精油混合物与抗坏血酸补充剂可改善受热应激影响的雄性兔子的表现、精液品质、氧化还原平衡及肠道健康 海法·阿里·阿尔克塔尼（Haifa Ali Alqhtani）， 胡达·A·阿尔克塔尼（Huda A. Alqahtani）， 艾哈迈德·M·埃尔巴兹（Ahmed M. Elbaz）， 艾哈迈德·阿特亚（Ahmed Ateya）， 阿卜杜勒-拉赫曼·Y·阿卜杜勒哈迪（AbdelRahman Y. Abdelhady）， 法特玛·艾哈迈德·萨菲（Fatmah Ahmed Safhi）， 穆罕默德·阿尔-拉希德（Mohammed Al-Rasheed）， 穆罕默德·H·穆罕默德（Mahmoud H. Mohamed）， 瓦埃勒·M·埃尔-迪布（Wael M. El-Deeb）， 穆罕默德·马尔佐克（Mohamed Marzok） + 其他2位作者

《Veterinary Sciences》：Essential Oil Blend and Ascorbic Acid Supplementation Improves Performance, Semen Characteristics, Redox Balance, and Intestinal Integrity in Heat-Stressed Male Rabbits Haifa Ali Alqhtani, Huda A. Alqahtani, Ahmed M. Elbaz, Ahmed Ateya, AbdelRahman Y. Abdelhady, Fatmah Ahmed Safhi, Mohammed Al-Rasheed, Mahmoud H. Mohamed, Wael M. El-Deeb and Mohamed Marzok + 2 authors

　　**简单总结**
尽管在兔类生产技术方面取得了显著进展，旨在缓解热应激，但它仍然对养兔者来说是一个主要的环境挑战。暴露在高温下会破坏生理平衡并引发氧化应激，这可能对生长表现、免疫功能、肠道健康和繁殖效率产生负面影响。因此，饮食策略作为缓解热应激不良影响的潜在方法受到了越来越多的关注。本研究调查了在热应激下雄性兔子中添加精油和抗坏血酸混合物的潜在益处。具体来说，我们评估了这种营养策略是否可以减轻氧化损伤并影响生产性和生理反应。研究了补充剂对生长表现、营养素消化率、肠道微生物群组成、免疫反应、抗氧化状态和精子质量的影响。研究结果表明，精油混合物和抗坏血酸的共同抗氧化和免疫调节作用可能有助于改善热应激下雄性兔子的健康状况、生理稳定性和繁殖表现。

**摘要**
本研究旨在探讨在热应激下雄性兔子中添加精油混合物和抗坏血酸对表现、精子特征、抗氧化状态、肠道微生物群、免疫力和基因表达的影响。140只6个月大的新西兰白公兔被随机分配到四个饮食组：对照组（CON）仅接受基础饲料；精油混合物组（EOB，200 mg/kg）；抗坏血酸组（ASA，1000 mg/kg）；以及精油和抗坏血酸混合组（MAO）。实验持续了8周。MAO混合物通过增强应激标志物（如葡萄糖和HSP70水平下降，三碘甲状腺原氨酸（T3）水平上升）来帮助兔子耐受热应激。此外，喂食MAO混合物的兔子体重、 carcass weight 和营养素消化率增加，死亡率下降。同时，MAO混合物还提高了精子的密度和体积，以及精子的运动能力和正常性。此外，MAO混合物补充剂降低了血浆中的胆固醇、甘油三酯、AST、尿素和肌酐水平，同时提高了HDL和总蛋白水平。MAO混合物还增加了血浆中的SOD和GPx水平，以及精液中的TAC和GSH水平。此外，它提高了IgA、IgG和IL-10的水平，同时降低了IL-6和TNF-α的水平。MAO混合物的添加减少了C. perfringens和大肠杆菌的数量，并增强了MUC-2、CAT-1和CLDN-1基因的表达。结合使用精油混合物和抗坏血酸可能有助于改善热应激下雄性兔子的表现、精子质量、免疫反应、抗氧化能力和肠道健康。

