中国湖南和广西省份家鸡中禽血孢子虫感染的流行情况及分子特征 杨浩青， 谭佳成， 卢世全， 鲜成军， 黄瑞， 刘伟， 王东英

《Veterinary Sciences》：Prevalence and Molecular Characteristics of Avian Haemosporidian Infection Among Domestic Chickens in Hunan and Guangxi Provinces, China Haoqing Yang, Jiacheng Tan, Shiquan Lu, Chengjun Xian, Rui Huang, Wei Liu and Dongying Wang

　　## 简要概述
本研究旨在调查中国南方家鸡中Plasmodium juxtanucleare、Leucocytozoon caulleryi和Leucocytozoon sabrazesi的流行病学特征。研究人员从湖南省和广西壮族自治区收集了941份血液样本，采用嵌套PCR和特异性PCR方法检测这些寄生虫的存在。结果显示，23.59%的家鸡感染了P. juxtanucleare，而仅1.81%的家鸡感染了L. caulleryi，未检测到L. sabrazesi的感染病例。年龄较大的家鸡（>90天）以及某些品种（黑骨鸡和鹧鸪鸡）的感染率显著更高。遗传分析表明这些寄生虫株具有高度保守性。本研究提供了区域性的流行病学数据，并揭示了它们与特定年龄和品种之间的关联。

## 摘要
禽类血液孢子虫寄生虫，特别是Plasmodium juxtanucleare、Leucocytozoon caulleryi和Leucocytozoon sabrazesi，对家禽健康和生产构成重大威胁。然而，关于中国南方家鸡中这些病原体的流行病学信息有限，这阻碍了有效的疾病预防和控制。本研究的目的是在2024年6月至2025年12月期间，对广西壮族自治区和湖南省这两种寄生虫的流行病学特征进行横断面调查。共收集了941份家鸡血液样本，并使用针对cytb基因的嵌套PCR和针对coxI基因的物种特异性PCR方法进行了分析。血液孢子虫感染的总体检出率为25.40%（239/941）。其中，P. juxtanucleare是最常见的寄生虫，检出率为23.59%（222/941），其次是L. caulleryi，检出率为1.81%（17/941），未检测到L. sabrazesi感染。年龄超过90天的家鸡以及某些品种（黑骨鸡和鹧鸪鸡）的感染率显著较高。coxI序列的遗传分析显示P. juxtanucleare分离株具有高度保守性（相似度为99.7–100%），而L. caulleryi株则完全相同。系统发育分析验证所有序列都与GenBank中的参考株一致。本研究揭示了这三种血液孢子虫在家鸡中的流行病学情况，指出年龄和品种是重要的风险因素，强调了在该地区持续监测和针对性控制措施的重要性。

## 1. 引言
禽类血液孢子虫（Apicomplexa: Haemosporida）是一类能够感染脊椎动物宿主的单细胞真核生物[1]。这类通过媒介传播的血液寄生虫主要包括三个属：Plasmodium、Leucocytozoon和Haemoproteus[2]。值得注意的是，禽类血液孢子虫的宿主范围广泛，可感染全球多种鸟类，从野生鸣禽到商业养殖的家禽[3,4]。这些感染可导致从亚临床症状到严重贫血、体重下降、器官衰竭甚至死亡等多种临床表现[5]。这类寄生虫对家禽产业造成了巨大的经济损失，并引发了人们对脆弱鸟类的保护关切[6]。不同属的寄生虫在生物学和病理学特征上存在显著差异：Plasmodium属寄生虫在红细胞和多种内皮细胞中进行裂殖，主要通过库蚊（Culicidae）和按蚊（Anopheles）传播；而Leucocytozoon属寄生虫则在肝脏、心脏和脾脏等器官的实质细胞中进行裂殖，由黑蝇（Simulidae）传播[8]。由Leucocytozoon caulleryi和Leucocytozoon sabrazesi引起的感染在家鸡中可能表现为急性且致命，其特征是组织损伤严重、出血以及受感染器官的肿大和变色[9]。中国历史上已有报道家鸡感染血液孢子虫的案例，其中L. caulleryi和L. sabrazesi在某些地区较为常见[10,11]。然而，Plasmodium juxtanucleare在中国的流行病学情况仍不充分，相关分子研究较为有限[12,13,14]。近年来，基于线粒体基因（如cytochrome b和cytochrome c氧化酶亚基I，coxI）的聚合酶链反应（PCR）技术显著提升了血液孢子虫的检测和鉴定能力[15,16]。由于这些基因的序列变异率较高，它们在遗传变异和系统发育分析中得到了广泛应用[17,18]。中国南方饲养着多种家鸡品种，但目前关于L. caulleryi、L. sabrazesi和P. juxtanuclee的流行病学数据仍不充足。因此，本研究旨在调查广西壮族自治区和湖南省家鸡中这些寄生虫的流行病学特征，以更好地了解它们对当地家禽的潜在风险。

