铜氧化物纳米颗粒暴露途径对杂色蛤（Ruditapes decussatus）的影响 Maria J. Bebianno, Mustafa Tuncsoy, Thiago L. Rocha, Tania Gomes, Taina Garcia

《Fishes》：Impact of Exposure Routes of Copper Oxide Nanoparticles in the Clam Ruditapes decussatus Maria J. Bebianno, Mustafa Tuncsoy, Thiago L. Rocha, Tania Gomes and Taina Garcia

　　摘要
随着工程纳米粒子在各种应用中的产量增加，以及这些粒子可能从点源和扩散源释放到海洋环境中，海洋健康已变得令人担忧。由于其独特的物理性质，尤其是高表面积与体积比，这些纳米粒子对海洋生物的生物可利用性和毒性可能会增强。氧化铜纳米粒子（CuO NP）尤其普遍，因为它们有广泛商业用途。在水生环境中，这些纳米粒子通常会成为胶体的一部分，并经历物理化学变化，最终形成聚集物并沉降到底部基底。因此，沉积物以及水柱成为底栖生物暴露的主要途径。Rudipates decussatus蛤是一种在欧洲具有重要生态和经济价值的悬浮物摄食者。将Rudipates decussatus蛤暴露于CuO NP（10 μg L?1）或等浓度的离子铜（Cu2+）中，分别在水中和水/沉积物混合物中持续15天，以比较不同暴露途径的毒性影响。监测了鳃和消化腺中的铜积累情况，以及各种敏感度、暴露和损伤的生物标志物。结果揭示了不同的吸收模式，这些模式取决于暴露途径、金属的化学形式和特定组织的反应，突显了这些污染物对海洋生物多样性的复杂影响。

1. 引言
随着工程纳米粒子（ENPs）（至少有一个尺寸在1到100纳米之间）在日常生活中的生产和应用的增加，以及它们可能从点源和扩散源释放到海洋中，随后对不同生物组织水平、海洋健康和人类健康的影响，这已成为一个令人担忧的问题[1]，需要在“同一健康”（One Health）框架内进行评估[2]。“同一健康”方法通过一个综合的、基于系统的框架来认识到人类、动物和环境健康的相互依存性，旨在提高人口福祉，加强疾病预防和控制，并确保生态系统的韧性和长期可持续性[3]。在ENPs中，金属纳米粒子尤为重要，因为它们有广泛的工业和商业应用[4]。例如，氧化铜纳米粒子（CuO NP）因其抗菌性能和高导热及导电性而被广泛使用[5]。相比之下，离子铜在天然中含量丰富，常见于矿物盐和有机化合物中，并广泛用于防污涂料，同时也具有重要的生物学作用[6,7]。尽管如此，ENPs仍然是新兴污染物，在水生系统中的检测方法有限，缺乏可靠的环境风险评估策略[8]。
金属ENPs的行为和毒性与其离子形式不同。由于其高表面积与体积比，ENPs可以与生物膜相互作用，穿透细胞，并产生活性氧（ROS），这既由粒子的反应性也由离子释放驱动[9,10]。然而，CuO NP在海水中的溶解度低，表明它们的毒性可能主要来自纳米粒子本身的特性，而不仅仅是释放的离子[11,12]。事实上，有报道表明在某些条件下CuO NP比离子铜更具毒性[13,14]。一旦进入海水，ENPs可以聚集，经历物理化学变化，并沉淀到沉积物中，或者后来重新悬浮到水柱中[15]。这种动态行为增加了底栖和悬浮物摄食生物的暴露风险，这些生物可以从沉积物、孔隙水或沉积物-水界面摄入颗粒[16]。鉴于底栖环境的生态重要性和它们在食物网中的作用，了解ENPs在沉积物中的命运和影响仍然具有挑战性。因此，使用生化生物标志物作为早期预警指标的生态毒理学方法是评估纳米粒子影响的关键[17]。
海洋双壳类动物特别适合进行此类评估，因为它们具有滤食行为和积累污染物的能力。Ruditapes decussatus蛤是一种广泛用作生物指示物种的动物，也具有商业价值[18]。暴露于纳米粒子可诱导海洋生物的氧化应激、蛋白质损伤和基因毒性效应[19,20]。然而，对CuO NP和离子铜的反应因物种和暴露途径而异。例如，研究表明，沉积物中的CuO NP会增加端足类的死亡率，而水中的离子铜可能对多毛类动物有更强的影响[16,21,22]。纳米粒子与溶解铜之间的生物积累模式差异进一步表明不同物种之间存在不同的吸收途径[11]。
在这方面，本研究旨在比较不同暴露情景下CuO NP和溶解铜在Ruditapes decussatus中的积累和毒性效应。采用比较方法，使用仅含水系统和通过水柱污染的水-沉积物系统，以评估暴露基质对毒性的影响。根据海水中报告的易变铜水平[12,23]选择了具有环境相关性的浓度。使用了一系列生物标志物来评估生物学反应，包括抗氧化防御（SOD、CAT、GST）、金属硫蛋白诱导（MT）、氧化损伤（LPO）、神经毒性（AChE活性）和基因毒性（彗星试验）。这些反应在鳃、消化腺和关键的组织中进行了测量，这些组织是污染物吸收的主要目标。这种综合方法支持从“同一健康”角度评估铜的毒性。

