犬模型中进展性尿道下段梗阻的纵向初步研究：膀胱功能与结构变化及自体间充质干细胞的探索性评估 Mathilde Porato, Stéphanie No?l, Nadine Antoine, Géraldine Bolen, Jo?l Pincemail, Mutien-Marie Garigliany, Jean de Leval, Jo?lle Piret, Frédéric Decortis, Annick Hamaide

《Veterinary Sciences》：Longitudinal Pilot Study of Progressive Urethral Sub-Obstruction in a Canine Model: Bladder Functional and Structural Changes and Exploratory Evaluation of Autologous Mesenchymal Stem Cells Mathilde Porato, Stéphanie No?l, Nadine Antoine, Géraldine Bolen, Jo?l Pincemail, Mutien-Marie Garigliany, Jean de Leval, Jo?lle Piret, Frédéric Decortis and Annick Hamaide

　　**简单总结**
本研究探讨了通过缓慢缩小两只雄性狗的尿道出口是否能够重现长期前列腺增大的男性患者所出现的膀胱损伤情况，以及狗自身的干细胞是否有助于恢复。当尿液流动受阻时，膀胱必须更加努力工作，这可能导致膀胱壁增厚、瘢痕形成和功能丧失，从而降低生活质量并增加尿路感染和肾脏问题的风险。大多数动物模型使用啮齿类动物，无法准确反映人类这些变化的发生时间。研究人员使用了一种可调装置，在两只狗身上逐渐制造了部分尿道阻塞，并监测了其膀胱功能、结构和生物信号的变化。两只狗都出现了暂时性的排尿困难，但没有发生严重的、不可逆的损伤。在解除阻塞后，其中一只狗接受了干细胞静脉注射治疗，结果显示两只狗的膀胱功能都有所改善。干细胞治疗是安全的。观察到的与组织修复和氧化应激相关的变化仍处于初步阶段，尚不能明确归因于干细胞的作用。尽管该模型未能完全复制晚期膀胱损伤，但研究表明干细胞疗法可能是安全的，并鼓励进一步研究慢性膀胱功能障碍的再生治疗方法。

**摘要**
膀胱出口梗阻（BOO）可能通过渐进性的膀胱重塑导致逼尿肌功能衰竭。大多数实验研究依赖于啮齿类动物的急性诱导模型，而渐进性梗阻更能反映实际状况，因此需要非致命模型来研究慢性梗阻的病理生理机制并评估再生疗法的效果。本探索性研究旨在评估：（1）通过人工尿道括约肌（AUS）在两只狗身上诱导的渐进性BOO模型；（2）梗阻解除后自体脂肪源间充质干细胞（ADMSCs）的系统性给药。两只健康的雄性狗通过逐步充气AUS经历了渐进性BOO过程。纵向评估包括遥测尿动力学监测、尿道压力测量、超声检查、排尿后残留量测定、连续血液样本中的氧化应激标志物检测以及系列膀胱活检（用于组织学、透射电子显微镜观察、免疫组化、RT-qPCR和RNA测序（CCL2、CCR2、GFAP、VEGF、HGF）分析。AUS移除后，其中一只狗接受了三次20×10^6个PKH26标记的自体ADMSCs静脉注射，两只狗的膀胱功能均得到改善。干细胞治疗是安全的。观察到的与组织修复和氧化应激相关的变化仍需进一步验证。虽然该模型未能完全再现晚期膀胱损伤，但研究结果表明干细胞疗法具有潜力，有助于推进慢性膀胱功能障碍的再生治疗研究。

**引言**
由于尿道部分梗阻引起的膀胱功能障碍在男性中较为常见。具体而言，膀胱出口梗阻指的是任何导致尿流减少和逼尿肌压力升高的情况[1]。膀胱颈部与尿道口之间的任何压迫或阻力都会影响膀胱排空能力、性功能，从而降低生活质量[2]。男性膀胱出口梗阻最常见的原因是良性前列腺增生（BPH），最终会引起下尿路症状[3]。这些功能障碍是由于膀胱结构改变造成的，从逼尿肌肥大到纤维化（即膀胱重塑[4]）。缺氧是重塑过程中发生的应激因素之一，它会通过血管内皮生长因子（VEGF）等途径引发新生血管形成[4]。此外，尿道上皮过度生长和平滑肌肥大可能也受到缺氧状态下VEGF上调的驱动[5]。膀胱重塑还会损害线粒体功能，表现为呼吸链酶活性下降、无氧代谢增加以及活性氧（ROS）的产生。如果ROS生成超过抗氧化系统的处理能力，氧化应激会导致线粒体等组织的脂质过氧化。如果这种状态持续存在，能量产生受阻会导致逼尿肌收缩能力下降[6]。膀胱重塑还伴随着逼尿肌神经支配显著减少，这种减少与尿道出口梗阻直接相关，并在梗阻解除后可逆[7]。有研究表明，在损伤后，神经再生可能会因胶质酸性纤维蛋白（GFAP）的功能障碍而延迟[8]，GFAP是一种存在于施万细胞中的细胞骨架蛋白，在轴突损伤后其表达会上调[9]。对于患有前列腺疾病导致尿道部分梗阻的男性，医学治疗旨在抑制前列腺生长（5α-还原酶抑制剂）和前列腺平滑肌收缩（α1-肾上腺素能受体阻断剂、磷酸二酯酶抑制剂），或缓解膀胱收缩（抗胆碱能药物）；当病情严重或进展到无法忍受的程度时，则选择前列腺手术[3,10,11]。目前的治疗目标主要是缓解下尿路症状，但尚无方法能在膀胱逼尿肌发生不可逆形态学改变后将其恢复。在这种情况下，基于干细胞的再生疗法可能成为修复纤维化、功能失调膀胱的有吸引力的选择。已有临床研究表明，在膀胱镜引导下将自体干细胞注射到膀胱壁具有积极效果[12,13,14]。

**动物模型**
研究干细胞在膀胱出口梗阻中的作用需要动物模型，但现有模型存在局限性。大多数模型是基于啮齿类动物的短期致死模型，缺乏中间阶段的组织学观察[15]。此外，为了研究干细胞的潜在治疗价值，研究方案应重点关注疾病的病理生理机制、干细胞的作用机制、最佳干细胞来源的确定，以及安全有效的干细胞给药剂量[16]。研究表明，趋化因子C-C基序配体2（CCL2）在人类膀胱平滑肌细胞暴露于高压时表达上调[17]。在小鼠中，已证实阻塞膀胱中的CCL2表达高于对照组，并推测其上调可能与作为膀胱功能障碍治疗手段时干细胞的招募有关[18]。与啮齿类动物不同，由于狗与人类在下尿道解剖结构上的相似性，犬类模型可能更适合研究膀胱出口梗阻对逼尿肌的影响。实际上，雄性狗也会出现膀胱出口部分梗阻，但通常与尿石症或尿路肿瘤有关，而非BPH（尽管BPH也会在老年狗中发生）。狗的尿道部分梗阻表现为排尿时尿流减少，导致尿频、排尿困难甚至血尿[19]。若不加以治疗，膀胱出口梗阻可能导致尿失禁、尿液潴留、膀胱无力、严重的尿路感染，甚至需要安乐死。

**研究目的**
本研究的主要目的是评估在雄性狗中建立尿道部分梗阻模型的可行性，以及在该模型中使用自体间充质干细胞的可行性。具体目标如下：
1. 在两只狗身上诱导渐进性尿道部分梗阻，并描述尿液膀胱在时间上的功能性和结构性变化（通过尿动力学和临床评估以及宏观（超声检查）、微观（组织学、透射电子显微镜）、免疫组化、分子（RT-qPCR、RNA测序、氧化应激标志物）方法进行分析）。
2. 在其中一只狗身上描述接受自体间充质干细胞后的功能性和结构性变化。