## 2. 材料与方法
2.1 **样本采集**
2024年6月至12月期间，从八个县级地区随机采集了941份家鸡血液样本，其中四个位于广西壮族自治区（南宁、武鸣、来宾、柳州），四个位于湖南省（长沙、宜阳、吉首、邵阳）（图1）。这些采样点涵盖了不同的生态环境和养殖方式，包括集约化室内饲养、半集约化放养以及传统的后院觅食模式。
2.2 **DNA提取**
根据制造商说明书，使用TIANamp Blood DNA Kit（Tiangen Biotech，北京）从每份20 μL血液样本中提取基因组DNA。通过NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）评估提取DNA的浓度和纯度。提取的DNA样本在?20 °C条件下保存，直至用于PCR实验。
2.3 **PCR扩增与测序**
2.3.1 **血液孢子虫感染的分子检测**
首先采用Iezhova等人提出的方法[19]，使用嵌套PCR技术检测线粒体cytb基因约480 bp片段的的存在。所有特异性引物详见表1。每次PCR扩增包含一个阴性对照（无核酸酶的水），以排除污染。PCR反应总体积为20 μL，包括10 μL 2× Rapid Taq Master Mix（Vazyme Biotech，南京）、每种引物0.5 μL（10 pmol）以及2 μL模板DNA（用于初次PCR）或1 μL初次PCR产物（用于嵌套PCR）。热循环程序为：94 °C下变性3分钟，初次PCR30个循环或嵌套PCR35个循环，每个循环包括94 °C变性15秒、50 °C退火15秒、72 °C延伸15秒，最后72 °C延伸5分钟。
2.3.2 **针对L. caulleryi、L. sabrazesi和P. juxtanucleare的物种特异性PCR检测**
随后开发了常规PCR方法，分别检测L. caulleryi、L. sabrazesi和P. juxtanuclee的感染情况。这些方法针对coxI基因的部分序列，使用SnapGene软件（版本8.2.0）根据GenBank中的基因组序列（P. juxtanucleare：NC_008279.1、L. sabrazesi：NC_009336.1、L. caulleryi：NC_015304.1）设计了特异性引物。PCR反应体积为25 μL，包括12.5 μL 2× Rapid Taq Master Mix、每种引物0.5 μL（10 pmol）和2 μL模板DNA。热循环条件为：94 °C下变性4分钟，随后30个循环（初次PCR）或35个循环（嵌套PCR），每个循环包括94 °C变性15秒、52 °C退火15秒、72 °C延伸15秒，最后72 °C延伸5分钟。每个物种特异性PCR反应均包含一个阴性对照（无核酸酶的水），以排除假阳性结果。所有PCR产物均进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，并用GoodView?核酸染料染色。阳性扩增产物经过纯化后送往BGI Genomics（深圳）进行双方向Sanger测序。
2.4 **生物信息学分析**
使用BioEdit软件（版本7.2）将获得的coxI序列与其参考序列进行比对。随后使用DNAStar软件（版本7.10）进行遗传分析，并利用MEGA X软件（版本11）的Neighbor-Joining（NJ）和Maximum Likelihood（ML）方法构建系统发育树。进化距离根据Kimura 2参数模型计算。通过1000次重复实验评估构建的系统发育树的可靠性。
2.5 **统计分析**
根据地区、年龄组（<90天和>90天）和品种对样本进行分类，以评估潜在感染风险。使用SPSS Statistics（版本26.0）软件计算各地区的感染率及其95%置信区间（CI），并比较两个省份之间的感染率。统计显著性定义为p值小于0.05。