2. 材料与方法
2.1. CuO NP 的表征
氧化铜（II）纳米粒子（CuO NP）购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯），制造商指定的尺寸小于50纳米。通过将纳米粒子分散在Milli-Q水中，并使用Ultrasonic bath型超声仪（VWR International，葡萄牙奥埃拉斯；230 V，200 W，45 kHz）进行15分钟的超声处理，制备了CuO NP储备溶液（10 mg L?1）。在整个15天的实验过程中保持持续搅拌，以维持纳米粒子处于悬浮状态[19]。硫酸铜（Cu2+）储备溶液的制备方法类似，但未进行超声处理。
通过透射电子显微镜（TEM，JEM-1230（JEOL，日本东京）确定了250个随机选取的纳米粒子在自然海水中的尺寸分布。将CuO NP（100 mg L?1）稀释在超纯水中，进行超声处理，然后取一滴悬浮液放在Ni网格上晾干，随后在80 kV下进行检查。使用配备Ar离子激光的ALV装置（ALV GmbH，德国朗根）（515.5 nm）通过动态光散射（DLS）进一步表征了自然海水中粒子及其聚集物/团聚体的平均尺寸（对应于水更新和CuO NP重新投加之间的间隔）[19]。图像使用JEM-1230（JEOL，日本）TEM与数码相机（Gatan model 785 ES1000W Erlang Shen CCD，英国伦敦）结合采集。
Zeta电位也通过DLS确定，它提供了有关胶体悬浮液中纳米粒子表面电荷的信息，反映了带相反电荷的薄层离子对纳米粒子表面的吸引力。它通常用于估计胶体的稳定性[24]，值大于+25 mV或小于?25 mV通常表示高稳定性[25]。

2.2. 实验设计
Rudipates decussatus蛤从葡萄牙Ria Formosa潟湖的一个水产养殖场获得（37°1′28.92″ N；7°50′39.20″ W），活体运输到实验室，并在恒定通风和受控温度（18 ± 2 °C）下适应7天。用于生物测定的沉积物也是从Ria Formosa在30米深度收集的，与SIHER项目（Ria Formosa潟湖系统的沉积填充和全新世演化过程）合作进行，该项目由CIMA大学（阿尔加维大学）负责。此程序确保参考沉积物样本受人为影响最小。收集后，沉积物连续通气10天以稳定其pH值（7.8 ± 0.2）。由于沉积物颗粒细小且成分含泥，可能会干扰双壳类的正常进食和呼吸，因此从葡萄牙南部的Faro海滩收集了清洁的、经过洗涤的沙子部分来调整沉积物的颗粒大小分布。这种方法符合标准化沉积物毒性测试指南，允许各种底栖无脊椎动物的生存、生长或繁殖[26,27]。因此，实验中使用的沉积物由34%的淤泥和粘土（<0.062 mm）和66%的沙子（0.25–0.5 mm）组成，基于颗粒大小分布。
适应期后，建立了两个实验系统，每个系统重复三次：（i）含有5升自然海水（来自Ria Formosa潟湖）的水系统；（ii）含有4升自然海水和1升参考沉积物的水-沉积物系统。对于这两个系统，测试了三种处理：对照组（CT）、CuO纳米粒子（CuNP）和CuSO4（Cu）。每个聚乙烯水族箱中放置了20只蛤（2.5只蛤 L?1），通过水柱暴露于相同的标称Cu浓度（10 μg Cu L?1），无论是纳米粒子形式（CuO NP）还是其溶解形式（CuSO4）。选定的Cu浓度基于全球海洋和沿海生态系统报告的现实水平[12,23]。
为了防止纳米粒子聚集，每48小时更新一次水，并通过直接 pipetting 将Cu浓度重新加入水柱中。小心地进行水更新，以避免干扰纳米粒子的稳定性和沉积物的重新悬浮，并尽量减少对生物体的额外压力。动物在整个实验期间仅通过不断更新的自然海水喂养。在15天的生物测定期间，系统在恒定通风和受控光照条件下维持。使用多参数探头（YSI 556MPS，YSI，美国黄斯普林斯）每天测量物理化学参数（温度17 ± 2 °C，盐度34，pH 7.5 ± 0.4）。
在第0天、第7天和暴露第15天从实验装置中采样蛤，进行生化和基因毒性分析。称重并测量蛤的重量。为了评估DNA损伤，立即从后闭壳肌中提取血淋巴（每种处理n = 6只蛤），使用无菌注射器并保持在冰上立即分析。鳃和消化腺（每种处理n = 6只蛤）分别解剖，冷冻在液氮中，并储存在?80 °C下，以便后续匀浆和生物标志物分析。这些分析包括氧化应激生物标志物（超氧化物歧化酶—SOD；过氧化氢酶—CAT）、生物转化活性（谷胱甘肽S-转移酶—GSTs）、细胞膜损伤（脂质过氧化—LPO）和神经毒性（乙酰胆碱酯酶活性—AChE）。

2.3. 状态指数（CI）
为了评估每组双壳类动物（n = 9只蛤）的生理状态，使用以下公式计算状态指数（CI）：状态指数（CI）=（排水重量（g）/ 干壳重量[28]。

2.4. 金属分析
鳃和消化腺（每种条件3个重复，每个池包含2克鳃/消化腺）用HNO3（80 °C）湿法消化，然后通过原子吸收光谱法确定Cu浓度。消化后的样品应用于石墨炉原子吸收光谱仪（AAS AAnalyst 800，Perkin-Elmer，葡萄牙罗加乌）。
为了质量控制，使用了加拿大国家研究委员会的标准化参考材料（龙虾肝胰腺—TORT II.），样品中的Cu含量为（106.4 ± 2.4 μg Cu kg?1 d.w.），与参考材料的水平（106 ± 10 μg Cu kg?1 d.w.）相似。

2.5. 总蛋白含量
根据Bradford描述的方法[29]，使用牛血清白蛋白作为标准，测定了鳃和消化腺中的总蛋白浓度（mg protein g?1组织）。

2.6. 抗氧化酶
蛤的鳃和消化腺（n = 6）在5毫升冰冷的20 mM Tris–蔗糖缓冲液（0.5 M蔗糖，0.075 M KCl，1 mM DTT，pH 7.6）中匀浆。使用VWR Star-Beater（VWR International，葡萄牙）以20次/s的速度振荡5分钟进行匀浆。随后通过两步离心过程获得细胞质部分：首先在4 °C下以1500× g离心15分钟，然后在4 °C下以12,000× g离心45分钟。使用上清液的 aliquots 来测定抗氧化酶（SOD和CAT）和生物转化酶GST的活性。
SOD的活性通过在细胞质部分中测量550 nm处的吸光度变化来量化，该变化是由黄嘌呤氧化酶/次黄嘌呤系统触发的细胞色素c氧化酶还原为细胞色素c还原酶[30]。SOD活性以mmol min?1 mg protein?1表示。过氧化氢酶的酶活性是通过在240纳米处测量吸光度的减少来光谱法测定的，这是由于过氧化氢（H2O2）的消耗所致[31]，并且以μmol min?1 mg protein?1表示。谷胱甘肽S-转移酶的活性是通过测量反应产物（由还原型谷胱甘肽（GSH）与1-氯-2,4-二硝基苯（CDNB）在KH2PO4/K2HPO4缓冲液中的吸光度变化来估计的，该方法采用了Habig等人（1974年）的改编方法[32]。GST活性同样以μmol min?1 mg protein?1表示。