**1. 引言**
兔类生产是粮食安全、可持续农业实践和收入来源的重要途径，尤其是在发展中国家和资源有限的地区[1]。根据联合国粮食及农业组织（FAO）的数据，全球兔肉产量在过去几十年中稳步增长。兔子以其肉类质量、快速生长、高效的饲料利用、早熟和高繁殖率而受到青睐[2]。此外，兔子提供的动物蛋白质量高，脂肪和胆固醇含量低，脂肪酸丰富，这对注重健康的消费者来说具有吸引力[3]。在发展中国家，养兔业在改善农村生活方面发挥着关键作用，因为其资本投入相对较低，可以有效地整合到小型和家庭生产系统中，并适应各种环境条件[4]。
兔子在18–21°C的适中温度范围内表现出最佳的生理表现，此时热调节所需的能量消耗最低，从而支持最佳的生产[5]。兔子的正常体温通常在37.7至39.0°C之间[6,7]，尽管这可能因环境条件、品种差异和测量方法而有所不同[8]。不过，兔类的集约化经济生产受到许多因素的影响，包括环境、营养和疾病相关因素[9]。夏季，热应激会导致兔子体内的一系列生理和免疫反应变化，对生长表现、繁殖特性和肉質产生负面影响[10]，尤其是在雄性兔子中。此外，经过基因改良的雄性兔子生长迅速，代谢率更高，汗腺较少，毛发更密集，因此对压力更敏感[9]。热应激下的兔子会改变生理反应，下丘脑中的甲状腺激素水平显著下降[8]，以及促甲状腺激素（ACTH）分泌增加[11]。这些变化导致代谢率、产热量和精子质量的显著下降[9]。热应激最显著的负面影响之一是氧化应激，自由基活性增加导致脂质过氧化，从而影响精子的质量、运动能力和生育能力[12]。由此可见，热应激对雄性兔子的繁殖表现有负面影响，导致睾丸萎缩、死精子和畸形精子的产生增加以及精子数量减少[12]。因此，人们越来越关注饲料添加剂作为减少热应激损害的有效手段[13,14,15]，包括使用益生菌、维生素和天然抗氧化剂[16]。
抗坏血酸（维生素C）已被证明是一种有效的饲料添加剂，能够清除自由基并支持氧化稳定性[17]。它通过参与氧化还原反应具有抗应激和抗氧化作用[18]。维生素C还通过消除热应激期间细胞过氧化产生的自由基来保护组织免受氧化损伤[17,19]。许多研究表明，在水中或饲料中添加抗坏血酸可以改善生长表现、免疫力和抗氧化能力[17]。
药用和芳香植物具有多种促进人类和动物健康与表现的特性[20,21]。由于芳香植物及其产品含有丰富的天然成分，具有免疫调节、抗氧化、抗菌、抗炎和促进生长的作用，因此越来越多地被用于家禽饲料中[22,23]。它们的优点包括有效的抗热应激效果和作为抗生素替代品的潜力[24]。在兔类生产中，这些植物添加剂已被广泛研究其改善生长表现、增强免疫反应和支持正常条件下肠道健康的能力[25]；然而，关于它们在热应激下的效果的研究有限。先前研究表明，柠檬油和大蒜油在减轻热应激的危害方面有效[26]，可以减少病原体和自由基，并调节基因表达[27]。柠檬精油主要由柠檬烯、β-蒎烯和γ-萜烯组成[28]，而大蒜精油富含有机硫化合物，特别是大蒜素及其衍生物[29]，这些成分赋予了它生物学特性。因此，使用药用和芳香植物代表了一种有前景的营养策略，可促进可持续生产系统中的兔子健康和生产力。
基于先前关于精油和抗坏血酸积极效果的研究，我们假设将它们作为饮食补充剂添加到热应激下的雄性兔子中可以改善表现、饲料利用率、抗氧化能力和精子特征。然而，关于这些添加剂在热应激条件下的联合效果的信息有限。因此，本研究旨在通过提供新的见解来填补这一空白，探讨它们的协同作用和作用机制。本研究旨在评估添加精油混合物、抗坏血酸及其混合物对热应激下雄性兔子的表现、精子特征、免疫力、氧化状态和肠道健康的影响。

