收更高比例的酚酸（主要是二咖啡酰奎宁酸），而乙醇和甲醇等有机溶剂则更倾向于回收亲脂性成分，如萜类化合物[48,49]。此外，由于乙醇作为有机溶剂的介电常数较高，因此在乙醇提取物中通常会发现更多的萜类物质[48,49]。这一现象表明，水溶剂和有机溶剂能够提取出不同比例的化合物[47]，尽管还需要进一步的研究来确定牛膝草中哪些生物活性成分导致了这些差异。因此，这些背景信息有助于解释本研究中不同牛膝草制剂之间的差异。

在常被报道的药用植物的生物活性中，抗氧化能力尤为突出，它与清除自由基和螯合金属有关，从而限制了氧化应激造成的损伤[50,51]。牛膝草中含有的单萜类化合物（如樟脑和薄荷醇）以及黄酮类化合物（如山柰酚和槲皮素）已被证实具有抗氧化特性。此外，水提取物中较高的酚类含量使其具有更强的抗氧化活性，这与其清除自由基的能力有关[52,53]。体外实验表明，山柰酚可以增加一氧化氮的产生并降低二甲基精氨酸的水平[54,55]。然而，薄荷醇等单萜类化合物也可以通过增强超氧化物歧化酶（一种催化超氧阴离子(O2-)与分子氧(O2)或过氧化氢(H2O2)反应的酶）的活性来减轻氧化应激和自由基的毒性[56,57]。在我们的研究中，三种提取物均表现出剂量依赖性的抗氧化活性，说明这种性质在所测试的传统制剂中得以保留。类似的剂量相关模式在类似体外实验中也得到了广泛验证，其中效应随着浓度的增加而变得更加显著[27,43,49]。有趣的是，最近的研究首次发现了牛膝草乙醇提取物中存在色素（类胡萝卜素、叶绿素和黄质），这些成分也可能对其抗氧化活性有所贡献[58]。

研究药用植物的另一个重要方面是它们对抗鱼类细菌病原体的潜力，因为机会性感染是海洋水产养殖的主要问题之一[59,60]。先前的体外实验表明，牛膝草酮类提取物对利什曼原虫(Leishmania donovani)和溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)具有抗寄生虫作用[61]。此外，牛膝草的乙酸酯和二氯甲烷提取物由于含有黄酮类、萜类和精油，表现出对白色念珠菌(Candida albicans)和匍匐根霉(Rhizopus stolonifera)的抗真菌活性，以及对多种人类细菌病原体（如Mycobacterium phlei、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗菌活性[62]。然而，关于其对鱼类病原体的影响的信息仍然有限。在本研究中，我们评估了三种提取物对四种机会性海洋细菌（V. harveyi、V. anguillarum、P. damselae和T. maritimum）的杀菌活性，选择这些细菌是因为它们是引起养殖鱼类疾病的重要病原体，并且具有经济影响[63,64]。值得注意的是，所有检测的细菌均为革兰氏阴性菌，这类细菌通常比革兰氏阳性菌对植物提取物的敏感性较低，这可能是某些情况下观察到中等杀菌活性的部分原因[65,66]。在我们的实验条件下，水提取物的杀菌活性有限，仅在最高浓度时对P. damselae显示出显著效果。相比之下，乙醇和甲醇提取物在较高剂量下表现出更强的杀菌活性，尤其是在V. harveyi和V. anguillarum中，最高浓度下细菌存活率降低更为明显。水提取物、乙醇提取物和甲醇提取物之间的杀菌活性差异也可能源于各自提取的有效成分以及对微生物生长的不同抑制作用[15,47]。例如，槲皮素等黄酮类化合物通过抑制细菌DNA旋转酶发挥抗菌作用，而樟脑和薄荷醇等单萜类化合物则可以破坏细菌膜的结构[57,67]。据推测，某些植物化学物质（如萜类）中的乙基基团(-CH2-CH3)能够穿透细菌细胞壁，产生负电荷自由基，从而抑制参与细胞周期和肽聚糖合成的酶，并影响膜通透性[68,69,70]。之前的类似研究也表明，有机溶剂提取物相比水提取物通常具有更强的抗菌效果，这种差异取决于所分析的病原体[21,27]。有趣的是，对于P. damselae，乙醇和甲醇提取物在最高浓度下反而表现出较低的杀菌活性，而这种现象在V. harveyi和V. anguillarum中并未发生。据报道，P. damselae能够降解细胞外脂质并将其作为碳源和能量来源，在适宜条件下有利于其生长[71]。这种代谢能力可能解释了实验中观察到的现象，因为在最高浓度下，提取物中的有机物质可能反而促进了细菌的存活。