**方法和材料**
**2.1 狗只**
本研究选择了两只性发育正常的雄性比格犬。它们在当地动物设施出生并饲养。动物饲养和实验程序均获得了列日大学动物使用伦理委员会的批准（参考编号1813）。实验期间，它们与同类犬共同饲养，生活在标准犬舍环境中，定期接受人类互动和其他狗的陪伴。由于实验频率较高，这两只狗在整个研究期间至少每周接受三次监测。每次实验前都会对每只狗进行身体检查。每周通过自由采尿方法收集尿液样本进行尿分析（Urispec Plus VET 10 Plus尿试纸，Henry Schein Inc，美国纽约州梅尔维尔）、手动折射仪测量 urine 含量（Euromex microscopen，荷兰阿纳姆），并进行Diff-Quik染色细胞学检查。如果根据细胞学检查发现细菌尿并怀疑感染，样本会送到商业实验室（Synlab Laboratoire Collard，比利时列日）进行细菌培养。如有阳性结果，该狗将暂时退出实验方案，并根据药敏结果接受抗菌治疗直至培养结果转为阴性。每隔一周采集一次颈静脉血样本，检测肌酐和血尿素氮（Catalyst Dx，Idexx Laboratories Inc，美国缅因州韦斯特布鲁克）。

**2.2 实验设计**
在两只狗身上，通过逐步充气人工尿道括约肌（AUS）逐步诱导尿道部分梗阻。使用的AUS宽度为14毫米，内径为10毫米，放置方法是通过尾部腹腔切口。括约肌的选择符合制造商推荐（Norfolk Vet Products，美国伊利诺伊州斯科基）。手术过程中评估了AUS的最大扩张能力（使AUS袖带完全展开），并在实验结束时保持装置完全空状态，以便在整个研究过程中逐步增加梗阻程度。数据记录包括梗阻建立前后的变化以及梗阻解除后的变化。研究分为多个阶段：狗1为T1至T7，狗2为T1至T10。T1对应于梗阻前的状态。逐步增加AUS袖带的扩张幅度（每次10%的最大扩张能力），这一过程分别对应狗1的T2至T5阶段和狗2的T2至T8阶段。一旦出现排尿困难（如排尿开始困难、尿流缓慢或不规则、排尿结束时滴尿），则立即停止梗阻过程。狗1的AUS在T6之前移除，狗2的AUS在T9之前移除；因此，最大梗阻阶段分别为狗1的T5和狗2的T8。在狗2中，AUS移除后第二天开始给予自体PKH26标记的间充质干细胞（ADMSCs）注射（20×10^6个细胞，5分钟内完成）。

**2.3 实验步骤**
1. **麻醉和手术准备**
每只狗均接受全身麻醉，使用咪达唑仑（Midazolam，Mylan Institutional Inc，美国宾夕法尼亚州坎农斯堡，0.2 mg/kg）、美沙酮（Comfortan，Dechra Veterinary Products Ltd，英国什鲁斯伯里，0.2 mg/kg）、丙泊酚（Diprivan，Astra Zeneca，英国剑桥，2–4 mg/kg）和头孢唑啉（Cefazolin，Sandoz Inc，美国新泽西州普林斯顿，20 mg/kg）。插入气管插管，并用异氟烷和氧气维持麻醉。术后每8小时给予头孢唑啉（20 mg/kg）和美沙酮（0.2 mg/kg）24小时，第一天还给予卡洛芬（Rimadyl，Zoetis Inc，美国密歇根州卡拉马祖，2 mg/kg），随后4天内改为口服给药。

2. **AUS诱导和 Removal**
通过在前列腺后方的尿道周围逐步充气AUS来诱导尿道部分梗阻。AUS的尺寸根据制造商建议选择（Norfolk Vet Products，美国伊利诺伊州斯科基）。手术过程中评估了AUS的最大扩张能力，并在实验结束时保持装置完全空状态。

3. **数据收集**
数据记录包括梗阻建立前后的变化以及梗阻解除后的变化。研究分为多个阶段：狗1为T1至T7，狗2为T1至T10。T1对应于梗阻前的状态。通过逐步增加AUS袖带的扩张幅度来实施梗阻过程（每月增加10%的最大扩张能力）。梗阻过程分别为狗1的T2至T5阶段和狗2的T2至T8阶段。当出现排尿困难（如排尿启动困难、多次尝试后才能开始排尿、尿流缓慢或不规则、排尿结束时滴尿）时，立即停止梗阻。狗1的AUS在T6之前移除，狗2的AUS在T9之前移除；因此，最大梗阻阶段分别为狗1的T5和狗2的T8。在狗2中，AUS移除当天被视为给予自体ADMSCs的日子，将20×10^6个ADMSCs通过头静脉注射。AUS移除后的第4天和第8天重复注射相同剂量。狗1未接受ADMSCs注射。实验在AUS移除后继续进行至狗1的T7阶段和狗2的T10阶段。研究的简化时间线如图1所示。表1列出了每只狗的具体时间安排。图1展示了两只狗的研究时间线：S表示气囊（AUS）的放置；R表示气囊的移除；B表示膀胱活检；红点表示自体脂肪衍生的间充质干细胞（ADMSCs）的注射。在两只狗中，T1阶段对应于气囊放置前的时期。逐渐发展的膀胱阻塞过程（即气囊的持续充气）在狗1中对应于T2至T5阶段，在狗2中对应于T2至T8阶段。在狗1中，气囊移除发生在T6阶段之前；在狗2中，则发生在T9阶段之前。气囊移除后，研究继续进行至T7阶段（狗1）和T10阶段（狗2）。在研究的每个阶段，对每只狗进行了膀胱活检、尿动力学遥测记录、尿道压力测量、膀胱和肾脏的超声检查、排尿后残余尿量的测定以及血液采样。表1总结了这两只狗在研究各阶段的数据收集细节。

2.3 自体脂肪衍生间充质干细胞（ADMSCs）：在全身麻醉下，从狗2的皮下脂肪组织中获取了一块5×1×1厘米的样本，并将其置于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。如先前描述[20]，从皮下脂肪组织中分离出黏附细胞和类似成纤维细胞的细胞。这些细胞经过鉴定，以满足国际细胞治疗学会[21,22]设定的最低标准，该标准已在狗身上得到验证[23,24]。具体操作为：将第三代细胞与抗CD29（藻红素偶联的小鼠单克隆IgG1，BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥市）、抗CD44（藻红素偶联的小鼠单克隆IgG1，BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥市）、抗CD90（藻红素偶联的大鼠单克隆IgG2b kappa，eBioscience，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）和抗CD45（荧光素偶联的大鼠单克隆IgG2b kappa，eBioscience，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）抗体一起孵育。一小时后，细胞通过流式细胞术进行分析。此外，还通过细胞多能性评估其分化为脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞的能力：根据制造商的指南（Stempro分化试剂盒，Gibco，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市），在相应的培养时间（7天、14天和21天）后，通过特异性培养基诱导分化。最终，通过Oil Red O染色（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市）检测细胞质中是否含有脂滴来确认脂肪细胞的分化情况；通过Alizarin Red S染色（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市）检测细胞外基质中的钙沉积情况来确认骨细胞的分化情况；通过Alcian Blue染色（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市）检测软骨细胞的分化情况。分离和鉴定后，ADMSCs进行第四代培养，并冻存于液氮中。后续使用前，根据制造商建议（PKH26红色荧光细胞标记试剂盒，来自Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市），在低代数（少于6代）时用PKH26标记细胞。首先解冻冷冻细胞，在T175培养瓶中培养至90%汇合度，然后使用胰蛋白酶处理。分离出的ADMSCs为第5代，用无血清培养基清洗后，重新悬浮在标记试剂盒中的稀释缓冲液中（含有4×10^-6 M的PKH26）。将细胞悬浮液与含有PKH26的标记溶液混合，室温下孵育5分钟。加入2毫升胎牛血清（Gibco，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）终止反应后，用Dulbecco改良Eagle培养基（Gibco，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）清洗细胞三次，并通过荧光显微镜观察。保留一部分PKH26标记的细胞进行为期10天的培养，以监测其长期稳定性和存活率。注射前通过Trypan blue染色（Invitrogen，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）计数活细胞，确保存活率超过90%。

