犬尿路上皮癌中的拷贝数变异：肿瘤纯度的影响 Marielle Appenzeller, Heike Aupperle-Lellbach, Alexandra Kehl, Robert Klopfleisch, Simone de Brot

《Veterinary Sciences》：Copy Number Alterations in Canine Urothelial Carcinomas: The Impact of Tumour Purity Marielle Appenzeller, Heike Aupperle-Lellbach, Alexandra Kehl, Robert Klopfleisch and Simone de Brot

　　**简单总结**
分子遗传诊断在兽医医学中越来越重要，用于早期肿瘤检测、组织形态学诊断的确认以及无创检测。对于患有尿路上皮癌（UC）的狗，检测BRAFV595E突变以及拷贝数改变（CNAs）有助于诊断。CNAs可以同时影响多个基因，导致它们的过度表达或表达不足。特别是在狗的染色体CFA13和CFA36区域出现基因扩增，在CFA19区域出现基因丢失的情况在犬类UC中较为常见。本研究分析了76个经组织病理学确认的UC组织样本中CNAs检测的性能，以及肿瘤纯度对检测结果的影响。每个组织病理学切片中的肿瘤区域被测量并计算出占总组织面积的比例。在76例中有58例（76%）的CNAs检测结果呈阳性，CFA13/19和CFA36/19的比值均高于1.23。在18例阴性样本中，共有14例的CFA13/19或CFA36/19的比值高于1.23。当肿瘤含量≥20%时，CNAs检测在84%的样本中呈现阳性；当肿瘤占组织≥40%时，这一比例上升至88%。这些发现表明，肿瘤含量低于20%且拷贝数中性细胞（如肌肉细胞和炎症细胞）比例较高时，CNAs的检测能力会降低。

**摘要**
分子遗传学方法在兽医医学中对于早期肿瘤检测、组织形态学诊断的确认以及使用尿液样本进行无创诊断已经变得不可或缺。在犬类尿路上皮癌（UC）中，分子检测包括BRAFV595E突变分析以及特定拷贝数改变（CNAs）的识别。CNAs会同时影响多个基因，导致其过度表达或表达不足。犬类染色体CFA13和CFA36上的基因扩增以及CFA19上的基因丢失在犬类UC中非常普遍。本研究通过76个经组织病理学确认的UC组织样本，评估了CNAs检测的性能以及肿瘤纯度对检测结果的影响。每个组织病理学切片中的肿瘤区域被测量，并计算出其占总组织面积的比例。在76例中有58例（76.3%）的CNAs检测呈阳性，CFA13/19和CFA36/19的比值均大于1.23。在18例阴性样本中，共有14例的CFA13/19或CFA36/19的比值大于1.23。该CNAs检测方法的敏感性取决于所设定的阈值：当肿瘤占组织比例≥20%时，在84%的样本中检测结果呈阳性；当这一比例≥40%时，该比例上升至89%。这些结果表明，肿瘤含量低于20%且拷贝数中性细胞比例较高可能与CNAs检测能力降低有关。