2.7. 金属硫蛋白

R. decussatus的鳃和消化腺（n = 6）在Tris-HCl缓冲液（0.02 M，pH 8.6）和丁基羟甲苯（BHT）（每毫升Tris–HCl缓冲液10 μL BHT）中匀浆。所得匀浆物在4°C下以30,000× g离心45分钟。上清液的部分用于LPO和总蛋白的定量。剩余的上清液在80°C下热处理10分钟以沉淀高分子量蛋白质，然后再次在4°C下以30,000× g离心45分钟。获得的细胞质部分储存在-80°C下，用于通过差分脉冲极谱法进行金属硫蛋白的定量。金属硫蛋白的定量是根据Bebianno和Langston描述的方法[33]，使用Eco Chemie μAutolab III电位计和Metrohm 663VA工作站在葡萄牙进行的。

2.8. DNA损伤

根据Singh等人提出的方法[34]并经过Gomes等人改进[35]，通过彗星实验检测具有DNA损伤的单个细胞。提取的血淋巴（150 μL）分别在4°C下以3000 rpm离心3分钟。获得的细胞沉淀物悬浮在0.65%低熔点琼脂糖（LMA，Kenny盐溶液中），并涂抹在涂有0.65%正常熔点琼脂糖（NMA）的显微镜载玻片上。然后将载玻片浸入裂解缓冲液（2.5 M NaCl，100 mM EDTA，10 mM Tris，1% Triton X-100，10% 二甲基亚砜，1% Sarcosil，pH 10，4°C）中1小时，以破坏细胞膜，去除可溶性细胞成分并使DNA固定在琼脂糖中。随后，将载玻片放入含有碱性缓冲液（300 mM NaOH，1 mM EDTA，pH 13，4°C）的电泳槽中15分钟，以允许DNA解链并表达链断裂。电泳在25 V和300 mA下进行5分钟。载玻片用4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，1 mg/mL）染色，产生的尾部使用光学荧光显微镜（Zeiss Axiovert S100，德国耶拿）和相机（Sony，葡萄牙里斯本）进行分析。DNA损伤的定量使用Komet 5.5图像分析软件（Kinetic Imaging Ltd.，英国诺丁汉）进行，每张载玻片随机选择50个细胞（每个凝胶25个细胞），放大倍数为400倍。

2.9. 乙酰胆碱酯酶活性（AChE）

在鳃中（n = 6）测定乙酰胆碱酯酶（AChE）活性，根据Ellman等人描述的方法[36]，通过反应产生的5-巯基-2-硝基苯甲酸的吸光度变化来确定，该反应与硫代胆碱（底物）和DTNB在412 nm处进行（ε = 13.6 mM?1 cm?1）。AChE活性以nmol min?1 mg protein?1表示。5-巯基-2-硝基苯甲酸的增加量是一种黄色化合物，由于硫代胆碱与5,5′-二硫-双（2-硝基苯甲酸）的非酶反应产生，用于确定乙酰胆碱的降解速率。吸光度在412 nm处读取，结果以nmol ACTC min?1 mg总蛋白浓度表示。

2.10. 脂质过氧化（LPO）

从每种条件下的蛤蜊的鳃和消化腺（n = 6）中分别使用VWR Star-Beater在冰上（5分钟，20/s振荡，带有研磨球）在100 mM Tris–HCl缓冲液（pH 8.6）和100:1 μL Triton中匀浆，然后在4°C下以12,000× g离心30分钟。上清液分为几份，用于总蛋白测定和LPO水平测定。LPO水平根据Erdelmeier等人[37]改进的方法进行定量。该测定基于丙二醛（MDA）和(2E)-4-羟基-2-壬醛（HNE）的光谱检测，吸光度在540 nm处测量。LPO值以每毫克蛋白质的MDA当量（nmol mg?1 protein）表示。

2.11. 统计分析

所有统计分析均使用Statistica 8.0软件（StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA）进行。来自遗传毒性（彗星实验）和生化生物标志物（SOD、CAT、AChE、GST和LPO）的数据经过正态性检验（Shapiro–Wilk检验）和方差同质性检验（Levene’s检验）。一旦满足正态性和同方差性的假设，使用单因素方差分析（ANOVA）评估处理之间的差异，然后使用Tukey的后验多重比较检验，或者当假设不满足时使用非参数等效检验（Kruskal–Wallis）。暴露时间（0天、7天和15天）、铜形态处理（对照组、Cu离子和CuO纳米颗粒）及其交互作用的影响通过双因素方差分析（ANOVA）进行分析（见补充材料，表S1）。对于每种组织和暴露矩阵分别进行比较。在每种条件下，比较不同暴露时间的处理（例如，CT7 vs. CT15），并且也在每个时间点之间评估处理之间的差异（例如，CT7 vs. CuNP7）。此外，对于相同的组织和处理条件，还进行了暴露矩阵（水 vs. 沉积物）之间的比较，以评估暴露场景之间的差异。统计显著性时考虑p < 0.05。

应用多变量主成分分析（PCA）整合所有变量（生物标志物）、暴露矩阵、时间点和处理。PCA用于探索变异模式并识别生物标志物和实验条件之间的关联。使用欧几里得距离矩阵进行层次聚类分析，以评估基于生物标志物反应的处理之间的相似性。聚类使用未加权对组平均法（UPGMA）进行，结果以树状图表示，其中簇之间的距离反映了样本之间的不相似程度。