## 3. 结果**
3.1 **P. juxtanucleare、L. caulleryi和L. sabrazesi的感染率**
本研究首先使用嵌套PCR技术检测广西壮族自治区和湖南省家鸡中的血液孢子虫感染情况。在941份血液样本中，239份样本呈血液孢子虫阳性，总体感染率为25.40%（239/941，95% CI：23.21–29.12）。进一步通过PCR确认P. juxtanucleare、L. sabrazesi和L. caulleryi的感染率：222份样本（23.59%）和17份样本（1.81%）分别检测出P. juxtanucleare和L. caulleryi感染。值得注意的是，没有样本检测出L. sabrazesi感染，也未发现同时感染这两种寄生虫的情况。
3.2 **风险因素分析**
接下来分析了影响P. juxtanucleare和L. caulleryi感染率的潜在因素。结果显示，长沙和吉首市的L. caulleryi感染率存在地区差异（p < 0.05）。此外，在90天以上的鸡中，该寄生虫的平均检测率显著高于90天以下的鸡（p < 0.05），其阳性率分别为2.07%（16/773）和0.60%（1/168）。在鸡的品种方面，黑骨鸡中的患病率为3.16%（17/538），而在三黄鸡和鹧鸪鸡中未检测到阳性病例。关于P. juxtanucleare在不同地区的检测率（表3），南宁、来宾、柳州和长沙地区的家鸡感染该寄生虫的风险是吉首市的两倍以上（p < 0.05）。此外，90天以上鸡的总体感染风险几乎是90天以下鸡的四倍（OR = 3.73，p < 0.01）。从不同鸡品种的阳性率来看，统计分析表明黑骨鸡和鹧鸪鸡的检测率显著高于三黄鸡（p < 0.05）。表3. 家鸡中P. juxtanucleare感染的检测率。

3.3. P. juxtanucleare菌株的遗传特征和系统发育分析
本研究获得了P. juxtanucleare菌株的遗传特征，并对其进行了检测。成功获得了12个菌株的coxI基因序列，每个序列长度为682 bp。重要的是，在coxI基因序列中仅发现了两个核苷酸替换位点，分别位于HN-CS-2025A菌株的515位（T到C）和HN-CS-2025B菌株的162位（T到C）。这些分离株的核苷酸序列相似度在99.7%到100.0%之间，并且与GenBank数据库中检索到的参考P. juxtanucleare菌株的相似度也在99.9%到100.0%之间。然而，与其他寄生虫菌株相比，它们的序列同一性较低（<93.1%）。此外，使用MEGA X软件中的NJ和ML方法基于coxI基因序列构建了系统发育树。如图2所示，ML和NJ系统发育树的结果基本一致。所有分离株都与GenBank数据库中检索到的P. juxtanucleare参考菌株聚类在一起，这个分支与其他寄生虫（包括Plasmodium relictum和Plasmodium gallinaceum）明显分开。

3.4. L. caulleryi菌株的遗传特征和系统发育评估
本研究成功测序了4个L. caulleryi菌株的coxI基因序列，每个序列长度为754 bp。值得注意的是，这四个菌株之间的核苷酸序列同一性为100%，与参考L. caulleryi菌株（GenBank登录号：NC015304）的相似度最高（99.7%），而与其他寄生虫的相似度低于90%。同样，这四个菌株也聚类在一起，与其他寄生虫的分支明显分开（图3）。

4. 讨论
禽类 Haemosporidians 在全球的禽群中普遍存在。特别是某些物种（如P. juxtanucleare和L. caulleryi）的广泛分布对鸡产业的发展构成了重大威胁。然而，由于中国进行的流行病学研究较少，这些寄生虫的流行情况常常被忽视[10,12]。调查这些病原体的流行情况对于预防和管理这些疾病至关重要。因此，本研究旨在全面研究中国南方家鸡中三种Haemosporidians物种（P. juxtanucleare、L. sabrazesi和L. caulleryi）的流行病学特征。嵌套PCR分析显示，收集样本中Haemosporidians感染的总体检测率为25.40%（239/941，95% CI: 23.2–29.1）。值得注意的是，本研究中的检测率低于2017年海南省的报告（77.87%，95/122）[20]和2014年至2015年北京市的报告（88.7%，165/186）[21]。这种差异可能是由于调查时间、样本量、生长阶段等因素的不同所致。