**1. 引言**
尿路上皮癌（UC），以前也称为移行细胞癌，是泌尿系统中最常见的肿瘤之一[1]。UC约占所有犬类癌症的1.5-2%，且具有高度恶性[1,2]。某些犬种更容易患UC，尤其是苏格兰梗犬、谢特兰牧羊犬、比格犬、狐狸梗犬和西高地白梗犬[1,3,4]。UC通常伴随非特异性临床症状，包括尿频、血尿、排尿困难以及排尿疼痛[2,5,6]。因此，这些症状常被误认为是膀胱炎或尿石症，导致诊断延迟，疾病往往发展到晚期[1,2,3]。因此，早期发现UC对治疗效果至关重要，因为早期癌症通常对治疗反应更好[7,8]。目前有多种诊断方法可用于评估疑似UC，这反映了细胞学、影像学和分子技术的进步。虽然超声检查和X光等影像学技术可以检测到泌尿系统肿块和异常生长，但它们评估恶性肿瘤的能力有限[9,10,11]。因此，可靠地区分UC和良性病变具有挑战性。尿液沉渣的细胞学检查是一种有价值的诊断工具，但如果缺乏非典型移行细胞，其解释效果会受限。与细菌性膀胱炎相关的炎症和反应性改变可能导致尿路上皮细胞的多态性，从而可能造成误判[12,13,14]。组织病理学检查仍是诊断UC的金标准，但它需要侵入性手术，费用较高，并且存在肿瘤细胞扩散的风险[1,15]。此外，活检采样时常受到肿瘤解剖位置难以到达的限制（通常位于膀胱三角区），以及患者体型、性别、相关费用和诊所技术条件的限制[3,4]。为了开发新的兽医肿瘤学诊断工具，研究越来越多地集中在分子遗传诊断上[13,17,18]。大多数犬类UC在BRAF基因的外显子15中携带单个碱基突变，使得BRAF突变分析成为一种有效的诊断方法[17,19]。已有研究表明，苏格兰梗犬、谢特兰牧羊犬和比格犬对该BRAF突变具有易感性[4]。Mochizuki等人开发了一种检测尿液沉渣细胞中BRAFV595E突变的方法[17]。滴液数字聚合酶链反应（ddPCR）检测犬类BRAFV595E突变的灵敏度高达85%，特异性超过99%[17]。这种突变分析能够可靠地诊断BRAF突变的UC。犬类UC中BRAF突变的高发率（报告为67%-87%[20,19]）支持将其作为常规诊断的有效工具[4]。相比之下，缺乏BRAF突变的UC病例无法通过此方法检测出来。

**2. 材料与方法**
本研究纳入了76个提交给瑞士伯尔尼大学动物病理学研究所和英国诺丁汉大学兽医医学院及科学学院的犬类UC诊断样本，以及24个提交给LABOKLIN GmbH & Co. KG的犬类非肿瘤性膀胱样本。这些样本最初是用于常规诊断目的，并非专门用于科学研究。在本研究中，没有因样本质量不佳而被排除的病例。选择这种做法是为了更好地反映实际情况，因为实际诊断中经常收到质量不一的样本。研究中使用的犬种名称遵循国际犬业联合会（FCI）的命名规则。未被FCI正式认可的犬种被归类为混血犬。

UC样本的纳入标准为：(1) 经组织病理学确认的UC；(2) CNA检测结果阳性。非肿瘤性对照组的纳入标准为：(1) 经组织病理学确认的膀胱炎（n=16）或膀胱息肉（n=8）；(2) CNA检测结果阳性。所有76个UC样本和24个非肿瘤性样本均为经福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的组织。经苏木精和伊红染色的UC（尿路上皮癌）组织切片被数字化（扫描仪：3DHISTECH Pannoramic 250 Flash III，3DHISTECH Kft.，布达佩斯，匈牙利），并使用3DHISTECH Slide Viewer 2.7软件由一位经过认证的兽医病理学家（S.d.B.）进行评估，病理学上确认为UC。每个样本的生长模式被分类为：常规尿路上皮型、实性型、蜂窝状型、囊性型和混合型。每个组织切片的整个组织区域都被自动检测到，相应的肿瘤区域则通过手动分割得到（图1）。肿瘤分割工作由一位病理学家完成，并由监督者（S.d.B.和H.A.-L.）对部分案例进行了确认。非肿瘤区域，如出血区域，也被计入总组织面积中进行分析。这使得可以计算每个样本的肿瘤比例，即肿瘤面积与总组织面积的比例。以下内容中将这一比例称为“肿瘤与总组织比例”。图1. 病理学检查的概览图像以及手动分割的肿瘤区域（用蓝色标出）。(a) 来自一只12岁已绝育西高地白毛梗的UC样本（病例76），活检显示大量膀胱壁肌肉。苏木精-伊红染色；条状比例=5毫米。(b) 来自一只12岁已绝育边境牧羊犬的UC小样本，肿瘤组织极少且伴有明显出血（病例5）。苏木精-伊红染色；条状比例=1毫米。UC，尿路上皮癌；HE，苏木精和伊红；T，肿瘤；M，肌肉；H，出血。