3. 结果与讨论

3.1. CuO纳米颗粒的表征

了解CuO纳米颗粒在水介质中的物理化学特性和行为对于评估其生物利用度和潜在毒性至关重要。颗粒大小和分布见表1。通过透射电子显微镜（TEM）在天然海水中测定的初级颗粒大小中位数为38.2 ± 1.4 nm（图1），与制造商的规格略有不同。表1. 通过透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）对CuO纳米颗粒的表征。数值为平均值±标准差。图1. 在超纯水中100 mg L?1的CuO纳米颗粒的透射电子显微镜图像。Gomes等人[19]报告称，约53%的CuO纳米颗粒（10 μg L?1）在12小时内从水柱中去除，主要是由于沉降作用，而铜的溶解量低于1%，表明大部分铜以纳米颗粒形式存在。同样，由不同合成方法生产的CuO纳米颗粒（25–55 nm）表现出聚集和多分散性，溶解度有限且依赖于合成方法[38]。聚集似乎是CuO纳米颗粒在海水中的一般行为。即使是经过表面改性的CuO纳米颗粒（10–20 nm），包括中性（PEG）、带负电荷（COOH）和带正电荷（胺，NH3）涂层，也会形成大小分布相似的大聚集体（1137–1530 nm），无论表面功能化如何[39]。

3.2. 状态指数（CI）

为了确保观察到的效应不是由生物体状态引起的混淆，监测了Ruditapes decussatus的状态指数（CI）（表2）。在大多数处理中，CI保持稳定，表明蛤蜊在整个实验过程中都处于良好的生理状态。只有在暴露于离子铜的水系统中的蛤蜊中观察到显著下降，从0.26 ± 0.02降至0.23 ± 0.02（p < 0.05）。在暴露于CuO纳米颗粒或水/沉积物系统的蛤蜊中没有检测到显著的时间或处理相关差异（p > 0.05），证实了处理之间的生理状态相当。表2. 未暴露及暴露于CuO纳米颗粒和CuSO4的水中以及水/沉积物系统中的Ruditapes decussatus蛤蜊的状态指数。

3.3. 铜的积累

铜是一种参与酶促过程和金属硫蛋白的关键金属，但其浓度升高可能具有毒性，特别是对双壳类动物而言。在对照组蛤蜊中未观察到铜水平的显著变化（p > 0.05；图2）。在暴露的蛤蜊中，铜的积累取决于组织、铜形态和暴露矩阵，在消化腺中始终观察到较高浓度。图2. 未暴露或暴露于CuO纳米颗粒及Cu2+的R. decussatus鳃和消化腺中的铜浓度（μg g?1干重），分别在水中（A,B）和水/沉积物矩阵中（C,D）暴露15天后。大写字母表示相同暴露时间下的处理差异，小写字母表示暴露时间之间的差异（p < 0.05）。作为与环境的主要接口，鳃中的铜积累有限。在水系统中，CuO纳米颗粒暴露下铜水平略有增加，但不显著（p > 0.05），而在离子铜暴露下保持不变。在水/沉积物系统中，鳃中的铜水平较低且在处理之间相似，表明与仅含水的系统相比生物利用度降低（图2C）。相比之下，消化腺显示显著积累。在水系统中，铜水平随时间增加，达到初始水平的1.8倍（CuO纳米颗粒）和1.4倍（离子铜）（p < 0.05；图2B）。在水/沉积物系统中未观察到这种增加（p > 0.05；图2D）。这些结果表明，通过鳃吸收的CuO纳米颗粒可能被处理并转移到消化腺，这是主要的积累和解毒场所。双壳类动物中纳米颗粒的摄取可能通过内吞作用发生，特别是对于结合成聚集体的颗粒，尽管转移取决于颗粒大小和聚集状态[12,40]。不同物种之间的差异进一步突出了不同的摄取途径。例如，据报道淡水贻贝中离子铜的积累量高于CuO纳米颗粒，而在多毛类动物中观察到的趋势相反[11,41]。在R. decussatus中，消化腺中的铜积累遵循一级动力学，半衰期为10–12天[42]，表明有活跃的调节和解毒过程。鉴于铜可以通过Fenton型反应促进ROS的生成，因此评估CuO纳米颗粒是否诱导类似的氧化反应至关重要。