**2. 材料与方法**
2.1. 饲料、兔子和管理
本研究在埃及的沙漠研究中心进行。所有关于维护实验动物安全和福利的指示（协议编号5-2026-54）均得到了艾因沙姆斯大学农业学院的批准。在整个实验期间，对兔子的健康和福利进行了监测。实验于2025年5月至6月在埃及沙漠研究中心下属的拉斯萨德尔研究站进行（地址：https://maps.app.goo.gl/GemxYXTbLRYaJRKbA，2025年1月15日访问）。140只6个月大的新西兰白公兔被放置在单独的笼子（40 × 60 × 45 cm）中，并随机分配到四个实验组进行为期两周的适应期。实验开始时，所有兔子都处于良好健康状态，并且至少在实验前两周内未接受任何治疗、抗生素或生长促进补充剂。它们被提供受控的环境条件和标准光照制度以达到稳定的生理状态。每个组由35只雄性兔子组成（平均初始体重2951 ± 11.3 g），重复7次。实验期间每天提供无限量的颗粒饲料和自动供水。实验组包括：对照组（CON）仅接受基础饲料；抗坏血酸组（ASA）接受添加了1000 mg/kg抗坏血酸的标准饲料；精油混合物组（EOB）接受添加了200 mg/kg精油混合物（柠檬油和大蒜油）的标准饲料；以及混合物组（MAO）接受添加了1000 mg/kg抗坏血酸和200 mg/kg精油混合物的标准饲料。实验兔子可以自由获取颗粒饲料和新鲜饮用水，所提供饲料符合国家研究委员会的的营养要求[30]，详见表1。每天仔细监测兔子的福利和健康状况，包括饲料和水的摄入量、一般行为、姿势、梳理行为以及任何疾病或压力的迹象。环境参数（如环境温度和湿度）也持续监测。任何出现疾病迹象的兔子都会根据标准兽医护理程序进行及时评估和管理，确保整个研究过程中的伦理治疗。兔子被放置在通风良好的设施中，环境温度和相对湿度每天记录两次（早晨和晚上），以确保兔子的福利。环境温度为28 ± 3.7°C，相对湿度为56 ± 2.4%。通过自然通风和天花板风扇保证空气流通，使整个设施内的空气流通均匀。为了评估热应激，记录了中午高峰期（1:00–2:00 p.m.）的测量数据，以确定暴露程度，因为这段时间代表动物面临的最大环境压力，从而计算温度-湿度指数（THI）[31]以评估兔子受到的压力程度。此外，每天监测实验动物的整体健康状况、行为、进食活动和压力迹象。没有观察到异常的行为反应或对补充剂的厌恶迹象，尽管由于高温，有些兔子在下午出现了压力症状。人工荧光灯提供的光照比例为16L:8D，笼子处的光照强度约为150 lux。对于生长表现参数，每个处理组的重复次数（n = 7）被视为实验单位。对于基于个体的测量（包括血液生化参数、尸体特征、微生物计数和基因表达分析），单个兔子被视为实验单位。