作为初步分子遗传学分析的一部分，进行了BRAF突变检测，以检测c.1784T>A替换。从两个10微米厚的FFPE（冷冻切片）组织切片中提取DNA，并按照Mochizuki等人建立的cBRAFV595E ddPCR方案使用ddPCR方法进行BRAF突变分析[17]。用于BRAF突变检测的DNA也被用来进行CNA（拷贝数异常）检测，方法同样参照Mochizuki等人的描述[34]。计算了每个样本的CFA13/19和CFA36/19比率，并根据每次ddPCR实验中包含的阳性对照样本进行标准化。如果两个标准化比率（CFA13/19和CFA36/19）超过Mochizuki等人设定的阈值1.23，则该样本被归类为CNA阳性[34]。ddPCR是在QX200 Droplet Digital System（Bio-Rad，Hercules，CA，美国）上进行的，使用了Bio-Rad的ddPCR Supermix试剂盒和Biometra TOne热循环仪（Jena，德国）。对于ddPCR分析，只有当每次反应至少有5000个滴液事件且每个目标（CFA13、CFA19和CFA36）检测到至少100个阳性滴液时，结果才被视为有效。此外，无模板对照和阳性对照也需要满足预定义的质量标准。

统计分析使用Microsoft Excel 365和IBM SPSS Statistics 32.0.0.0（134）进行。组间比较采用了非参数Mann–Whitney U检验。通过单变量和多变量逻辑回归分析来评估肿瘤组织比例与CNA阳性之间的关系。在多变量模型中，还包括了炎症比例、肌肉组织、坏死和出血等病理学变量作为协变量。计算了带有95%置信区间的比值比（OR），p值<0.05被视为具有统计学意义。为了评估肿瘤与总组织比例对CNA检测结果的影响，通过箱形图直观检查了所有UC案例的肿瘤比例。基于这一分布，定义了一系列实用的肿瘤含量阈值（10%、20%和40%）来分层样本。对于每个肿瘤比例阈值，敏感性定义为在相应阈值及以上的所有UC样本中CNA阳性样本的比例，这些样本被计入分母。非肿瘤性膀胱样本也被纳入分析以评估特异性。

**3. 结果**
3.1. 样本群体
本研究中包含了76只经病理学确认患有UC的犬只的福尔马林固定组织样本。这些犬只的详细信息见表S1。所有样本中女性犬只占多数（47只雌性和29只雄性）。大多数犬只已经绝育（n=61）；只有两只雄性和一只雌性在采样时处于未绝育状态。其余12只犬只的绝育状态未知。诊断时的中位年龄为10岁（范围6–14岁）。除了混血犬（n=17）外，最常见的品种是拉布拉多寻回犬（n=10）、西高地白毛梗（n=6）、卡莱尔王查理斯猎犬（n=5）和杰克罗素梗（n=5）。总体上，梗类犬种占据了相当比例的病例，包括6种不同的梗类犬种：西高地白毛梗（n=6）、杰克罗素梗（n=5）、苏格兰梗（n=3）、狐梗（n=2）、斯塔福德郡斗牛梗（n=1）和藏梗（n=1）。总共76只犬中有67只（88%）在BRAF基因上检测出V595E突变阳性。所有梗类样本以及所有3只设得兰牧羊犬均患有BRAF突变的UC。

CNA阴性对照组包括24个非肿瘤性膀胱样本，其中16例为膀胱炎，8例为膀胱息肉，所有样本均来自FFPE标本。该队列由10只雌性和13只雄性组成；其中1例的性别信息缺失。23只犬只的年龄信息已知，诊断时的中位年龄为8岁（范围1–12岁）。所有这些对照样本在BRAF突变检测中均呈阴性。