2.4 尿动力学遥测研究：遥测系统由发射器、接收器、数据采集系统和尿流测速系统组成。发射器（Physio Tel Multiplus TL11M3-D70-PCTP，DSI）包含两个生物电位电极（本研究未使用）和两个充满液体的导管，导管尖端壁薄，能够检测敏感的压力变化并将信号传递给发射器体内的压力传感器。发射器通过手术植入左侧腹侧的皮下空间。一个导管穿过膀胱顶端壁，其末端置于膀胱腔内以测量膀胱压力；另一个导管留在腹腔内以测量腹压（图2）。图2显示了遥测装置的手术植入过程：狗的头部在左侧，尾部在右侧，狗处于仰卧位。(a) 通过尾部剖腹术接入膀胱以放置第一个充满液体的导管，同时进入腹腔放置第二个导管。(b) 腹壁缝合后，将发射器固定在皮下口袋中。(c) 皮下口袋关闭后，发射器在皮肤下可见。数据通过无线电波传输到代谢笼侧壁上的远程接收器（RMC-1 Physio Tel，DSI）。接收器与数据交换矩阵（Dataquest ART Data Exchange Matrix，DSI）相连，该矩阵再连接到环境压力记录仪和Dataquest采集与分析系统（DQ ART 3.1 Gold CM，DSI）。遥测研究分为多个阶段，根据尿道阻塞程度逐步递增的情况进行，从气囊放置前开始，直到气囊移除后结束。在进行膀胱活检的两个阻塞阶段之间，设有2周的清洗期。除清洗期外，每周重复进行遥测测试。研究期间，两只狗每周接受三次尿动力学测试，每次测试持续四小时。为促进排尿，在每次测试开始时肌肉注射0.5 mg/kg的呋塞米。测试期间，每只狗均可自由进食和饮水。

2.5 尿道压力测量：在采集膀胱活检样本前进行了尿道压力测量（UPP）。首先用丙泊酚（6 mg/kg，静脉注射）诱导麻醉，并通过持续静脉输注丙泊酚（最大剂量20 mg/kg/h）维持麻醉状态。保持轻度麻醉状态，表现为眼球居中、存在睫毛反射且颌部无运动。如先前描述[25,26]，连续进行三次尿道压力测量，并报告每次测量的平均值。

2.6 超声检查：每周对两只狗的肾脏进行超声检查，以检测肾盂情况并排除肾盂扩张，这可能表明是急性膀胱阻塞而非渐进性阻塞。每月测量两次膀胱壁厚度，标准方法是：通过尿道插管排空膀胱，然后缓慢注入4 mL/kg的无菌生理盐水。在膀胱的长轴矢状面上，于膀胱背面和正面各测量两点膀胱壁厚度（图3）。图3中，红色星号表示超声图像上的红点位置，标出膀胱矢状面上的测量点：左上角为头腹侧位置；右上角为尾腹侧位置；左下角为头背侧位置；右下角为尾背侧位置。

2.7 排尿后残余尿：每月通过无菌尿道插管收集两只狗的排尿后残余尿，并记录体积。为了促进和优化自然排尿过程，在收集残余尿之前，将两只狗用牵引绳带出室外，在不同表面（草地、沥青地面和林地）行走10至15分钟。

2.8 样本采集：在研究的每个阶段，从两只狗的膀胱获取组织样本，用于组织学观察、透射电子显微镜（TEM）、免疫组化、逆转录定量PCR（RT-qPCR）和RNA测序。每个膀胱样本通过尾部剖腹术获取。在手术记录中记录活检位置。选择的新活检位置远离之前的活检部位（基于手术记录），同时避开疤痕和浆膜粘连处。在研究的每个阶段采集血液样本以评估氧化应激状况。

2.8.1 膀胱组织的组织学观察和透射电子显微镜检查：膀胱组织样本先用4%戊二醛固定，然后包埋于石蜡中，切片厚度为5 μm。切片用苏木精-伊红（HE）染色以观察整体结构，再用Masson三色染色法评估组织纤维化程度。在光学显微镜（Olympus BX51，日本东京）下进行非盲法观察。使用QuPath-0.5.1-x64软件[27]，手动绘制并测量总面积及结缔组织面积：(i) 尿道上皮与最内层肌肉之间的结缔组织面积；(ii) 浆膜与最外层肌肉之间的结缔组织面积。这些区域的结缔组织面积以占总面积的百分比表示。其他膀胱样本立即置于2.5%戊二醛（Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市）溶液中，稀释于0.1 M乙醛酸缓冲液（pH 7.2）中，温度4°C，静止浸泡1小时。随后用1%锇四氧化物（Electron Microscopy Sciences，美国宾夕法尼亚州摩根敦市）在0.1 M乙醛酸缓冲液中固定1小时，再用逐渐浓缩的乙醇（乙醇EM级，Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯市）冲洗。然后放入新鲜固定液中低温固定2小时。接着用1%锇四氧化物（Electron Microscopy Sciences，美国宾夕法尼亚州摩根敦市）在0.1 M乙醛酸缓冲液中固定1小时，再用不同浓度的乙醇冲洗。在树脂浸渍前进行环氧丙烷（Electron Microscopy Sciences，美国宾夕法尼亚州摩根敦市）中间处理。样品先浸入两份环氧丙烷和一份Epon树脂（Electron Microscopy Sciences，美国宾夕法尼亚州摩根敦市）的混合物中，每层各静置1小时，最后在纯Epon树脂中过夜。之后在60°C烤箱中Polymerize 48小时。切片厚度为90 nm，用0.5%尿素酰醋酸盐（Taab Laboratories Equipment Ltd.，英国奥尔德马斯顿）和柠檬酸铅（VWR，Avantor，美国宾夕法尼亚州拉德诺）染色。切片在Zeiss EM910显微镜（Zeiss，德国奥伯科亨）下观察。

2.8.2 RNA提取、转录组和基因分析：从气囊放置前、气囊移除时及最终活检时采集的膀胱组织进行RNA测序。样本先置于RNA提取试剂盒（Ambion，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）中。样本在4°C冷藏最多24小时后，置于-80°C保存以备后续处理。使用改良的TRIzol方案（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市）提取总RNA。分离后，将含有RNA的水相转移到NucleoSpin? RNA提取柱（Macherey-Nagel，德国汉堡市）中，按照制造商指南继续提取RNA。使用5200 Fragment Analyzer（Agilent Technologies，美国加州圣克拉拉市）进行总RNA质量控制。六个样本（总RNA量≥100 ng，RQN评分>8）采用Illumina Stranded Total RNA Prep及Ribo-Zero Plus协议（Illumina Ref kit 20040529）进行处理。图书馆文库在QIAxcel Advanced系统（QiAGEN）上使用DNA筛选试剂盒进行了评估。最终的双索引文库通过qPCR和KAPA文库定量试剂盒进行定量，该试剂盒包括Illumina标准品（Roche参考编号07960140001），然后等摩尔混合。测序是在Illumina NovaSeq 6000测序仪上进行，使用S4流式细胞器，每个样本产生1.5亿对末端序列的读数，测序深度为50百万对末端序列。原始测序数据使用特定于样本的索引进行解复用，过滤质量后，使用bcl2fastq v2.20.0软件转换为Fastq文件以供后续分析。测序数据质量使用FastQC工具对每个样本生成单独报告，并使用MultiQC生成包含项目中所有样本的报告。使用开放生物信息学工具RaNA-seq [28]，通过Salmon算法 [29] 对样本进行定量，设置以下参数：配对末端，默认参数。由于每个时间点没有生物重复样本，因此没有进行差异表达统计。在每只狗中，根据每百万转录本（TPM）的log2倍数变化计算了初始时间点与连续时间点之间的表达值。绘制了热图以了解选定基因（ccl2、ccr2、vegf、gfap和hgf）的调控模式。