3.4. 抗氧化酶

尽管纳米颗粒（NP）引起的海洋双壳类动物毒性的机制尚未完全理解，但其化学反应性和表面特性可以促进活性氧（ROS）的生成，导致氧化应激和抗氧化防御的激活[12,19]。R. decussatus的抗氧化反应随铜形态、组织和暴露矩阵而变化，显示出CuO纳米颗粒和离子铜之间的明显差异（图3）。超氧化物歧化酶（SOD）是一种细胞质中的Cu/Zn含量酶，通过将超氧自由基（O2•?）氧化为过氧化氢（H2O2）来发挥第一道防线的作用，已在Mytilus edulis和R. decussatus中鉴定出SOD[43,44]。图3. 未暴露及暴露于CuO纳米颗粒和Cu2+的R. decussatus鳃和消化腺中的SOD（A–D）、CAT（E–H）和GST（I–M）活性，暴露时间为15天，在水中和水/沉积物矩阵中。大写字母表示相同暴露时间下的处理差异，小写字母表示暴露时间之间的差异（p < 0.05）。在对照组蛤蜊中，SOD活性稳定（p > 0.05）。在暴露下，两种组织中的铜形态之间存在明显差异。CuO纳米颗粒诱导SOD活性逐渐增加，特别是在消化腺中，其值在两个实验系统中分别增加了4倍和2倍（图3C,D；p < 0.05）。这种模式表明了持续的超氧生成和初级抗氧化防御的激活，可能反映了CuO纳米颗粒的积累模式（图2）。相比之下，离子铜产生的反应更为多变，在水/沉积物条件下主要在鳃中显著增加（2倍，图3B），而在消化腺中要么没有显著变化（图3C），要么在水/沉积物系统中短暂增加（图3D）。这表明CuO纳米颗粒引发了更持久的氧化挑战，而离子铜的反应更受环境条件和生物利用度的强烈影响。这些结果与其他双壳类动物的研究结果一致，包括M. galloprovincialis和淡水物种C. rubens，其中SOD活性在CuO纳米颗粒暴露后普遍增加[40,41,45]，并且在M. galloprovincialis鳃中暴露于基于Cu的纳米颗粒后也报告了类似的SOD活性增加，包括依赖于涂层的效应[39]，而在消化腺中SOD活性在7天后增加然后下降，表明超氧生成减少[12]。相比之下，Geret等人[43]报告称，在R. decussatus中，暴露于离子Cu后SOD活性呈快速、浓度依赖性的增加。过氧化物酶（CAT）是一种过氧化物酶体酶，能够将过氧化氢（H2O2）解毒为水和氧气[46]，其变化模式与SOD相反。在CuO纳米粒子（NP）的暴露下，两种组织中的CAT活性均显著增加（最高达到3倍；p < 0.05），尤其是在水系统中的增加，反映了持续产生的H2O2和下游抗氧化防御机制的激活（图3E,G）。相反，离子Cu的暴露通常导致CAT活性不变或降低，尤其是在鳃部，这可能是由于Fenton型反应中的酶消耗或酶活性的抑制（图3E,F）。在水/沉积物系统中，两种形式的Cu都减弱了CAT的反应，进一步强调了基质在调节Cu反应性中的作用（图3F,H）。在CuO NP暴露下，两种组织中的CAT活性增加，特别是在水系统中，这可能反映了ROS（活性氧）产生的增加，特别是H2O2的增加，突显了CAT在ROS解毒中的重要作用。类似的研究结果也在暴露于Cu–ZnO NP的M. galloprovincialis中有所报道[45]。相反，暴露于含石墨烯纳米粒子的R. philippinarum中观察到CAT活性降低，而在短期暴露于离子Cu的蛤蜊和R. philippinarum中也报告了CAT活性的抑制效应[47]。综上所述，这些结果表明，CuO NP引发了更为强烈和协调的抗氧化反应——其特征是持续的SOD诱导和升高的CAT活性——这与长期的ROS生成一致。相比之下，离子Cu诱导的反应较弱、不那么一致，并且更受环境因素的影响，这表明不同形式的Cu在吸收途径、细胞内处理和氧化还原行为上存在差异。抗氧化系统通过SOD、CAT和GST协同工作来减轻Cu暴露产生的ROS。在SOD将超氧自由基转化为过氧化氢以及CAT随后对其进行解毒之后，谷胱甘肽S转移酶（GST）通过将谷胱甘肽（GSH）与内源性和外源性化合物结合，包括脂质过氧化产物，从而促进了它们的解毒和排泄。GST被广泛用作细胞防御和氧化应激敏感性的生物标志物[48,49]。在对照蛤蜊中，鳃部和消化腺中的GST活性显示出时间变化（p < 0.05；图3I–L），但没有与暴露相关的趋势。在Cu暴露下，GST的反应与SOD–CAT的模式相一致并进行了补充，尤其是在消化腺中。在水系统中，CuO NP暴露导致GST活性显著增加（最高达到4倍；图3K；p < 0.05），这与观察到的强烈SOD和CAT诱导一致，表明ROS压力增加和排毒需求增加。相反，离子Cu在消化腺中导致GST活性降低（大约2倍；图3K；p < 0.05），这与较弱的或更短暂的SOD和CAT反应相符，表明氧化挑战较低或控制得更好。在鳃部，GST活性显示出类似但不太明显的模式（图3I），在暴露后7天初期增加，然后在暴露结束时受到抑制，这与离子Cu下的短暂SOD激活和CuO NP下的更持久反应相平行。在水/沉积物系统中，两种形式的Cu都减弱了GST的反应（图3J），这与SOD和CAT反应的减弱一致，表明在沉积物存在下生物利用度较低和氧化应激较低。GST活性的增加表明在消化腺中GSH的利用增强，可能与其因CuO NP暴露引起的膜脂质过氧化而形成的脂质羟基过氧化物有关。此前已有研究报道了CuO NP暴露对蛤蜊Scrobicularia plana（10 μg L?1, 40–500 nm）中GST诱导的影响[50]。同样，在暴露于含石墨烯纳米粒子的R. philippinarum以及暴露于离子Cu的蛤蜊中也观察到了GST的激活[47]。在淡水贻贝C. rubens的鳃部和消化腺中，CuO NP暴露后GST活性和GSH水平也增加[41]。此外，使用相同类型的CuO NP进行的蛋白质组学分析显示，M. galloprovincialis的鳃部和消化腺中GST过度表达[51]。尽管如此，值得注意的是，观察到的氧化应激级联并没有导致分析组织的总蛋白含量发生显著变化。结果显示，无论暴露基质（水或水/沉积物）或铜的形式（离子或纳米颗粒），两种鳃部和消化腺中的总蛋白水平在整个实验期间保持稳定（p > 0.05）。这种稳定性非常重要，因为它验证了总蛋白作为该物种中酶活性（例如SOD、CAT）和其他生化标志物的稳健标准化因子。通过确保特定活性计算的分母不受处理的影响，观察到的生物标志物反应的变化反映了抗氧化防御系统的真实生理变化，而不是组织降解或生物量损失的假象。总体而言，GST的反应加强了SOD–CAT的发现，证实CuO NP引发了更强且更持久的氧化应激级联，而离子Cu则诱导了较弱且更依赖于环境的抗氧化激活。3.5. 金属硫蛋白（MTs）双壳类软体动物采用多种策略来应对过量金属，包括诱导金属硫蛋白（MTs）[28]。MTs是低分子量的、富含半胱氨酸的蛋白质，由铜等金属诱导，在解毒和调节金属诱导的氧化应激中起核心作用[52]。在暴露于离子Cu的细胞中，MTs结合过量的Cu离子，从而有助于细胞内的金属平衡，并限制能够促进ROS产生的氧化活性Cu的可用性。在本研究中，MT的反应与SOD、CAT和GST观察到的氧化应激级联一致，反映了它们在下游解毒中的作用（图4A–D）。在对照蛤蜊中，两种组织中的MT水平随时间保持稳定（p > 0.05；图4A–D）。在鳃部，CuO NP暴露在水系统中尤其是在7天后导致MT水平轻微但持续增加，其值始终高于水/沉积物系统（图4A,B）。这种模式与相同条件下观察到的更强SOD和CAT诱导一致，表明ROS产生增加和Cu的可用性增加触发了抗氧化激活和金属结合解毒途径。图4显示了未经暴露和暴露于CuO NP及Cu2+（水中和水中/沉积物基质中）15天的R. decussatus鳃部和消化腺中的MT浓度（mg g?1 protein）（A–D）和脂质过氧化（nmol g?1 protein?1）（E–H）。大写字母表示同一暴露时间下不同处理之间的差异，小写字母表示暴露时间之间的差异（p < 0.05）。在暴露于离子Cu的蛤蜊中，鳃部的MT水平在不同形式的Cu和基质之间表现出相似但无显著差异的模式（图4B），这与这种暴露条件下观察到的更不稳定的SOD和CAT反应一致。在R. decussatus鳃部短期暴露于离子Cu后也报告了类似的MT诱导[43]，而在M. galloprovincialis中，CuO NP暴露下观察到了更明显和线性的MT增加，这与更强的氧化和金属应激反应相关[19]。在消化腺中，MT水平相对于对照组只有轻微变化（p > 0.05），尽管在CuO NP暴露后7天观察到轻微增加，尤其是在仅含水的系统中（图4C,D）。与同一组织中更强的SOD–CAT–GST反应相比，这种适度的诱导表明MT介导的隔离有助于Cu的解毒，但可能在这些暴露条件下是次要的。在水/沉积物系统中，MT水平较低（图4D），进一步支持了金属生物利用度的降低，这与观察到的SOD、CAT和GST反应的减弱一致。总体而言，MT的反应通过促进ROS清除系统（SOD、CAT和GST）激活后的Cu解毒来补充抗氧化级联。这些机制表明，CuO NP诱导了更持久的氧化和金属应激反应，需要酶促抗氧化防御和MT介导的隔离，而离子Cu暴露则导致更变化较大且受环境因素调节的反应。在R. decussatus中，MTs可能通过Cu–MT复合物的形成和随后的胞吐作用来帮助Cu的隔离和消除[53]，同时低分子量配体如谷胱甘肽可能提供额外的缓冲[42]。3.6. 氧化损伤脂质过氧化（LPO）被用作氧化损伤的指标，代表了当抗氧化和解毒系统不足时ROS积累的下游后果。在水系统中，无论是在CuO NP还是离子Cu暴露下，鳃部中的LPO水平随时间增加（p < 0.05；图4E），表明尽管激活了SOD、CAT和GST，但ROS的产生超出了抗氧化和解毒 capacity，导致膜损伤。这种效应在CuO NP暴露下更为明显，这与上游抗氧化防御和MT诱导的更强和更持久的激活一致，反映了整体氧化压力的增加。在水/沉积物系统中，LPO反应通常减弱（图4F,H），与这些条件下观察到的SOD、CAT、GST和MT反应的减弱一致。在CuO NP暴露下，鳃部中的LPO在7天后短暂增加，但在实验结束时恢复到对照水平（图4F），表明最初的氧化挑战后通过抗氧化和解毒机制得到了有效补偿。相反，离子Cu导致LPO增加延迟，表明氧化效应较慢但更持久，可能与Cu的生物利用度和吸收的时间变化有关（图4F）。在消化腺中，CuO NP暴露下LPO基本保持不变（图4G），尽管抗氧化和MT反应有所增强，表明ROS和Cu通过协调的SOD–CAT–GST活动和金属隔离得到了有效的细胞内缓冲。相反，离子Cu暴露在水系统中导致LPO增加，这突显了当抗氧化防御激活较弱或短暂时消化腺的特异性脆弱性。总体而言，LPO的结果证实了当ROS产生超过抗氧化酶（SOD、CAT、GST）和金属结合防御（MTs）的联合能力时会发生氧化损伤。在水系统中，CuO NP暴露下发生的脂质损伤最为严重（图4E），而在沉积物存在下显著减轻了氧化应激（图4F,G），这加强了其在减少Cu生物利用度和生物影响中的作用。3.7. DNA损伤为了评估两种形式的Cu是否在R. decussatus中引起基因毒性，对蛤蜊的血淋巴进行了彗星实验，结果如图5A,B所示。在对照蛤蜊中，两种暴露系统中的DNA尾部百分比（% DNA tail）随时间保持稳定（p > 0.05）。相比之下，暴露于CuO NP的蛤蜊在两种系统中显示出显著的随时间依赖性的DNA尾部百分比增加（p < 0.05；图5），表明明显的基因毒性效应。这种模式与CuO NP观察到的更强氧化应激反应一致，其特征是SOD、CAT、GST和MT的持续激活以及脂质过氧化的增加，表明过量的ROS产生导致了DNA链断裂。类似的研究结果也在暴露于相似大小和浓度的CuO NP的M. galloprovincialis血细胞[35]和短期暴露后的Mytilus spp.鳃部和血细胞中有所报道，其变化程度取决于纳米粒子的涂层[39]。图5显示了未经暴露和暴露于CuO NP及Cu2+（水中和水中/沉积物基质中）15天的R. decussatus血淋巴中的DNA损伤（% DNA Tail）（A）和（B）。暴露于离子Cu后7天也观察到DNA链断裂的显著增加（p < 0.05；图5A），尽管这种效应通常较低且更为短暂，但在暴露结束时趋于稳定（p > 0.05）。在水/沉积物系统中未观察到Cu形式之间的显著差异（图5B），这与这些条件下抗氧化和氧化损伤反应的总体减弱一致。离子Cu的基因毒性效应很可能与ROS的形成和随之而来的氧化损伤有关，这一点得到了本研究和其他水生物种中观察到的抗氧化防御的并行激活的支持[35,54]。然而，与CuO纳米颗粒相比，较弱的和更短暂的DNA损伤表明氧化负担较低或控制得更有效，这与SOD–CAT–GST的反应不持续一致。对于CuO纳米颗粒，DNA损伤通常归因于氧化性DNA损伤，而不是与遗传物质的直接相互作用，这既来自颗粒相关的效应，也来自Cu离子的释放。一旦被内化，CuO纳米颗粒可以促进自由基的形成，从而破坏细胞的氧化还原平衡，导致脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤[55,56,57]。这种机制与此处观察到的显著氧化应激级联反应是一致的。比较研究进一步支持了这一解释。在R. philippinarum中，CuO纳米颗粒（25–55 nm）暴露引起的DNA链断裂比大量Cu更多，但比离子Cu少，表明基因毒性受溶解动力学的影响较大，而不仅仅是颗粒大小[38]。总体而言，在R. decussatus中，CuO纳米颗粒暴露后观察到的DNA损伤最好用持续的ROS产生和不完全的抗氧化和解毒系统缓解来解释，而不是直接与DNA相互作用。