3.2. 病理学检查
肿瘤形态学上，最常见的癌变类型为常规尿路上皮生长模式（n=37；49%；图2a）。此外，还存在实性型（n=3；4%）、蜂窝状型（n=2；3%）、腺状/巢状型（n=2；3%）、微浸润型（n=2；3%）、囊性型（n=1；1%），以及鳞状分化型（n=1；1%）和混合型（n=28；37%）。在分析的76个样本中，有7个样本的组织保存质量较差。图2. 尿路上皮癌的病理学生长模式示例：(a) 一只13岁已绝育混血雌性犬的UC样本，表现出常规尿路上皮生长模式和明显的混合细胞炎症（I）；病例30；苏木精-伊红染色；条状比例=0.2毫米。(b) 一只13岁已绝育混血雄性犬的UC样本，表现出腺状/巢状生长模式和严重的comedonecrosis（N）；病例31；苏木精-伊红染色；条状比例=0.1毫米。UC，尿路上皮癌；T，肿瘤；HE，苏木精和伊红。在评估这八种不同生长模式的CNA结果时，只有四种类型的样本检测结果为阴性（图3）。在所有CNA阴性病例（n=18）中，腺状/巢状生长模式（2/18；11%）、常规尿路上皮生长模式（5/18；28%）、实性生长模式（1/18；6%）和混合生长模式（10/18；56%）的肿瘤均为阴性。在常规尿路上皮生长模式组（n=37）中，有5例（14%）为CNA阴性。在实性生长模式组（n=3）中，有1例（33%）的CNA结果为阴性。两个腺状/巢状生长模式的病例（病例53和66）也均为CNA阴性。值得注意的是，它们的肿瘤与总组织比例分别为8%和11%，表明相应的组织切片中仅含有极少的肿瘤组织。在28个混合生长模式的样本中，有10例（36%）通过CNA分析未被识别为UC。所有表现出蜂窝状、微浸润、囊性或鳞状生长模式的样本均被正确诊断为UC。然而，由于样本数量较少，无法统计评估这些形态对CNA检测结果的影响。

3.3. CNA分析
24个膀胱炎和息肉样本的CNA检测结果均为阴性（图4a）。三个膀胱炎样本（病例90、97和98）的CFA36/19比率超过了Mochizuki等人设定的阈值1.23（分别为1.24、1.28和1.42），但相应的CFA13/19比率明显低于该阈值（分别为0.80、1.16和0.85）。图4. (a) 24个非肿瘤性样本和(b) 76个UC样本的CFA13/19和CFA36/19比率，根据CNA结果（阳性vs.阴性）进行分类。虚线表示CFA13/19和CFA36/19的阈值1.23。只有当两个比率均超过Mochizuki等人设定的1.23时，样本才被归类为CNA阳性。UC队列中，CFA13/19的比率范围为0.63至6.91，CFA36/19的比率范围为0.84至5.21（图4b）。共有58个样本（76%）的CNA结果为阳性，即CFA13/19和CFA36/19的比率均大于1.23。

三个BRAF野生型UC样本通过CNA检测被成功分类为肿瘤：(1) 病例1是一只12岁已绝育美国可卡犬的UC，具有混合生长模式和严重出血，其肿瘤与总组织比例为58%。(2) 病例17是一只8岁已绝育混血雌性犬的UC，伴有显著炎症，肿瘤与总组织比例为10%。(3) 病例70是一只8岁已绝育威尔士斯普林格猎犬的UC，具有常规尿路上皮生长模式和较高的肿瘤纯度（75%）。在18个样本中，CFA13/19和CFA36/19的比率均未超过阈值（>1.23）；因此这些样本被归类为CNA阴性。在这18个阴性样本中，有14个样本在其中一个比率（CFA13/19，n=13；CFA36/19，n=1）中超过阈值。所有这14个样本均携带BRAF突变，而四个样本未被两种分子诊断方法识别为UC。

图5显示了76个UC样本根据肿瘤形态分类后的100%堆叠条形图。条形图内的数字代表每个肿瘤形态组的样本数量。样本按CNA检测结果（阳性vs.阴性）进行分层。UC，尿路上皮癌；CNA，拷贝数异常。

3.4. CNA分析
所有24个膀胱炎和息肉样本的CNA检测结果均为阴性（图4a）。三个膀胱炎样本（病例90、97和98）的CFA36/19比率超过了Mochizuki等人设定的阈值1.23（分别为1.24、1.28和1.42），但相应的CFA13/19比率仍低于该阈值（分别为0.80、1.16和0.85）。在UC队列中，CFA13/19的比率范围为0.63至6.91，CFA36/19的比率范围为0.84至5.21（图4b）。共有58个样本（76%）的CNA结果为阳性，即CFA13/19和CFA36/19的比率均大于1.23。三个BRAF野生型UC样本通过CNA检测被成功分类为肿瘤：(1) 病例1是一只12岁已绝育美国可卡犬的UC，具有混合生长模式和严重出血，其肿瘤与总组织比例为58%。(2) 病例17是一只8岁已绝育混血雌性犬的UC，伴有显著炎症，肿瘤与总组织比例为10%。(3) 病例70是一只8岁已绝育威尔士斯普林格猎犬的UC，具有常规尿路上皮生长模式和较高的肿瘤纯度（75%）。在18个样本中，CFA13/19和CFA36/19的比率均未超过阈值（>1.23）；因此这些样本被归类为CNA阴性。在这14个阴性样本中，所有样本的肿瘤与总组织比例均大于1.23（CFA13/13，n=13；CFA36/19，n=1）。其中，所有14个样本均携带BRAF突变，而四个样本未被两种分子诊断方法识别为UC。