2.8.3. 通过逆转录定量聚合酶链反应评估膀胱样本中的CCL2、CCR2、GFAP、VEGF和HGF mRNA表达
选择β-actin作为目标基因表达的参考内参基因，其引物序列在其他文献中有描述 [30,31]。ccl2的引物序列在其他文献中有描述 [32]，ccr2 [32]、gfap [33]、vegf [34] 和 hgf [35] 的引物序列也在其他文献中有描述。引物序列见表2。表2. 用于评估狗膀胱样本RT-qPCR的犬特异性引物序列。PCR反应使用Luna Universal One-Step RT-qPCR试剂盒（Sigma Aldrich，美国圣路易斯）进行，包含10 μL的Mix Luna、5 μL的UPure水、1 μL的试剂盒中的酶、1 μL的F引物和1 μL的R引物。总共加入2 μL的RNA，最终体积为20 μL。样品稀释至10 ng/μL。循环条件如下：50°C加热20分钟，95°C加热5分钟，然后进行45个循环，每个循环包括95°C 30秒和60°C 30秒（对于β-actin、vegf-a、vegf-d和hgf），或者64°C 30秒（对于vegf-b、vegf-c、ccl2和gfap），最后在72°C下延伸30秒，使用QuantStudio? 1实时PCR系统（Thermofischer Scientific，美国沃尔瑟姆）。通过熔解曲线分析确认PCR结束时获得的产物的特异性。对于每个样本和时间点，反应重复进行两次，并计算平均Ct值。通过计算ΔCt值（Cttarget ? Ctβ-actin）将每个目标基因的相对表达值标准化为β-actin。然后以2?ΔCt表示标准化表达水平，提供相对于参考基因的log2基础上的基因表达度量。在每只狗中，计算了初始时间点与连续时间点之间的log2倍数变化。

2.8.4. 膀胱样本中的CCL2、CCR2、GFAP和VEGF免疫组化
新鲜膀胱组织活检样本迅速在OCT树脂（Leica Biosystems，美国伊利诺伊州迪尔帕克）中冷冻，并存储于-80°C。使用Leica CM3050s冷冻切片机制备10 μm厚的切片。切片首先在4°C的丙酮中固定，然后干燥。在PBS中重新水化后，组织与0.03%过氧化氢（过氧化物酶阻断剂，Agilent Technologies，美国加州圣克拉拉）孵育10分钟以抑制内源性过氧化物酶活性，随后用PBS洗涤。为了减少非特异性染色，切片用0.25%酪蛋白在PBS中封闭10分钟（Protein Block，Agilent Technologies，美国加州圣克拉拉）。染色（表3）在室温下的湿室中完成，初次抗体孵育1小时，用PBS冲洗三次，每次5分钟，二次抗体孵育30分钟。在每次染色过程中，通过省略每种二次抗体对应的初次抗体来系统地进行阴性对照。用PBS洗涤后，使用3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）作为显色底物（ImmPACT? AEC Substrate Kit，Peroxidase，Vector Laboratories，美国纽瓦克）显示免疫反应性。表3. 用于免疫染色的抗体。切片随后用蒸馏水洗涤，并用Mayer’s hematoxylin复染2.5分钟。最后，用商业 mounting medium（Glycergel mounting medium，Agilent Technologies，美国加州圣克拉拉）固定切片，使用QuPath-0.5.1-x64软件 [27] 以非盲法进行细胞计数的扫描。简要来说，在每个切片上，指定颜色矢量后，使用刷子工具手动定义肌肉和尿路上皮区域。剩余未分类的区域定义为“基质”。然后使用标准参数运行自动细胞检测工具，除了核参数sigma（1 μm）、最小面积（15 μm2）和最大面积（200 μm2）以及阈值强度（0.35）。最后，通过创建单个测量分类器进行阳性细胞分类，通道滤波器设置为DAB，在细胞内检测（DAB OD均值），阈值以上和以下的阳性及阴性分别设置。

2.9. 氧化应激状态
静脉血样本从上午8点至9点收集，收集在含有Na肝素或EDTA的真空采血管中，具体取决于测试参数。两只狗在采血前至少禁食12小时。使用21号针头进行外颈静脉穿刺，将血液样本收集在适当的试管中。取出一部分全血用于还原型和氧化型谷胱甘肽及谷胱甘肽过氧化物酶的测定。然后，两个试管以1500× g离心10分钟。立即向500 μL磷酸盐缓冲液（10%）中加入500 μL血浆EDTA以稳定维生素C，然后放入干冰中冷冻。另取1 mL血浆EDTA加入5 μL浓度为2 mg/mL的丁基羟基甲苯中用于异前列腺素的测定，然后也放入干冰中冷冻。其余的EDTA血浆和血清分别收集在单独的试管中，用于分析维生素E、髓过氧化物酶、铜、锌和硒，并放入干冰中冷冻。所有样本均存储在-80°C，直到根据其他文献描述的方案进行氧化应激生物标志物的分析 [36,37,38,39]。

2.10. 数据解释
本文中呈现的所有结果都是描述性的；因此，应谨慎解释。以下变量是根据4小时远程连续记录测量的或计算得出的：最大和平均腹压（Pabdomax, Pabdomean）；排尿期间的阈值体积（fluid volume during micturition）；以及阈值逼尿肌压力和平均及最大逼尿肌压力（Pdetth, Pdetmean, Pdetmax，分别使用以下公式计算：逼尿肌压力 = 膀胱压力 ? 腹压）。阈值参数在排尿期间测量或计算得出。顺应性（C）使用以下公式计算：C = (Vth ? V0)/(Pbladth ? Pblad0)，其中Vth是阈值体积；V0和Pblad0分别是记录开始时的尿膀胱体积和压力；Pbladth是阈值压力。尿流（F）使用以下公式计算：Flow = Vth/排尿持续时间。排尿持续时间以秒为单位测量。尿道阻力使用以下公式近似计算：Resistance = Pdetmean/F2，该公式改编自Buzelin和Glémin [40]。对于每个变量和每个研究阶段，从相应阶段的全部远程记录中计算平均值。

以下变量是根据UPP测量结果测量或计算得出的：最大尿道压力（MUP）、最大尿道闭合压力（MUCP，即MUP与膀胱压力之差）、积分压力（IP，尿道功能曲线下的面积）以及最大尿道压力前的长度（LbMUP）。定义符合国际尿控学会 [41] 的标准。在本研究中，描述了另外两个变量以更好地评估AUS对尿道压力曲线初始部分的影响：LbMUPAUS定义为AUS存在时尿道压力曲线前的长度，MUCPAUS定义为AUS位置处对应的MUCP。这两个变量在AUS放置前、AUS移除时以及研究的最后时间点进行记录。平均膀胱壁厚度基于每次超声检查时在四个位置测量的膀胱壁厚度计算得出，适用于每只狗的每个研究阶段。

为了初步了解与膀胱出口阻塞相关的分子变化，并探索ADMSC给药后的潜在差异，我们描述性地比较了两只狗在AUS放置前、AUS移除时和最终活检时的膀胱组织基因表达谱。我们检查了与血管生成（vegf）、神经纤维（gfap）或细胞趋化性（ccl2、ccr2） [42,43,44] 相关的多个因素的表达水平。对于这些选定的基因，我们通过RT-qPCR分析完成了观察，并添加了hgf基因作为抗纤维化标志物。报告了通过RT-qPCR和RNA测序获得的倍数变化。最后，我们将这些数据与通过免疫组化评估的蛋白质表达数据进行了对比。