3.8. 乙酰胆碱酯酶（AChE）
乙酰胆碱酯酶（AChE）调节突触中的乙酰胆碱（ACh）水平，这对双壳类动物的神经功能至关重要[58]，并且AChE活性是神经毒性的指标，广泛用作神经毒性效应的生物标志物。图6显示了在两种处理条件下暴露于CuO纳米颗粒的蛤蜊鳃中的AChE活性。图6. 未暴露于CuO纳米颗粒和在水中（A）以及在水/沉积物基质中（B）暴露于Cu2+ 15天的R. decussatus鳃中的AChE活性。大写字母表示相同暴露时间下的处理组间的差异，小写字母表示暴露时间间的差异（p < 0.05）。在未暴露的蛤蜊中，只有在暴露期结束时处于水/沉积物系统中的个体中AChE活性增加，尽管增加并不显著（p > 0.05；图6B）。在暴露于CuO纳米颗粒的蛤蜊中，AChE活性显示出不同的模式。在水系统中，暴露7天后AChE活性增加，但在两周后显著下降（p < 0.05；图6A）。这表明AChE激活可以代表在毒性损伤导致酶抑制之前的早期预警信号或短暂适应性反应。在水/沉积物系统中（图6B），AChE活性最初较高，然后随时间线性下降（AChE = 2.36 ? 0.14 t; r = 0.999），表明与CuO纳米颗粒暴露相关的神经毒性效应。在暴露于Cu–ZnO纳米颗粒的贻贝M. galloprovincialis的鳃中也观察到了类似的反应[45]。