除了上述生物活性外，评估细胞毒性对于确定可以解释细胞反应的浓度范围至关重要。与其他菊科植物类似，牛膝草的化学成分中不含通常具有细胞毒性的生物碱[15,72]。因此，高浓度的单萜类和黄酮类化合物可能产生相反的效果，导致毒性[45]。萜类化合物含有不同官能团（如羰基(-CO)、醛基(-CHO)或羟基(-OH)，其中羟基的存在与细胞毒性相关，可能增加膜通透性并影响线粒体呼吸链相关的蛋白质[73,74]。据报道，薄荷醇等萜类化合物对人类上皮结直肠癌细胞具有细胞毒性[75]。在本研究中，使用PLHC1细胞这一肿瘤来源的鱼类细胞系来评估提取物的细胞毒性[23]。结果表明，乙醇和甲醇提取物在中等和高浓度下显著降低了PLHC1肿瘤细胞系的存活率，而水提取物的影响相对较小。PLHC1肿瘤细胞系的强烈反应表明，这些醇提取物可能含有干扰细胞存活的生物活性成分（可能是萜类）。这与先前报道的乙醇提取物对肿瘤细胞系的细胞毒性一致，包括在人类肺腺癌细胞A549上测试的O. vulgare提取物以及在人类肝细胞HepG2上测试的Moringa stenopetala叶片和种子提取物[22,49]。牛膝草中某些亲脂性化合物（如单萜类薄荷醇）在乙醇提取物中更易提取，这些化合物对人类上皮结直肠癌细胞具有细胞毒性[57,75]，这也解释了醇提取物相比水提取物具有更强活性的现象。

HKLs是鲷鱼先天免疫反应的主要效应细胞群，其中辅助凝集细胞(AGs)和单核巨噬细胞积极参与吞噬作用和其他防御机制，以应对外部刺激或外来物质[28]。此外，AGs可以通过激活NADPH氧化酶来触发呼吸爆发活动，增加氧气消耗和活性氧(ROS)的产生。它们还可以通过释放过氧化物酶（具有抗菌活性）到细胞外空间来促进脱颗粒作用[76,77]。因此，HKLs被用作评估鱼类先天免疫反应的主要细胞模型[20,28]。在牛膝草提取物的生物活性测试中，结果显示，在降低存活率的浓度下，过氧化物酶活性、呼吸爆发和吞噬能力显著下降，尤其是乙醇和甲醇提取物。在相对于存活率适宜的浓度下，水提取物的过氧化物酶活性基本不变，而甲醇提取物在低至中等浓度(0.01和0.125 mg mL?1)时呼吸爆发明显降低，水提取物在中等浓度(0.125、0.25、0.5 mg mL?1)时吞噬能力下降，表明即使在未明显降低存活率的情况下也能抑制这些特定功能。这些结果与多项体外研究一致，这些研究表明高剂量植物提取物不仅不会刺激免疫细胞，反而会降低其活性[2,44]。相比之下，喂食牛膝草后15天内观察到免疫刺激作用，包括HKLs的吞噬活性增强和皮肤黏液中的过氧化物酶水平升高[19]，这突显了体外直接暴露与体内系统反应之间的差异。