对于免疫组化，使用QuPath-0.5.1软件 [27] 评估了每个标记物（CCL2、CCR2、GFAP和VEGF）在三个组织学区域（平滑肌区域、基质和尿路上皮）中的阳性细胞百分比，在三个研究阶段（AUS放置前、AUS移除时和最终活检时），基于在三个不同切片上计数的阳性细胞数量。

3. 结果
3.1. 狗
这项初步研究的两只狗在研究开始时分别为3岁，研究结束时分别为5岁（狗1）和6岁（狗2）。在整个研究过程中，两只狗的完整血细胞计数、肌酐和血尿素氮结果均在各自的参考范围内。研究期间，细菌尿培养在两只狗中两次检测到铜绿假单胞菌，发生在尿路部分阻塞期间。治疗基于微生物敏感性（marbofloxacin（Marbocyl，Vetoquinol，每天4 mg/kg），持续15天，并暂停实验直到尿培养结果转为阴性。在狗1中，75% AUS cuff充盈9个月后观察到排尿困难。在狗2中，115% AUS cuff充盈12个月后观察到排尿困难，这是由于硅橡胶的弹性超过了其名义充盈体积。除了膀胱活检后短暂的自限性血尿（持续时间少于1天）外，没有观察到临床异常或不良事件，也没有达到人类终点。研究结束后，两只狗恢复到正常的犬舍生活，没有限制或改变住所或活动。

3.2. 自体脂肪来源的间充质干细胞
皮下脂肪组织取样过程顺利。然后，分离和培养方法使得能够收获、生长并长期冷冻保存表型特征的ADMSCs，以便对狗2进行三次自体给药，每次含有20 × 10?个活细胞。间充质干细胞表达阳性标记物（CD44、CD29和CD90），而阴性标记物（CD45）不存在。细胞的多能性通过其分化为脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞的能力得到证明。PKH26标记的ADMSCs在狗2第9周的膀胱壁全层活检中有效观察到（图4）。图4. 第9周（AUS移除和ADMSC注射后2周）狗2的膀胱壁全层活检中的PKH26标记ADMSCs。DAPI染色用于定位细胞核（蓝色），叠加相同的红色荧光图像以识别PKH26标记的ADMSCs。

3.3. 尿动力学遥测研究
两种狗的手术植入遥测设备过程顺利。术后在皮下囊袋水平观察到自限性的血清肿，并在10天内自行消退。两种狗的逼尿肌压力、尿道阻力、尿流和排尿时间的演变见图5。图5. 根据研究阶段显示了两种狗的逼尿肌压力、尿道阻力、排尿时间和尿流的变化。在每只狗中，最大梗阻期（狗1中的T5和狗2中的T8）用星号标出。P det th：逼尿肌阈值压力；P det max：最大逼尿肌压力；P det mean：平均逼尿肌压力。腹压和膀胱顺应性的数值分别在表4（狗1）和表5（狗2）中呈现。表4显示了狗1在各个研究阶段的腹压和膀胱顺应性。Pabdomax：最大腹压；Pabdomean：平均腹压。T1：梗阻前的阶段；T2至T5：逐步梗阻期；T5：最大梗阻期；T6至T7：梗阻后阶段。表5显示了狗2在各个研究阶段的腹压和膀胱顺应性。P abdo max：最大腹压；P abdo mean：平均腹压。T1：梗阻前的阶段；T2至T8：逐步梗阻期；T8：最大梗阻期；T9–T10：梗阻后阶段。T9：由于冲洗期没有进行遥测记录。在两只狗中，以下遥测参数的变化情况相似：逼尿肌阈值压力在研究开始时最低，在最大梗阻时期最高，然后在AUS移除后下降；尿流在研究开始时最高，在最大梗阻时期降至最低，之后在AUS移除后增加；尿道阻力与尿流趋势相反：在研究开始时最低，然后在最大梗阻时期最高，最后在AUS移除后下降；膀胱顺应性在梗阻期间下降，从研究开始时的基线值降至最大梗阻时期的最低值，之后在AUS移除后增加；排尿持续时间在梗阻期间增加，从研究开始时的最低值增加到狗1的最大梗阻时期或狗2的梗阻期间。AUS移除后，两只狗的排尿持续时间均缩短。其他遥测参数在两只狗之间的变化不同：最大和平均腹压在狗1的研究开始时最高，而在狗2的最大尿道梗阻时期最高；在狗1的研究结束时最低，而在狗2的梗阻后时期达到最低。最大和平均逼尿肌压力在狗1的梗阻期间以及狗2的最大梗阻时期最高。在狗2中，这些压力在研究结束时最低。在狗1中，Pdetmax在研究开始时最低，而Pdetmean在AUS移除后最低。

3.4 尿道压力描记
在狗1（表6）中，研究开始时IP（内压）最低（735 cm*cmH2O）。一旦梗阻过程开始，IP升高并一直保持在较高水平直到研究结束（1282 cm*cmH2O）。最大尿道压力和MUCP在梗阻期间最低（分别为166 mmHg和152 mmHg），而在AUS移除后最高（分别为339 mmHg和336 mmHg）。表6显示了狗1在每个研究阶段的尿动力学变量。T1：梗阻前的阶段；T2至T5：逐步梗阻期；T5：最大梗阻期；T6至T7：梗阻后阶段。在狗2（表7）中，IP在梗阻期间最低（608 mmHg），而在最大梗阻时期最高（1267 mmHg）。AUS移除后降低。最大尿道压力和MUCP在研究结束时最低（分别为64 mmHg和62 mmHg），而在最大梗阻时期最高（分别为158 mmHg和154 mmHg）。表7显示了狗2在每个研究阶段的尿动力学变量。T1：梗阻前的阶段；T2至T8：逐步梗阻期；T8：最大梗阻期；T9–T10：梗阻后阶段。T9：由于冲洗期没有进行遥测记录。LbMUP在两只狗的所有研究阶段都发生变化（表6和表7）。MUCPAUS和LbMUPAUS的值显示了尿道梗阻的有效性：在两只狗中，MUCPAUS的值从研究开始（AUS放置前）到最大尿道梗阻时期增加，然后在研究结束时下降（此时AUS已移除数月）。LbMUPAUS在整个研究过程中的稳定性表明MUCPAUS是在每只狗的同一尿道位置测量的。

3.5 超声波研究
在两只狗中，整个研究期间均未观察到右侧和左侧肾盂的急性扩张。狗1的膀胱壁平均厚度从尿道梗阻前的1.3毫米增加到梗阻最大时的2.0毫米。在狗2中，膀胱壁平均厚度从尿道梗阻前的1.3毫米增加到梗阻最大时的1.8毫米（表8和表9）。表8显示了狗1的超声研究结果。T1：梗阻前的阶段；T2至T5：逐步梗阻期；T5：最大梗阻期；T6至T7：梗阻后阶段。表9显示了狗2的超声研究结果。T1：梗阻前的阶段；T2至T8：逐步梗阻期；T8：最大梗阻期；T9–T10：梗阻后阶段。T9：由于冲洗期没有进行遥测记录。

3.6 排尿后残余尿量
在狗1中，排尿后残余尿量的最大值为4.1 mL/kg，发生在最大尿道梗阻时期。梗阻前的值为3.6 mL/kg，研究结束时的值为3 mL/kg。梗阻过程中的最小值为1.7 mL/kg。在狗2中，排尿后残余尿量的最大值为3.7 mL/kg，发生在AUS移除前的梗阻阶段（对应于T7）。梗阻前的值为2.1 mL/kg，研究结束时的值为1.8 mL/kg。梗阻过程中的最小值为1.2 mL/kg。