图5显示了76个组织样本的肿瘤与总组织比例，根据CNA检测结果进行分类。在18个CNA阴性样本中，肿瘤与总组织比例的范围为2%至67%（中位数=14.9%），而CNA阳性样本的比率通常较高（中位数=33.7%；范围=0.1–88%）。CNA阳性样本与阴性样本之间的肿瘤与总组织比例存在显著差异（中位数34% vs. 15%，Mann–Whitney U检验，p = 0.02）。逻辑回归分析显示，肿瘤组织比例≥20%的样本比肿瘤组织比例<20%的样本有更高的CNA阳性概率（OR = 3.281，95% CI: 1.099–9.794；p = 0.03）。在进一步的多变量逻辑回归分析中，包括炎症、肌肉组织、坏死和出血等病理学因素后，非肿瘤组织成分比例较高的样本相比肿瘤纯度较高且缺乏这些非肿瘤成分的样本，其CNA阳性概率较低（OR = 0.157，95% CI: 0.018–1.392）。然而，这种关联并未达到统计学显著性（p = 0.096）。图5的箱形图显示了根据CNA检测结果（阳性vs.阴性）分层的76个UC样本中肿瘤含量的分布。* p = 0.02。从箱形图（图5）可以观察到，大多数CNA阳性样本的肿瘤比例高于约20%，尽管也有例外。为了评估肿瘤与总组织比例对CNA检测结果的影响，我们在多个肿瘤比例阈值下评估了敏感性和特异性（表1）。这一敏感性数据显示，样本中的肿瘤与总组织比例为20%足以在84%的案例中获得CNA阳性结果。将肿瘤比例增加到40%时，这一比例提高到88%。值得注意的是，CNA检测在所有非肿瘤性对照样本中均实现了100%的特异性，包括确诊为膀胱炎（n=16）和膀胱息肉（n=8）的样本，这些样本始终显示CNA阴性结果。

表1. 不同肿瘤与总组织比例下的CNA检测敏感性。共有16例UC（尿路上皮癌）样本的肿瘤与总组织比例低于20%（中位数=15%），但CNA（拷贝数分析）检测结果仍为阳性。这些样本中包括5只混血犬、3只拉布拉多寻回犬、2只卡瓦利埃尔王查尔斯猎犬、2只设得兰牧羊犬，以及各1只可卡犬、杰克罗素梗犬、指针犬和魏玛猎犬。其中10只为雌性，6只为雄性，诊断时的中位年龄为9岁（范围7-13岁）。这些样本中的非肿瘤成分主要为肌肉组织（5例）、炎症（4例）、肌肉与炎症混合（3例）、坏死（3例）和出血（1例）。CFA13/19的比率在1.44到3.26之间，而CFA36/19的比率在1.27到5.21之间。在第47例样本中，尽管肿瘤与总组织比例低至0.1%，仍能提取到足够的DNA以检测出阳性的CNA结果。

在另外8例样本中，肿瘤与总组织比例超过20%（中位数=34.5%），但CNA结果仍为阴性。所有这些样本均检测出BRAF突变阳性。这些样本包括3只拉布拉多寻回犬、2只可卡犬、1只卡瓦利埃尔王查尔斯猎犬、1只混血犬和1只设得兰牧羊犬。该组中有5只雌性和3只雄性犬，诊断时的中位年龄为11.5岁（范围7-14岁）。这些样本中的非肿瘤成分主要是炎症（2例）、肌肉组织（1例）和坏死（1例）。在7/8例样本中，CFA13/19的比率超过1.23（范围1.30-4.61），而CFA36/19的比率在0.84到1.10之间。在第55例样本中，一只13岁的已绝育雌性拉布拉多寻回犬的CFA13/19比率为1.19，CFA36/19比率为2.20。这种UC样本具有传统的尿路上皮细胞、实性细胞和囊性细胞混合生长模式，并伴有显著的混合细胞炎症，其肿瘤与总组织比例为31%。在第8例和第15例样本中，肿瘤与总组织比例分别为37%和51%，除了出血外没有其他非肿瘤成分，但两者的CNA结果均为阴性。