**2.2. 实验补充剂的制备**
L-抗坏血酸（99%）由中国江苏省南京市江宁区的南京嘉意圣威化工有限公司提供。柠檬油和大蒜油从埃及开罗的CAP PHARM公司购买，该公司专门从事天然和化妆品油的提取。精油以纯形式使用，未添加任何载体，并按1:1的比例（柠檬油：大蒜油）混合，然后按之前研究描述的比例（200 mg/kg）加入饲料中[26]。然而，没有进行任何独立的分析（如GC-MS）来标准化批次；相反，采用了制造商提供的化学成分。所使用的精油是来自柠檬（Citrus limon L., Rutaceae）和大蒜（Allium sativum L., Amaryllaceae）的商业产品。根据制造商的规格，柠檬精油是通过冷压从柠檬皮中提取的。其特征是含有高比例的单萜类化合物，尤其是柠檬烯（65–75%），以及次要成分如β-蒎烯（10.7%）、γ-蒎烯（9.3%）、α-蒎烯（2.1%）和蒎脑烯（1.6%），以及其他微量挥发性化合物。另一方面，大蒜精油是通过蒸汽蒸馏从大蒜瓣中提取的，富含有机硫化合物，包括二烯丙基二硫化物（47.5%）、二烯丙基三硫化物（31.7%）、烯丙基甲基三硫化物（8.6%）、二烯丙基硫化物（4.3%）以及微量其他挥发性化合物。这些提取方法通常用于保持生物活性成分并确保挥发性化合物的稳定性。精油和抗坏血酸通过将它们与少量基础饲料混合后直接加入饲料中，然后在水平搅拌器的均匀混合条件下将其混合到整个饲料中。然而，在混合精油时没有使用载体，以避免可能与载体本身相关的潜在混淆效应，这些效应可能会影响营养吸收或肠道功能。此外，在整个实验过程中仔细监测了动物的进食行为和整体进食活动，确保没有出现饲料选择或拒绝的情况。

2.3. 性能指标
每天的早晨通过计数呼吸次数来记录呼吸频率（RR，呼吸/分钟）。通过将临床数字温度计插入直肠来测量每组十只兔子的直肠温度（RT）。在实验开始前（初始体重，IBW）和每周喂食前（最终体重，FBW）对兔子进行称重，以评估饮食处理、压力和饲料摄入量的影响。每周饲料摄入量（FI）是通过从每周提供的总饲料量中减去未食用的饲料来计算的，实验期间的平均每日饲料摄入量（g/天）也是如此。每组取五只兔子（总共20只）进行屠宰，以测量尸体特征和血液指标。屠宰方法是颈部脱位后放血，符合人道的兔子安乐死指南。所有程序都在兽医的监督下进行，以确保最小程度的压力和痛苦，符合机构和国际动物福利规定。测量了尸体重量、肝脏、肾脏、肺、心脏和腹部脂肪。实验结束时从每组随机取五只兔子，并将它们放在单独的消化笼子中。兔子被饲养24小时以适应环境，然后进行为期5天的粪便收集，每天收集三次粪便。在实验期间计算饲料摄入量。粪便干燥后研磨，并储存在-10°C的聚乙烯袋中。根据AOAC [32]方法分析了粪便和饲料中的干物质、粗纤维、粗蛋白、醚提取物和无氮提取物。如Abdel Moneim等人[15]所述，使用市售试剂盒（南京建城生物工程研究所）在收集的肠道样本中测量了消化酶活性（纤维素酶、胰蛋白酶和淀粉酶）。

2.4. 血液化学指标
实验结束时，屠宰五只雄性兔子以收集血液样本，用于评估脂质谱图、免疫反应和氧化状态。抽取血液样本后，离心血浆，并将其送往实验室进行必要的分析。使用专用商业试剂盒（Bio-diagnostics，吉萨，埃及）测量抗氧化酶活性，包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）和丙二醛（MDA）。此外，通过测量免疫球蛋白水平（IgG、IgM和IgA）和炎症相关细胞因子（如肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素6 (IL-6) 和白细胞介素10 (IL-10)）来检测免疫和炎症反应，如El-Ratel等人[18]所述。用于炎症生物标志物的ELISA试剂盒来自MyBioSource（圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）。根据Elbaz等人[31]的指示，测试了胆固醇、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、甘油三酯、葡萄糖、总蛋白、白蛋白、肌酐、尿素、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）的浓度，作为肝脏和肾脏功能的生化指标。此外，如Ibrahim等人[33]所述，使用西门子医疗保健（慕尼黑，德国）的放射免疫测定（RIA）试剂盒检测了三碘甲状腺原氨酸（T3）作为甲状腺功能的指标，并按照制造商的说明进行分析。