3.7 膀胱样本的组织学和透射电子显微镜观察
在狗1中，组织学（HE）评估显示膀胱组织结构正常，除了肌肉层，其网状结构从AUS移除（T6）开始逐渐变得紊乱，直到研究结束（T7）（图7）。图7显示了狗1膀胱壁的组织学评估（苏木精-伊红染色，放大倍数×2）：(a) AUS放置前；(b) 最大梗阻时；(c) 最终活检时。括号强调了肌肉层网状结构的逐渐丧失。在Masson三色染色切片中，最终活检时（AUS移除后7个月）浆膜下层显示出更高的结缔组织比例，占总组织面积的32%，而T1时为11.7%。尿路上皮层中的结缔组织比例相对稳定（T1时为19%，T7时为13.9%）（图8）。图8比较了狗1膀胱壁中的结缔组织量（Masson三色染色，放大倍数×2）：(a) AUS放置前；(b) 最终活检时。Cu和Cs突出显示了肾路上皮层中的结缔组织稳定增加，而浆膜下层中的结缔组织增加。在狗2中，早期梗阻阶段（第二梗阻阶段，对应于T3）的Masson三色染色中观察到丰富的结缔组织和淋巴细胞浸润。在最大尿道梗阻时，主要观察到的现象是充血。最终活检中仍可见充血以及肌肉层的紊乱（图9）。图9显示了狗2膀胱壁的组织学评估（苏木精-伊红染色，放大倍数×2）：(a) AUS放置前；(b) 最大梗阻时；(c) 最终活检时。括号强调了肌肉层网状结构的逐渐丧失。星号标记了充血区域。在Masson三色染色切片中，最终活检时（AUS移除后5个月）浆膜下层显示出更高的结缔组织比例，占总组织面积的17.6%，而T1时为7.8%。尿路上皮层中的结缔组织比例也增加（T1时为19%，T10时为29.3%）（图10）。图10比较了狗2膀胱壁中的结缔组织量（Masson三色染色，放大倍数×2）：(a) AUS放置前；(b) 最终活检时。可以看出肌肉组织（M）与结缔组织（C）比例的变化。在两只狗中，膀胱样本的TEM观察显示整个研究期间细胞器形态正常，尤其是线粒体形态正常。

3.8 反转转录酶定量聚合酶链反应分析和RNA测序
对于选定的基因，两狗表达水平的变化如图11所示。图11通过RT-qPCR（a）和RNA测序（b）展示了ccl2、ccr2、gfap、vegf和hgf在两狗中的表达变化。表达数据以初始时间点与连续时间点之间的倍数变化（log10尺度）表示。RT-qPCR数据归一化到β-actin，而RNA测序数据以每百万转录本（TPM）表示。T5D：狗1在梗阻期间的倍数变化；T8M：狗2在梗阻期间的倍数变化；T7D：狗1在AUS移除后的倍数变化；T10M：狗2在AUS移除和ADMSC给予后的倍数变化。生成热图以展示ccl2、ccr2、vegf、gfap和hgf基因的表达模式（图12）。图12显示了每只狗（狗1用橙色，狗2用蓝色）在AUS放置前（T1M：狗2；T1D：狗1）、最大梗阻时（T8M：狗2；T5D：狗1）和最终活检时（T10M：狗2；T7D：狗1）的选基因表达值（归一化为TPM）。在梗阻期间（狗1的T1至T5，狗2的T1至T8），RT-qPCR分析显示两狗的表达模式一致：gfap下调（狗1降低0.4倍，狗2降低0.7倍），而vegf-b上调（狗1提高2.1倍，狗2提高2.5倍）。这些模式也在RNA测序中观察到。在同一时期，至少有一种方法检测到其他显著的基因表达变化：在狗1中：ccr2和ccr2上调（RT-qPCR分别为1.6倍和1.7倍）；在狗2中：hgf、vegf-a、vegf-c和vegf-d上调（RNA测序分别为5.4倍，RT-qPCR分别为1.6倍、1.9倍和1.9倍）。在AUS移除后和狗2接受ADMSC后（狗1的T1至T7，狗2的T1至T10），RT-qPCR分析显示两狗的表达模式一致：ccl2上调（狗1提高2.1倍，狗2提高3.2倍），hgf也上调（狗1提高1.4倍，狗2提高6.5倍）。这些模式也在RNA测序中得到确认。在其他方法中至少检测到以下显著的基因表达变化：在狗1中：ccr2上调，gfap和vegf-a下调（RT-qPCR分别为3.4倍和0.1倍，约0倍）；在狗2中：gfap和vegf-c上调（RT-qPCR分别为1.5倍和38.8倍）。