**讨论**
本研究旨在探讨肿瘤组织比例对可靠CNA分析的影响。为此，分析了76个经病理学确认为UC的诊断样本。苏格兰梗犬、其他梗犬品种以及设得兰牧羊犬（此前报道易患UC，尤其是携带BRAF突变的UC）在我们的研究样本中占比较高。所有这些易感品种的样本均检测出BRAF突变阳性。因此，我们的研究群体具有代表性，因为品种分布反映了UC在群体中的流行病学特征。
与Mochizuki等人的研究结果一致，我们发现在肿瘤纯度较高（中等到高）的情况下，CNA分析能够可靠地检测出UC，特异性为100%，敏感性为84-88%。Mochizuki等人提出的CFA13/19和CFA36/19比率为1.23的阈值可能并不完全适用于非均匀的临床组织样本，因为这些样本中含有不同比例的非肿瘤成分。我们的研究进一步证实了这一点，18例CNA阴性的样本中至少有14例在其中一个标志物的比率超过1.23，这表明要求两个比率同时超过阈值可能会降低检测的敏感性。在这种情况下，可能需要考虑其他解释策略，例如仅考虑单一比率的超过情况或设定一个灰色区域。然而，在本研究中，我们严格遵循了原始发表的方案，以确保方法的一致性和与先前研究的可比性。
Mochizuki等人的研究中可能仅包括了肿瘤纯度较高的样本。他们的研究将肿瘤分为膀胱的不同层次：固有层、肌肉层和膀胱周围组织。但该研究没有报告出血、坏死或炎症的比例，也没有说明是否有非肿瘤成分及其程度。虽然该研究中组织样本的CNA敏感性为100%，但在尿样中未能复制这一结果，因为尿样中的炎症细胞导致CNA检测失败（33%的尿样未能通过检测）。作者推测这种炎症是由继发性细菌感染引起的。
我们研究中经病理学确认的76例UC样本在多个层面进行了分析，特别是肿瘤形态和肿瘤纯度（即肿瘤与总组织比例）。腺样/嵌套型肿瘤（案例53和66）的CNA结果均为阴性，肿瘤比例非常低（分别为8%和11%），表明CNA的检测能力主要受肿瘤内容物而非形态的影响。在所有76例UC样本中，58例（76%）被CNA准确识别。在18例CNA阴性的样本中，肿瘤与总组织比例非常低，或在CFAs中没有CNA改变，或者存在的少量改变相互抵消了。
后续的CNA分析得出两个主要结论：首先，CNA分析需要一定比例的纯肿瘤组织才能产生准确的结果；其次，这一最低阈值受样本中其他组织成分的显著影响。因此，对于常规诊断中的CNA检测，仅能给出一般性建议，因为检测敏感性严重依赖于非肿瘤组织的比例。许多有核的非肿瘤细胞（如炎症细胞或肌肉细胞）的拷贝数是中性的，因此这些细胞的DNA比例可能影响CNA分析中使用的13/19和36/19比率，从而使信号趋于中性。
多种因素影响CNA分析的结果。非肿瘤细胞的比例在一定程度上会影响总体CNA结果。当肿瘤细胞含有高拷贝数的CFA13和CFA36时，非肿瘤细胞的存在（其CFA13/19和CFA36/19比率正常）对最终结果影响有限。相反，如果肿瘤细胞仅表现出低水平的CNA改变，非肿瘤细胞的影响就会更加明显，使比率偏低，可能导致CNA结果错误阴性。在人类膀胱癌的研究中，全基因组测序也发现FRS2的拷贝数在肿瘤组织中可增加3到25倍，这种扩增与不良预后相关。但目前尚不清楚每个细胞中CFA拷贝的准确数量。
分子病理学的进步使其越来越多地应用于临床诊断，作为传统形态病理学的补充手段，有助于跨物种识别遗传同源性。一项研究比较了人类结直肠腺瘤和癌的进展，发现癌中的染色体异常更多[28]。这些改变在腺瘤向癌的转变中起关键作用[28]。犬类和人类结直肠癌（CRC）的比较分析显示高度遗传同源性[29]。犬类CRC中反复出现的CNA影响人类CRC基因的同源物，总CNA负担与肿瘤分期相关。物种间的共同CNA往往涉及进化稳定的区域，表明这些改变更可能是致癌因素，而物种特异性的CNA则位于不稳定的基因组区域。