基于这些观察结果，我们选择了水提取物进行用λ-卡拉胶刺激HKLs的实验，使用的浓度与存活率相当(0、0.25和0.5 mg mL?1)。卡拉胶浓度(0和1000 μg mL?1)的选择基于其已知的激活HKLs的能力，包括促进吞噬作用和ROS相关反应以及上调proinflammatory基因（如il1b、tnfa和il6）[29]。这种能力源于卡拉胶的非典型结构，其中含有硫酸基团和不寻常的α-1,3-半乳糖苷键，这些特征对其在体外刺激鱼类白细胞的作用至关重要[29]。据此，单独使用λ-卡拉胶处理的HKLs表现出预期的激活效应，包括吞噬作用和呼吸爆发活动的变化。当水提取物与卡拉胶共同作用时，呼吸爆发和吞噬活动趋于恢复到接近对照水平的值，表明牛膝草具有调节免疫的作用。此外，高浓度卡拉胶和牛膝草暴露后，辅助凝集细胞和巨噬细胞的超微结构变化显示了活化特征，包括细胞质扩张和与活跃吞噬过程相关的次级溶酶体的出现[29]。这种活化也在体内得到了证实，卡拉胶能够在肌肉注射后招募嗜酸性粒细胞、单核巨噬细胞及其他细胞类型（如分泌皮脂的细胞和脂肪细胞）[77,78]。然而，水提取物中富含黄酮类化合物（如槲皮素）以及少量单萜类化合物（如薄荷醇）也可能导致细胞毒性，因为羟基的存在可以增加膜通透性并影响线粒体呼吸链相关蛋白质[73,74]。这也解释了在最高浓度下观察到的细胞碎片现象以及HKLs存活率的下降。

在基因表达分析方面，我们首先关注NF-κB亚基（RelA、RelB、C-Rel、NF-κB1和NF-κB2）的表达，因为它们在协调细胞因子和促炎分子的转录调控中起核心作用[79]。在哺乳动物中，RelA:NF-κB1异源二聚体通常与经典炎症信号通路相关，而RelB:NF-κB2组合则构成非经典或替代激活通路，其中c-REL亚基在此过程中起次要作用[80]。在我们的研究中，与λ-卡拉胶或山金车提取物孵育的鲢白细胞（HKLs）中cREL基因的表达下调，这与我们团队之前的研究结果一致，表明c-REL可能是鱼类白细胞中一个重要的调控节点[41,81]。此外，caspase-9负责激活下游的执行级caspase（caspase-3、-6和-7），是细胞凋亡内在途径的关键启动子和调节因子[82]。λ-卡拉胶和山金车提取物对caspase-9的下调可能是另一种防止不必要的细胞凋亡发生的调控机制。因此，尽管山金车被认为是一种重要的抗炎剂，但本研究发现其促IL-1β表达上调的现象可能是由于其中含有黄酮类化合物（如槲皮素）所致[83]。这种上调可能更适合作为细胞激活或应激的标志，或是鲢白细胞群体中响应性亚群比例变化的反映，而非炎症状态的改变。这种解释与体外研究结果一致，即鲢白细胞直接接触植物提取物并不一定会产生与体内预期的相同效果[2,21,44]。

5. 结论

本研究通过使用鱼类相关的体外检测方法，对传统的水制和酒精制山金车提取物进行了比较。所测试的三种提取物均表现出剂量依赖性的抗氧化能力，但它们对细菌和细胞的影响因提取物和浓度而异，尤其是在考虑细胞存活率时尤为明显。乙醇和甲醇提取物在最高浓度下显示出最强的杀菌活性，并显著降低了PLHC1的活性；而水提取物则表现出能够降低预先被λ-卡拉胶刺激的鲢白细胞中的免疫参数。总体而言，这些结果为未来关于鱼类山金车提取物的研究提供了比较基础。