3.9 免疫组化
图13显示了AUS放置前、最大尿道梗阻时和最终活检时两狗中CCL2、CCR2、GFAP和VEGF阳性细胞的百分比。图13展示了CCL2、CCR2、GFAP和VEGF阳性细胞的百分比及其在膀胱尿路上皮、膀胱肌肉层和膀胱间质组织中的分布。左列：狗1；右列：狗2。Y轴：阳性细胞百分比；X轴：研究时间点。对于CCL2，在整个研究期间两狗的阳性细胞总数都很明显。在最终的活检中，我们观察到狗1的阳性细胞百分比有上升趋势，而狗2的阳性细胞百分比有所下降。关于不同的组织层，在两只狗的组织学检查中，阳性细胞主要分布在肌肉层和尿路上皮层。在两只狗中，阳性细胞百分比的主要变化都发生在尿路上皮层的最大梗阻期；狗1的阳性细胞百分比上升，而狗2的阳性细胞百分比下降。对于CCR2蛋白，整个研究过程中两只狗的阳性细胞总百分比都处于中等水平。在尿路上皮层，其在AUS（尿道支架）放置前升高，然后在最大梗阻期下降，在最终活检时降至零。在整个研究过程中，我们在两只狗的肌肉层几乎没有观察到阳性细胞，在间质层观察到阳性细胞百分比呈中等但稳定趋势。对于GFAP蛋白，两只狗在AUS放置前和狗1的最大梗阻期阳性细胞总百分比都较低，在其他时间点则为零。在狗1中，阳性细胞仅出现在间质层；而在狗2中，阳性细胞同时出现在尿路上皮层和间质层。对于VEGF蛋白，整个研究过程中两只狗的阳性细胞总百分比都处于中等水平。然而，在AUS放置前以及最终活检时，尿路上皮层的阳性细胞百分比都有所升高，而在最大梗阻期则降低。在肌肉层，阳性细胞百分比可以忽略不计，除非是在狗2的最终活检中。3.10 氧化应激状态 图14显示了两只狗不同氧化应激参数的测量结果。对于每个参数，上限和下限是根据之前在比格犬中报告的95%生理区间设定的[36]。图14. 根据研究阶段显示的两只狗的氧化应激参数。对于每个参数，实线和虚线分别表示健康比格犬中描述的上限和下限[37]。在整个研究过程中，两只狗的所有氧化应激参数值都在正常范围内，除了氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比值以及铜/锌比值在特定时间点超过了上限（图14）。在狗1中，整个研究过程中观察到异前列腺素和铜/锌比值有上升趋势（这是由于抗氧化剂锌的减少和促氧化剂铜的增加），同时维生素C逐渐减少。3.11 结果总结 对于两只狗，在梗阻期结束以及整个研究结束时，通过四种检测方法（尿动力学、组织学、分子生物学和氧化应激）观察到的主要方向性变化在表10中进行了总结。梗阻前期未包括在内，因为它被视为基线条件。表10. 总结表。Pdetth：逼尿肌阈值压力。IP：整合压力。增加（↑）或减少（↓）是相对于最大梗阻期（尿动力学）或梗阻前期（分子生物学研究）的情况。“升高”指的是95%生理区间上限[36]。4. 讨论 本初步研究的目标是描述由于AUS引起的尿道进行性梗阻导致的两只雄性狗的膀胱功能和结构变化，以及在其中一只狗解除梗阻并使用自体ADMSCs（自体间充质干细胞）后的变化。目的是创建与患有尿道梗阻的男性患者相似的变化情况，以便可能研究ADMSCs在恢复膀胱功能方面的作用。我们的结果具有描述性，因此应谨慎解释。结果表明，使用适当尺寸的AUS建立的犬类获得性慢性进行性尿道梗阻模型能够引发与严重受影响的人类患者相似的临床症状。然而，尽管在梗阻解除后仅有轻微的形态学改变和可逆的尿动力学变化，这种情况仍然发生了。值得注意的是，严重的排尿困难和明显的尿流受限阻止了尿道梗阻程度的进一步增加，因为这种进展会对两只狗造成伦理上不可接受的临床后果。本研究没有达到膀胱失代偿状态，两只狗在梗阻解除后都显示出了相似的恢复情况。因此，这项初步描述性研究未能确定自体干细胞给药对增强膀胱恢复的潜在效果。然而，在病理性的膀胱环境中，自体干细胞的准备和系统给药在一只狗中似乎是可行且耐受良好的，这与之前的研究报告一致[45]。4.1 功能研究 在尿道梗阻进展的过程中，两只狗的功能性尿动力学参数表现出相似的变化，除了腹压。在尿道阻力达到峰值时，狗1的腹压几乎没有下降，而狗2的腹压却升高，这表明两只狗对抗尿道损伤的方式不同。在患有BPH（良性前列腺增生）的男性中，腹压增加对尿流速率没有显著影响[46]。我们观察到在尿道梗阻期间两只狗的逼尿肌压力都有所增加，这是膀胱出口梗阻的有效迹象[4]。关于Pdetth（排尿开始时的逼尿肌压力），在两只狗中，当出现排尿困难时达到了最大值，这对应于最大程度的梗阻。此时，狗1的尿道阻力比梗阻前期（基线）高出200多倍，而狗2的尿道阻力则高出近100倍，同时尿流也降至最低水平。由于AUS的移除显著降低了尿道阻力，但未能使尿流恢复到梗阻前的水平，即使使用了基于干细胞的辅助治疗，两只狗都被认为存在膀胱收缩功能障碍。实际上，在患有BPH的男性中，通过手术治疗物理性地解除膀胱出口梗阻需要考虑到膀胱收缩状态，因为低收缩能力可能会降低术后临床结果[47]。由于膀胱收缩能力下降，排尿后残余尿量增加是尿道出口梗阻患者的常见现象[48]。然而，在本研究中，排尿后残余尿量在尿道梗阻期间增加，但在研究结束时降至基线水平以下。因此，无法用膀胱收缩功能障碍来解释AUS移除后两只狗仍观察到的中等尿流。也怀疑AUS之前的尿道部位存在纤维化。然而，由于UPP（尿道扩张器）移除后尿道压力没有持续升高，这一假设也被排除了。在最大尿道梗阻期，两只狗的膀胱顺应性都很低。膀胱顺应性是衡量膀胱膨胀能力的指标，它在膀胱出口梗阻时会降低[1]，说明需要较少的尿量就能使膀胱压力增加1 cmH2O。在本研究中，通过计算尿道阻力并观察狗的排尿行为来评估功能损伤。在男性中，排尿期间的压力-流速研究是确认和量化膀胱出口梗阻的金标准方法。通过在排尿期间测量最大尿流和相应的逼尿肌压力来进行评估。然后使用标准化图表比较压力和尿流之间的关系，以确定每个患者的状况[49,50]。尽管这些侵入性方法准确且一致，但往往会引起患者不适，因此提出了间接方法来评估功能损伤。例如，对于因膀胱出口梗阻而出现下尿道症状的患者，现在可以使用非侵入性测试来预测良性前列腺梗阻性疾病，并帮助指导治疗或进一步的侵入性诊断测试[51]。影像学检查，如MRI和超声波检查特别有用，因为可以评估多种参数来研究膀胱出口梗阻，如膀胱壁和膀胱位置、尿道及尿道周围的结构（如前列腺大小及其与膀胱的关系）等[52]。超声波检查膀胱壁厚度是一种非侵入性测量膀胱因出口梗阻而增厚的方法[53]。研究表明，在特定测量条件下，它与尿动力学参数呈正相关[54]。然而，由于方法学不一致（例如膀胱充盈方式、探头频率、测量位置等），不同研究之间的变异性较大[55]。在本研究中，我们使用标准化的膀胱充盈方法来进行可靠的超声波膀胱壁厚度测量。我们观察到在梗阻期结束时两只狗的膀胱壁厚度略有增加，但在狗2中，只有在梗阻解除后膀胱壁厚度才会下降。尽管本研究的性质是初步的，我们并未旨在进行与尿动力学参数的统计关联。4.2 结构研究 在本研究中，几乎未观察到支持尿道梗阻期间膀胱壁形态变化的结构变化。鉴于实验方案要求对每个膀胱进行大量活检以及对每个活检进行多次处理，在选择活检部位时特别小心，以确保样本大小合适且无瘢痕组织。然而，考虑到活检次数和犬类膀胱的大小，重复活检对形态和恢复的潜在影响应被视为一个混杂因素。在狗1中，从梗阻期结束就观察到肌肉束紊乱，以及AUS移除后的浆膜下结缔组织沉积。这些变化是否对AUS移除后功能值的持续改变有所影响尚不明确。在狗2中，结构变化也很微妙，包括在尿道梗阻早期（首次细菌分离前15天）出现的暂时性炎症反应、最大梗阻期的高血管状态以及肌肉束紊乱，以及研究结束时的尿路上皮下和浆膜下结缔组织增多。这两种狗之间的差异可能与研究过程中不同分子信号的表达有关。实际上，在比较选定标志物的RNA测序数据时，观察到两只狗之间的全局基因表达模式存在差异，以及从基因到蛋白质的不同表达水平之间的差异。然而，这些探索性结果仅基于两只狗，需要在更大样本量中进行进一步研究。在狗1中，关于mRNA定量，AUS移除后ccl2基因的表达增加。在我们的研究中，最终活检中也观察到CCL2蛋白水平的表达增加。组织学分析显示了结缔组织沉积，如Masson三色染色所示。先前已有报道指出CCL2及其受体CCR2参与促纤维化信号通路，与M2型巨噬细胞极化相关[56]，这可能表明CCL2在狗1观察到的结构变化中起了一定作用，尽管这仍然是一个推测。值得注意的是，狗1中CCL2免疫染色增加主要体现在肌肉层。类似的观察结果也在体外实验中得到证实，当时逼尿肌细胞经历了由静水压力升高诱发的氧化应激[17]。在第二只狗中，去除尿道梗阻（AUS）后，ccl2和hgf的mRNA水平显示出与第一只狗相似的模式，但幅度更大，因为这些基因的表达在最终活检中显著增加，分别为3.2倍和6.5倍，而第一只狗分别为2.1倍和1.4倍。然而，在第二只狗中，ccl2的mRNA表达与蛋白质表达的趋势相反，其免疫染色在整个研究过程中逐渐减少。实际上，在第二只狗的最终活检中，CCL2的免疫组化检测达到最低水平，这种减少与肌肉区域中CCL2表达的下降有关。这一模式与第一只狗的情况相反。因此，我们可以提出这样的假设：这种观察可能与在第二只狗去除AUS时施用的自体间充质干细胞（ADMSCs）所引起的转录后调控有关。事实上，在部分膀胱出口阻塞的大鼠中，已经报道干细胞可能会改变参与mRNA翻译的微RNA，从而与未处理的大鼠相比改善组织修复[57]。根据这一假设，第二只狗最终活检中hgf基因mRNA水平的增加（6.5倍变化）进一步支持了修复机制可能增强的趋势（第一只狗为1.4倍变化）。然而，仅观察到轻微的形态学修复证据，两只狗的最终活检都显示有结缔组织沉积，第二只狗有两层沉积物，而第一只狗只有一层。