2.5. 精液收集与评估
在整个实验期间，每周两次（星期日和星期三上午9:00）从每组十只兔子中收集精液，以评估精液特征。在整个实验期间重复从同一动物身上收集精液。为了避免伪重复，将每只动物的重复测量结果平均后用于统计分析。此外，将两只兔子的精液合并以获得足够的样本量用于实验室分析；因此，每个合并的精液样本代表一个用于精液质量评估的实验单位。收集过程在相同的位置和时间进行，以确保样本的均匀性。收集期结束后，雄性兔子接受训练使用人工阴道收集精液。收集后立即使用量筒记录每次射精的体积（去除胶状物质后），并评估精子密度、前进运动能力和存活率，如Huang等人[12]所述。此外，使用pH试纸（Merck，达姆施塔特，德国）在5毫升精液中测定pH值。将精液储存在水浴（37°C）中后运输到实验室，注意防止直接光照和任何热冲击。使用相差显微镜，在用伊红（5%）染色样品后确定存活率、正常性和异常情况的百分比，如Imbabi等人[34]所述。

2.6. 精浆
精液收集后，将其以700× g的速度离心20分钟以获得精浆。然后立即将其送往-20°C的储藏罐中进行氧化应激分析。使用商业试剂盒（Bio-diagnostics，吉萨，埃及）根据制造商的说明测定丙二醛（MDA）含量、还原型谷胱甘肽（GSH）和总抗氧化能力（TAC），如Hosny等人[35]所述。此外，使用商业ELISA试剂盒（Enzyme-linked，上海，中国）测定热休克蛋白70（HSP70），如Imbabi等人[34]所述。

2.7. 盲肠微生物计数
在屠宰过程中从20只实验兔子（每组5只）中收集五克盲肠内容物，放入无菌袋中，并在-20°C下储存直至微生物计数分析。在分析开始时，在无菌蛋白胨溶液中制备必要的10%（w/v）稀释液，然后按照Abdel-Moneim [36] 和 Elbaz [37] 的描述，在适当的琼脂上依次稀释并培养每个目标微生物（表2）。目标微生物的数量表示为每克盲肠内容物的log10菌落形成单位。

2.8. 基因分析
根据制造商的说明，使用QIAamp RNeasy Mini Kit（Qiagen，希伦，德国）从每组的五只冷冻盲肠组织中提取总RNA。大约30毫克的组织在裂解缓冲液中均质化，并使用硅胶膜旋转柱进行RNA纯化。使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Scientific Inc., Waltham, MA, USA）评估RNA浓度和纯度，A260/A280比率在1.8到2.0之间的样本用于下游分析。合成互补DNA（cDNA），并使用QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit（Qiagen，希伦，德国）进行定量实时PCR（qRT-PCR）。每个反应（总体积20 μL）包含SYBR Green-master mix、特异性正向和反向引物（各0.5 μM）、RNA模板、逆转录酶和无核酸酶的水。扩增在以下循环条件下进行：50°C下逆转录30分钟，95°C下初始变性15分钟，然后40个循环：94°C下变性15秒，55–60°C下退火30秒，72°C下延伸30秒。评估了编码营养转运蛋白和紧密连接蛋白的基因（包括阳离子氨基酸转运蛋白-1 (CAT-1)、Claudin-1 (CLDN-1) 和Mucin-2 (MUC-2)）以及促炎细胞因子白细胞介素-1β (IL-1β) 和干扰素-γ (IFN-γ) 的mRNA表达水平。通过扩增后的熔解曲线分析确认扩增的特异性和没有引物二聚体的形成。所有研究基因的引物序列见表3。正向（5′ → 3′）和反向（3′ → 5′）引物是基于从NCBI GenBank数据库获得的已发表的兔子基因序列设计的，并由Qiagen（德国）商业合成。使用BLAST分析2.17.0验证引物的特异性，以确保基因特异性扩增。使用GAPDH（内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶）作为内部对照，校准目标基因的相对表达水平。使用2?ΔΔCt技术计算相对基因表达水平[41]。