此外，P. juxtanucleare、L. caulleryi和L. sabrazesi的检测率分别为23.59%（222/941）、1.81%（17/941）和0%。同样，Xuan等人报告称，在泰国鸡群中，P. juxtanucleare的感染率显著高于其他三种Haemosporidians寄生虫[22]。这有两个可能的原因：(1) 传播P. juxtanucleare、L. sabrazesi和L. caulleryi的主要昆虫媒介分别是Culex saltanensis、Culicoides和Culicoides arakawae[13,23]。推测在研究区域Culex saltanensis的更普遍存在导致了P. juxtanucleare感染率的增加。(2) P. juxtanucleare能够感染多种鸟类，包括鸡和其他鸟类[6]，这可能有助于该寄生虫的传播。此外，90天以上的鸡比90天以下的鸡有更高的P. juxtanucleare感染率，表明年龄是感染率高的一个风险因素。值得注意的是，在其他鸟类物种中也观察到了类似的模式，例如鸡和鸭中的Toxoplasma gondii[24,25]。

本研究还显示，黑骨鸡和鹧鸪鸡中P. juxtanucleare的感染率显著高于三黄鸡，其中黑骨鸡中的L. caulleryi感染率最高。有几个因素可能导致了这一现象：(1) 黑骨鸡和鹧鸪鸡通常在放养或半放养环境中饲养，这增加了它们与吸血昆虫等媒介接触的机会。(2) 黑骨鸡和鹧鸪鸡可能更有可能作为隐性携带者，长期携带昆虫而不表现出任何临床症状。近年来，人们对Haemosporida的流行病学特征产生了浓厚兴趣[26,27]，但相关数据在中国仍然有限[10,12]。在本研究中，成功测序了12个P. juxtanucleare阳性和4个L. caulleryi阳性的样本的coxI基因序列，以分析其遗传变异。值得注意的是，P. juxtanucleare菌株的核苷酸变异范围为0%到0.3%，而L. sabrazesi菌株的变异为0%。同样，Dhaayanti等人报告称，从印度尼西亚获得的9个P. juxtanucleare菌株基于cytb基因的遗传距离为0%到1%[15]。这些发现强调了P. juxtanucleare菌株的高度保守性。然而，由于本研究获得的L. caulleryi菌株数量较少（n = 4），需要进一步研究以收集更多样本并分析其遗传特征。额外的系统发育分析显示，本研究中鉴定出的所有P. juxtanucleare和L. caulleryi菌株及其从GenBank数据库中收集的参考菌株均聚集在一个分支中，并在该分支内随机分布。

需要注意的是，本研究存在一些局限性。首先，有限的采样点和样本量可能无法准确反映这些病原体在广西和湖南地区的真实流行情况。其次，本研究使用了特定的PCR技术来检测P. juxtanucleare、L. caulleryi和L. sabrazesi的存在。然而，传统PCR的灵敏度低于实时PCR方法，可能导致实际阳性率和混合感染的流行率被低估。第三，昆虫媒介在P. juxtanucleare、L. sabrazesi和L. caulleryi在禽群中的传播中起着关键作用[13,23]，而本研究没有调查这些寄生虫在昆虫媒介中的流行情况。第四，由于本研究中的L. caulleryi样本量较少（n = 4），研究结果可能无法全面反映这些寄生虫在该地区的实际遗传多样性。

5. 结论
本研究是对中国南方广西和湖南地区家鸡中P. juxtanucleare、L. caulleryi和L. sabrazesi感染的初步全面流行病学分析。结果显示，P. juxtanucleare在这些地区的感染率较高（23.59%），而L. caulleryi则较为罕见（1.81%），L. sabrazesi则完全没有发现。年龄和品种是重要的风险因素，年龄较大的鸡和某些品种（黑骨鸡和鹧鸪鸡）更容易感染。遗传分析显示，基于coxI基因的遗传分析，P. juxtanucleare和L. caulleryi的菌株具有高度保守性。这些结果强调了在中国南方家禽养殖业中持续监测Haemosporidians感染的重要性和必要性。