我们的发现可以应用于常规诊断。必须考虑组织组成对CNA分析可靠性的影响。组织样本中的肌肉细胞属于拷贝数中性细胞，会稀释肿瘤来源的DNA，从而影响CNA结果的准确性。在人类膀胱癌中，临床分为非肌浸润性（NMIBC）和肌浸润性（MIBC）亚型，NMIBC中超过20%、MIBC中高达30%的病例检测到CNA[38]。相比之下，肌肉细胞不会进入尿液，因此不太可能影响基于尿液的检测。然而，在膀胱炎病例中，尿液中可能存在炎症细胞，这些细胞会向样本中贡献拷贝数中性的DNA，从而影响CNA结果。因此，用于CNA分析的尿液样本必须先进行细胞学检查。
在兽医医学中，CNA分析的预后价值尚有限。但在人类医学中，CNA分析不仅用于诊断，还用于提供可以在分子遗传层面应用的预后信息。在人类脑膜瘤的研究中，结合病理学和CNA的分子分级方法提高了肿瘤复发的预测能力[31]。包括反复出现的CNA有助于更准确的分层和重新分类遗传风险较高的良性肿瘤，提供比WHO分级更可靠的预后标志物[31]。Wang等人发现，前列腺癌中的CNA与转移和患者预后密切相关[27]。前列腺癌中的特定CNA特征与转移性疾病、总体生存率和无进展生存率相关，而其他CNA特征则与更好的预后相关[27]。肿瘤的CNA负担也是一个重要的预后因素。本研究对CNA负担的评估有限，需要进一步研究犬类UC样本中CNA的频率及其潜在的预后意义。
高分级的人类浆液性卵巢癌是最常见的非整倍体癌症类型之一，其中多达三分之二的基因可能受到CNA影响[25]。在人类妊娠相关乳腺癌中，高CNA负担和染色体的反复丢失及增加与肿瘤进展相关[24]。本研究的另一个局限性是BRAF阴性样本比例较低。然而，其中3例（43%）通过CNA分析被识别，体现了这种方法的补充诊断价值。其他潜在相关因素（如组织固定时间、石蜡质量及FFPE块存储条件）未系统记录，因此无法在本研究中考虑或标准化。此外，尽管应用了预定义的ddPCR质量标准（包括最小液滴计数和阳性液滴阈值），但FFPE相关的DNA质量变异仍可能影响检测结果。
我们采用了Mochizuki等人描述的ddPCR方法对更多常规犬类UC样本进行了分析，证实了之前的发现，并进一步揭示了该方法的局限性。在人类医学中，多项研究也表明ddPCR能可靠地检测癌症中的特定CNA。在口腔鳞状细胞癌[39]和黑色素瘤[40]中，ddPCR与阵列方法在识别反复出现的拷贝数改变方面表现一致。ddPCR有助于区分良性和有进展风险的口腔病变[39]，并辅助诊断病理学上难以区分的黑色素瘤[40]。
这些结果强调了ddPCR在人类[35]和犬类[34]UC样本中的实用性，表明CNA分析在跨物种诊断中的转化价值。此外，这些发现突显了ddPCR作为一种快速、敏感且经济高效的替代方法，可替代传统的免疫组化和FISH检测。这些发现支持CNA分析在兽医肿瘤学中的广泛应用潜力，因为不同肿瘤类型的CNA图谱越来越明确。肿瘤与总组织的比例为20%时，在84%的病例中能够获得阳性CNA（拷贝数异常）结果；当肿瘤含量达到40%时，这一比例上升至88%。样本中存在非肿瘤细胞会降低CNA的检测灵敏度，尤其是在每个细胞中的相关CFA（拷贝数异常）拷贝数量较少时。补充材料：以下支持性信息可在此网址下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/vetsci13050459/s1，表S1列出了76例犬尿路上皮癌病例和24例非肿瘤性膀胱样本的详细信息，包括品种、性别、绝育状态、采样时的年龄、BRAFV595E突变检测结果、CNA结果、组织与肿瘤测量数据以及肿瘤形态。