2.9. 统计分析
使用SPSS软件（版本19.0；SPSS Inc., 芝加哥，IL, USA）中的通用线性模型（GLM）算法，根据随机完全设计进行单因素方差分析（ANOVA）。实验单位根据测量方式不同而变化：生长性能参数的重复次数，其他特征的个别兔子，而精液分析的合并精液样本（每个样本两只兔子），并在分析前对每个动物的重复测量值进行平均。使用Tukey的事后测试进行多重比较，以评估CON组与其他实验组之间的差异。通过将联合处理的平均值与单个处理的加性效应（平均比较）进行比较，根据相对于组变异性的偏差方向和大小解释差异（标准误差）。使用Shapiro–Wilk检验评估正态性和方差同质性。差异在p < 0.05时被认为是统计学上的显著。数据以平均值±标准差的形式呈现。数据使用以下通用线性模型进行分析：Yij = μ + Ti + eij，其中Yij表示因变量的观察值，μ表示总体平均值，Ti表示第i个饮食处理的固定效应（i = 1–4），eij表示与每次观察相关的随机误差，假设其独立且呈正态分布。

3. 结果
3.1. 体温调节反应
图1显示了兔子所受的热应激程度。热应激指数（THI）显著增加，范围在28.7至31.2°C之间，表明实验中的兔子受到了热应激。此外，呼吸频率（RR，呼吸/分钟）很高，范围在80至109次/分钟之间。然而，直肠温度（RT）在37.8至39.2°C之间。图1. 兔子的热应激指标：热应激指数（（A），THI），呼吸频率（（B），RR），以及直肠温度（（B），RT）。