在本研究中，两只狗在整个研究过程中GFAP的检测水平都非常低。GFAP是神经系统支持细胞的一种蛋白质。在外周神经系统中，它在轴突损伤后由施万细胞表达[8,58]。实际上，在尿道括约肌去神经化的大鼠模型中，已经报道了施万细胞修复相关表型标志物（如GFAP）的上调[59]。在本研究中，尿道部分阻塞并未导致膀胱失代偿，因为重塑过程有限。因此，没有发生神经损伤，且在阻塞期间GFAP基因的表达在两只狗中都受到了相似且适度的下调，GFAP蛋白表达也保持在较低水平。没有神经损伤可能解释了为什么没有观察到连续的逼尿肌活动减退和持续的纤维化[60,61]。

两只狗的逼尿肌平滑细胞的超微结构在整个研究过程中没有变化。更具体地说，我们没有观察到线粒体形状或密度的改变，而这种改变通常与男性膀胱出口阻塞有关[62]。事实上，已经证明膀胱出口阻塞后ROS（活性氧）的增加会导致线粒体脂质过氧化，进而对能量产生和逼尿肌收缩力产生负面影响[6]。由于缺氧和随后的缺血-再灌注事件是氧化应激的主要触发因素，并且通常与VEGF（血管内皮生长因子）的上调相关，我们也评估了VEGF的表达。然而，VEGF基因亚型的缺乏一致性调节以及VEGF蛋白表达的不稳定性并不支持存在明显的缺氧。此外，在本研究中，多项观察结果表明两只狗的氧化应激状态是平衡的，没有观察到线粒体结构的损伤，也没有脂质过氧化超过生理上限，也没有逼尿肌收缩力的受损。然而，在尿道部分阻塞的初期阶段，氧化型谷胱甘肽（一种由谷胱甘肽过氧化物酶形成并与有机过氧化物还原反应相关的内源性肽）的水平超过了生理上限，而在阻塞期结束后又降至生理范围内。去除AUS后，第一只狗的氧化型谷胱甘肽水平再次升高，而第二只狗则保持在生理范围内。我们的结果无法推断这一观察是否与第二只狗施用的ADMSCs有关。然而，可以假设干细胞具有通过旁分泌作用来平衡氧化应激状态的潜力，正如在膀胱缺血的啮齿动物模型中所提出的[63]。在我们的假设中，干细胞可能会通过增强谷胱甘肽的氧化还原机制来帮助减少氧化应激。

4.3. 限制
我们研究的主要限制是仅使用了两只狗。我们承认，治疗条件下缺乏重复实验使得我们无法确定观察结果是由随机变异还是真实的治疗效果引起的。未来的工作应该包括适当的重复实验来确认观察到的趋势的可靠性。这项研究旨在作为初步研究，以便在考虑对更多个体进行设计良好的对照研究之前进行。由于在狗中类似的模型较为罕见，尽管BPH（良性前列腺增生）可以在狗身上自然发生（而在啮齿动物中则不会），因此在任何进一步的广泛实验之前验证这一提出的犬类模型是至关重要的。因此，这项研究设计为对每只狗进行纵向观察。此外，我们还想在可能对多只狗造成严重膀胱损伤之前，测试再生治疗的安全性和可行性，以确保这种实验在伦理上是可接受的。此外，使用同窝的狗是为了通过利用它们相似的遗传背景来最小化个体间的变异。

第二个限制是反复采集膀胱活检样本，这可能成为一个混淆因素。尽管在方案开发阶段预料到了这个问题，并且在每个采样时间点都采取了特别的 cuidado（注意），但这仍然可能在结果中引入了一些偏差。目前，该模型不能直接应用于人类，需要进一步优化以更好地模拟人类的病理生理学。尽管两只狗的尿道部分阻塞持续时间较长（第一只狗为1.5年，第二只狗为2.5年），但我们的研究中并未观察到明显的功能和病理结构改变，这与男性[64]和啮齿动物[65]中的自然情况相反。此外，一些可能有助于更准确描述潜在分子机制的数据没有被收集，例如HGF的免疫组化分析、显示免疫组化阳性的细胞群体的精确鉴定，或全血谷胱甘肽过氧化物酶活性的测量。在男性中，慢性膀胱出口阻塞会导致膀胱组织的重塑，从而引发严重的功能障碍并加重初始的阻塞症状。在失代偿阶段，排尿功能障碍会进一步降低生活质量[4]。应该认识到，动物模型在解释疾病、症状和功能障碍之间的复杂关系方面存在固有的局限性[40]，几个假设可以解释为什么我们的犬类模型仅观察到可逆的变化。实际上，在男性中，代偿期的持续时间取决于多种因素，如患者出现下尿路症状时的年龄、阻塞疾病的严重程度和性质，以及是否存在血管或代谢性疾病等加重因素[66]。在本研究中，两只狗在尿道部分阻塞开始时都是年轻且健康的，这为进一步优化模型提供了机会。

另一个限制是跨远程测量会话和研究阶段记录的“有效”排尿次数的变化，这限制了它们之间的准确比较。去除AUS后，两只狗都经历了一段持续数周的时间，在此期间正常排尿与不同程度的尿失禁交替出现。这包括排尿前后不自觉的尿液泄漏，以及尿流的分叉和间歇性停顿，而不是单一的、连续的直线尿流。在这些时期，只有正常排尿被纳入分析，导致远程测量数据的数量减少。远程尿动力学可能是一个限制因素，因为设备可能会随时间失去准确性。实际上，在本研究中的狗身上观察到了膀胱导管内的沉积物。这种观察已被报道，并不一定影响数据的准确性[67]。此外，远程测量被认为是泌尿学研究中的有价值工具，在狗身上具有良好的重复性，尤其是在夜间获得的测量结果[68]，而这正是我们研究的情况，因为大多数记录是在晚上进行的。当与呋塞米诱导的利尿作用结合使用时，它可以产生可重复的排尿模式，且不会影响尿动力学参数。事实上，已经证明呋塞米的剂量超过我们研究中使用的四倍时，可以显著增加排尿频率和每次排尿的体积，而不会影响排尿压力[69]。然而，不能排除长期使用呋塞米对我们结果的潜在影响。

关于mRNA表达，尽管我们使用的方法（RT-qPCR和RNA测序）得到的绝对值有所不同，但ccl2、ccr2、gfap和vegf-b基因在两只狗中的调节方向是一致的，而ccl2、hgf、gfap和vegf-c基因在两只狗中的调节方向也是一致的。两种方法之间的差异归因于RT-qPCR和RNA测序中应用的不同标准化方法。使用额外的内参基因（如3-磷酸甘油醛脱氢酶）可能有助于加强我们的分析。

5. 结论
在这项初步研究中，我们的第一个假设被否定了，因为我们没有观察到由膀胱逼尿肌弥漫性纤维化引起的膀胱失代偿，这与男性慢性膀胱出口阻塞的情况相当。因此，目前提出的模型不能被验证为尿道部分阻塞的犬类模型。相应地，我们的第二个假设也无法得到验证，因为功能和结构变化的可逆性主要归因于阻塞的解除（AUS的去除）。

自体ADMSCs在人类和兽医医学中都是伦理上可接受的再生疗法。此外，尽可能使用清醒状态下进行尿动力学的随访应该是首选方法，因为它可以在更接近病理生理状态的条件下进行研究。最后，我们展示了在一只狗身上安全可行地进行了自体ADMSCs的系统给药。在对照研究中进一步完善该模型可能有助于更好地评估本研究中的观察结果。实际上，干细胞给药是否通过增强谷胱甘肽的氧化还原缓冲系统帮助平衡了氧化应激状态，并通过减少CCL2蛋白合成干扰了CCL2信号传导，仍有待证实。需要进一步的研究来优化这个犬类膀胱出口阻塞模型，并在明确和持久地识别膀胱壁内的变化之前，为目标验证针对人类膀胱修复的非侵入性再生医学方法奠定基础。