AChE催化中枢神经系统中的ACh水解[59]，其抑制可能导致神经元损伤。在蛤蜊鳃中观察到的抑制可能是由于纳米颗粒暴露引起的ROS（特别是H2O2）的产生，这可以改变AChE的活性位点[60]，或者是由炎症过程引起的。此外，从CuO纳米颗粒释放出的Cu可能通过与酶的巯基形成复合物来抑制胆碱酯酶（ChE），从而破坏其正常功能并影响神经系统。相比之下，在水系统中暴露于溶解Cu的蛤蜊鳃中的AChE活性保持不变（图6A），而在水/沉积物系统中，实验结束时AChE活性显著增加了1.8倍（p < 0.05；图6B），表明在双壳类动物中观察到的AChE活性增加可能反映了在应激条件下维持胆碱能神经传递的补偿性反应。AChE在调节乙酰胆碱水平方面起着关键作用，不仅参与神经功能，还参与可能被环境压力激活的神经免疫相互作用。在暴露于污染物或非生物压力后，AChE活性的短暂增加通常先于抑制效应，表明生物体的早期适应性反应。同样，Cazenave等人[61]报告称，在15°C下暴露于Cu（50和200 μg Cu L?1）的入侵性淡水双壳类动物L. fortunei中，AChE活性增加了大约1.8倍，表明这两种因素都有累积的负面影响。相反，在M. galloprovincialis鳃中，暴露于Cu（10 μg L?1持续15天）后，无论是纳米（CuO纳米颗粒）还是离子形式都会抑制AChE活性[35]。在M. edulis鳃中，AChE活性的变化依赖于浓度，较高的Cu浓度（200 μg L?1）会抑制该酶，而较低浓度则表现出时间依赖性效应[62]。AChE对Cu暴露的反应差异也可能与该物种中的MTs诱导有关，MTs在Cu稳态和解毒中起作用[42]。M. galloprovincialis似乎对Cu–ZnO纳米颗粒敏感，AChE的抑制可能是由于Cu与AChE的巯基残基的强结合亲和力[45]，正如在本例中观察到与MTs的硫残基的结合一样。有趣的是，AChE活性的模式与LPO水平的模式相似。一些在其他动物模型中的研究报道了AChE激活与LPO增加同时发生[61]（Cazenave等人，2025）。在这种情况下，金属对AChE活性的影响可能是由于脂质过氧化导致血浆膜破坏[63]。此外，AChE可能与细胞凋亡和随后的酶释放有关，正如Zhang和Shi（2002）[64]所报道的。在M. galloprovincialis中，暴露于CuO主要诱导了与GST、凋亡和蛋白水解有关的抗氧化效应；然而，这需要在R. decussatus中得到确认[51]。