3.2. 生长和尸体特征
表4总结了抗坏血酸和精油混合物对热应激雄性兔子的生长性能指标和尸体特征的影响。接受联合处理（MAO）的兔子与对照组相比，最终体重显著增加（p < 0.01），其值与EOB组和ASA组观察到的值相当，表明组合处理没有加性效应。此外，MAO处理组的死亡率比其他热应激组降低了1.4–3.0%。此外，接受ASA、EOB和MAO处理的组的尸体重量显著增加（p < 0.01）。有趣的是，补充EOB和MAO的组显示出最高的尸体重量。尽管实验添加物对肾脏、心脏和肺部没有影响（p ≥ 0.05），但喂食ASA、EOB和MAO的兔子的相对肝脏重量高于对照组（p < 0.05）。此外，喂食EOB和MAO的兔子腹部脂肪的相对重量低于ASA和对照组（p < 0.05）；然而，在EOB和MAO处理组中这一比例更低。这些发现表明，单独使用精油（EOB）或与抗坏血酸（MAO）结合使用，对胴体特征产生了显著影响。表4显示了抗坏血酸和精油混合物对雄性兔子生长和胴体指数的影响。表5展示了抗坏血酸和精油混合物补充剂对热应激兔子消化性能的影响。与ASA和对照组相比，EOB和MAO处理组的胰蛋白酶（p < 0.01）和纤维素酶（p = 0.013）分泌增加；然而，淀粉酶的分泌没有变化。与ASA、EOB和CON组相比，MAO处理组的干物质消化率提高（p < 0.01），表明其具有额外的改善效果（可能的协同作用）。此外，EOB、ASA和MAO组的粗蛋白消化率也有所提高（p < 0.05），但EOB和MAO处理组的粗纤维消化率略有增加（p < 0.05）。尽管如此，各组在非纤维有机物和醚提取物的消化率上没有差异（p ≥ 0.05）。表5还显示了抗坏血酸和精油混合物对雄性兔子消化酶活性和消化率的影响。表6展示了抗坏血酸和精油混合物补充剂对热应激兔子血液和精液血浆抗氧化稳定性的影响。虽然EOB、MAO和ASA组的MDA水平低于CON组（p < 0.01），但SOD（p < 0.01）和GPx（p = 0.004）酶活性在这些组中高于对照组。有趣的是，组合治疗（MAO）在热应激条件下表现出比单独使用EOB或ASA更强的抗氧化效果。表7和图2A-C展示了抗坏血酸和精油混合物补充剂对热应激兔子生化标志物（脂质谱、肝肾功能和应激指数）的影响。实验处理组之间的脂质谱有显著变化，HDL水平升高（p < 0.05），而胆固醇（p < 0.01）和甘油三酯（p < 0.05）水平降低。此外，EOB、MAO和ASA组的尿素、肌酐和AST水平降低（p < 0.05）。EOB和MAO处理组的总蛋白浓度也高于CON和ASA组。同样，实验补充剂对应激标志物也有积极影响。EOB和MAO处理组的葡萄糖水平降低（p < 0.05），热休克蛋白70（HSP70）水平也降低（p < 0.05）。同时，EOB、MAO和ASA组的T3水平升高（p < 0.05），其中MAO组的水平最高。LDL、ALB和ALT水平不受实验补充剂的影响（p ≥ 0.05）。然而，结果显示该化合物在蛋白质代谢和应激调节方面具有协同作用，但在改善脂质代谢方面未见这种效果。图3A-C和图4A-C展示了添加抗坏血酸和精油混合物对免疫反应（包括免疫细胞因子和免疫球蛋白）的影响。EOB和MAO处理组的IgA水平较高（p < 0.05），而IgG水平较高（p < 0.01）。相反，EOB和MAO处理组的IgM水平也较高（p < 0.05）。此外，EOB、MAO和ASA组的IL-10水平高于对照组。另外，EOB、MAO和ASA组的IL-6和TNF-α水平降低（p < 0.05），尤其是在MAO处理组中观察到了显著降低。值得注意的是，组合治疗（MAO）在IL-6和IL-10方面表现出更强的效果。表8显示，抗坏血酸和精油混合物改善了雄性兔子的精子质量。抗坏血酸和精油混合物或它们的混合物提高了雄性兔子的精子密度、精液体积、精子运动能力和精子活力，同时降低了精子异常率。EOB和MAO处理组的精液pH值也较高。值得注意的是，接受MAO组合治疗的兔子在精子密度、精液体积、精子运动能力和精子活力方面表现出最佳结果，表明该组合对精子质量具有协同作用。表9显示，抗坏血酸和精油混合物补充剂对热应激兔子的肠道微生物群有强烈调节作用。EOB和MAO处理组的C. perfringens数量低于其他组，而喂食ASA、EOB和MAO的兔子的大肠杆菌数量也低于对照组。此外，EOB和MAO处理组的乳酸菌数量较高。T细菌和肠球菌的数量不受实验处理的影响。这表明，与单独添加相比，组合处理对微生物数量没有额外的影响。表5A-E表明，抗坏血酸和精油混合物补充剂影响了基因表达。饮食处理上调了MUC-2、CAT-1和CLDN-1基因的表达。MAO处理组的MUC-2和CAT-1基因表达最高（p < 0.01），而CLDN-1基因的表达在MAO和EOB处理组中最高（p < 0.05）。此外，IFN-γ和IL-1β基因的表达在MAO和EOB处理组中降低。这些结果表明，组合处理对MUC-2、CAT-1和IFN-γ基因的表达具有更强的调节作用。尽管越来越多的研究关注寻找有效策略来减少热应激损伤，但养兔者仍面临挑战[10,11]。我们的研究数据支持这一点，表明兔子因呼吸频率增加（RRs）以及温度和湿度指数（THI）升高而经历热应激。研究表明，使用营养补充剂可以有效缓解热应激的负面影响[13,14,18,19]。因此，本研究调查了抗坏血酸和精油混合物的饮食组合对生理表现和整体健康的支持作用。结果表明，抗坏血酸和精油混合物的饮食补充剂有效缓解了热应激对兔子的不利影响，表现为生长性能、免疫反应、氧化状态、肠道健康和精子质量的改善。当前的研究结果表明，抗坏血酸和精油混合物的饮食补充剂有效减轻了热应激对兔子的不利影响，表现为生长性能和胴体质量的提高。这种改善可能归因于这些化合物作为抗氧化剂和抗炎剂的作用，以及精油作为抗菌剂的作用。然而，其他研究并未显示补充剂与对照组之间的差异，这可能是由于精油类型、纯度、剂量和形式的差异所致。尽管如此，许多报告表明抗坏血酸补充剂具有积极作用，如中和自由基、减轻应激引起的炎症、保护细胞膜，从而维持肠道和免疫系统的结构，促进蛋白质、碳水化合物和脂肪的代谢，从而改善营养吸收[19]。同时，摄入精油通过多种机制提高热应激下的生产性能，包括增强代谢适应、改变微生物组成[21,24]和免疫调节[27]，以及促进消化酶的分泌[22,31]。此外，本研究发现，这种混合物的添加导致热应激兔子的相对肝体重增加和腹部脂肪积累减少，Elbaz等人也有类似观察[31]。然而，其他报告显示，在饲料中添加精油并未影响腹部、肝脏、淋巴器官或砂囊中的脂肪百分比[45,46,47]。不同研究中对于添加的精油反应的差异可以归因于多种因素，包括健康状况、环境条件、饲料组成以及添加的精油的类型和剂量[45,48]。在本研究中，热应激下兔子的肝脏重量有所改善，这可以通过营养补充在应激暴露期间增强抗氧化防御系统的效果来解释，从而减少活性氧并增加内部氧化酶[19,49]，并减少氧化损伤，这可能有助于促进肠道和肝脏功能的稳定性。因此，这些结果表明，精油和抗坏血酸是促进生长和胴体特性改善的主要因素，而它们的组合能够在热应激期间维持这些效果，而不会进一步增强。