3.9. 水系统与水/沉积物系统的比较
为了比较水中和水中/沉积物系统中纳米Cu和离子Cu的效果，进行了PCA分析（图7）。分析清楚地将Cu暴露样本与对照组分开，而PC2区分了由暴露类型和持续时间驱动的组织特异性反应（鳃与消化腺）。总体而言，PCA突出了氧化应激和神经毒性，特别是在鳃组织中。与鳃相关的生物标志物（LPO、SOD和AChE）在PC1的正端有很强的相关性，特别是在沉积物中暴露于离子Cu15天后以及水中暴露于两种Cu形式7天后。这表明在这些条件下鳃中存在显著的氧化应激和潜在的神经毒性。SOD和LPO向量的紧密对齐表明抗氧化防御不足以防止膜损伤。同样，消化腺中的MT和鳃中的GST显示出平行趋势，表明对这些压力的协调反应。图7. 在未暴露于CuO纳米颗粒和在水中（W）以及在水/沉积物基质中（SED）暴露于Cu2+ 15天的R. decussatus鳃中测量的一系列生物标志物的PCA。彗星试验向量与PC1的正轴对齐，表明DNA损伤是水中两种暴露类型下的核心生物反应，并与跨组织的系统氧化应激密切相关。因此，DNA损伤是暴露于水系统中两种铜形式以及在水/沉积物系统中暴露于离子Cu后的毒理学特征的关键组成部分。对照组和短期暴露集中在PC1的负侧附近，表明生物效应最小。总体而言，水/沉积物暴露从可忽略的效应到长时间离子Cu暴露下的明显鳃应激不等，而水传播的CuO纳米颗粒逐渐针对消化腺。因此，离子和纳米颗粒Cu表现出不同的、组织特异性的和时间依赖性的毒理学特征。暴露持续时间影响了反应模式。CuO纳米颗粒暴露从7天时的鳃主导反应转变为15天时消化腺的更强参与。在水系统中，CuO纳米颗粒与消化腺生物标志物（SOD、CAT、GST）越来越相关（图3），突出了该组织在纳米颗粒解毒中的核心作用。相比之下，在水/沉积物条件下，纳米颗粒暴露产生的谱型与对照组相似，表明生理影响较低。这可能表明到达沉积物的CuO纳米颗粒要么数量较少，要么以颗粒形式存在，要么已经溶解。离子Cu显示出不同的模式。在水系统中暴露7天后，反应主要与鳃应激和金属硫蛋白（MT）相关，其向消化腺的转变比纳米颗粒观察到的要弱。在水/沉积物系统中长时间暴露导致了最高的整体应激，与鳃反应强烈相关，包括氧化损伤和神经毒性。观察到的细胞毒性、遗传毒性和氧化应激反应，以及潜在的生物累积，突显了CuO纳米颗粒在海洋双壳类动物中的环境相关性[39]。在M. galloprovincialis中暴露于离子Cu（10 μg L?1）也报告了类似的效果[12,19]，包括氧化应激、MT诱导和AChE抑制。两种Cu形式都在R. decussatus中诱导了氧化应激（图7），但模式不同：离子Cu主要与遗传毒性和早期消化腺损伤相关，而CuO纳米颗粒导致急性鳃应激，随后在消化腺中引发了强烈的酶反应。多变量分析强调了暴露介质作为毒性的关键驱动因素，将Cu导向不同的生理部位。在仅含水的系统中，离子Cu在鳃中引发了早期遗传毒性和氧化应激，先于酶防御的完全激活。相比之下，纳米颗粒随着时间的推移逐渐影响消化腺，需要增强的抗氧化和解毒反应（SOD、GST）。在水/沉积物系统中，离子Cu引起了最显著的效果，鳃中出现了严重的氧化损伤和神经毒性。相反，CuO纳米颗粒与对照组聚集在一起，表明生物利用度降低。这可能反映了CuO纳米颗粒在海洋条件下的有限溶解（约1%），强调了沉积物在减轻纳米颗粒毒性方面的作用及其对环境风险评估的相关性。由于R. decussatus在经济上重要且在生态上相关，这些毒性效应可能损害生态系统功能并影响蓝色经济。从鳃应激到长期消化腺反应的转变表明CuO纳米颗粒污染破坏了多个生理途径，可能降低种群恢复力并改变食物网动态。由于双壳类动物会积累污染物并且被广泛食用，R. decussatus中观察到的氧化应激和遗传毒性表明了对营养传递的潜在风险。尽管没有直接评估人类健康，但这些机制在物种间是保守的，并与疾病过程相关。总体而言，这些发现表明新兴的污染物如CuO纳米颗粒影响多个生物系统，并具有对野生动物和人类都相关的毒性途径（例如，氧化应激和遗传毒性）。它们还强调了R. decussatus作为环境和公共卫生风险的有效早期指标。值得注意的是，水传播的纳米颗粒暴露可能对该物种构成更大的风险，这对监测和监管有影响。CuO纳米颗粒诱导了明显的生化和细胞应激，包括DNA损伤和抗氧化防御的减弱。在“同一健康”背景下，双壳类动物作为哨兵物种，反映了环境健康。生物标志物如SOD、LPO、AChE和DNA损伤提供了CuO纳米颗粒污染的早期预警信号，这些污染也可能影响其他海洋生物，包括具有商业价值的物种。这些结果强调了需要综合风险评估策略，考虑到环境暴露、生态效应和人类健康。一种“同一健康”方法加强了规范纳米颗粒排放并将基于生物标志物的监测纳入沿海管理计划的重要性。

4. 结论
CuO纳米颗粒和离子Cu都对海洋生物构成重大风险，导致R. decussatus的氧化应激、氧化损伤、遗传毒性和生化紊乱。然而，毒性取决于Cu的形式和暴露途径，这突显了了解积累动态对于准确进行环境风险评估和缓解的重要性。在水传播的暴露下，CuO纳米颗粒引发的应激反应比离子Cu更快更强烈，尤其是在早期阶段，表明其急性毒性更高。离子Cu主要与早期遗传毒性和氧化损伤相关，而CuO纳米颗粒则导致从初始的鳃应激到随时间推移通过消化腺介导的解毒的变化。水传播的CuO纳米颗粒和离子Cu暴露影响不同的生物途径，强调了暴露途径和持续时间在塑造毒理学结果中的作用。氧化应激、遗传毒性和潜在生物累积的联合证据表明，CuO纳米颗粒代表了海洋生态系统的一个新兴环境风险。总体而言，这些发现强调了需要综合的“同一健康”方法来评估与纳米颗粒污染相关的生态和潜在的人类健康风险。

补充材料
以下支持信息可以下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/fishes11050282/s1，表S1：R. decussatus中生化生物标志物的双向ANOVA结果总结。该分析研究了处理方式（对照组、铜离子处理组及CuO纳米粒子处理组）、暴露时间（0天、7天和15天）及其交互作用对两种组织（鳃和消化腺）及其暴露环境（水和沉积物）的主要影响。