与观察到的生长表现一致，本研究的结果表明，抗坏血酸和精油混合物的联合补充可能有助于增强消化功能，这体现在营养物质消化能力的提高和消化酶生成的刺激上。同样，许多报告指出，抗坏血酸和精油补充剂对营养物质消化和消化酶分泌有积极影响[17,37]。抗坏血酸对消化生理的增强作用可能归因于其减少细胞氧化损伤和稳定细胞膜的作用，从而保持肠绒毛的完整性和表面积[50,51]，从而提高营养吸收。同时，精油通过其生物活性化合物的作用被证明能够促进胆汁流动并增加胰酶分泌[31,52]，从而改善营养消化。此外，这些化合物的抗菌特性有助于调节肠道微生物群[52]，减少肠道炎症[24]，并提高营养利用效率。高温还会破坏兔子的脂肪代谢，导致脂肪积累[8]，这与我们的发现一致。同时，抗坏血酸和精油的补充可能有助于调节热应激下兔子的脂肪代谢，从而减少腹部脂肪。总体而言，这些结果表明，组合组表现出更高的消化效率，表明精油和抗坏血酸之间存在协同作用，在本研究的条件下超过了单独使用任一成分的效果。

热应激会破坏氧化-还原平衡，大量活性氧（ROS）会释放到兔子的血液和精液中，随后发生脂质过氧化，这会损害细胞成分并负面影响生理性能和精液质量[8,9,12,53]。抗氧化酶具有高氧化活性，能够消除过氧化氢和氧离子，是第一道防线[2,13,17]，通过体内协同作用防止细胞损伤并维持生理功能。在这种情况下，本研究的结果显示，在饮食中添加抗坏血酸和精油混合物表现出抗氧化效果，表现为血液中的SOD和GPx水平升高，精液中的TAC和GSH水平升高，以及血浆和精液中MDA水平显著降低，这与许多先前的报告一致[24,26,31,34]。抗坏血酸参与清除体内细胞过氧化产生的自由基[46,54]，从而保护组织细胞免受氧化损伤[55,56]。这一点得到了MDA水平降低的支持，表明膜脂质氧化减少和氧化还原平衡得到改善。此外，精油通过其活性化合物的作用直接改善了热应激兔子的氧化状态，包括直接清除活性氧和羟基自由基[8]，并通过Nrf2基因信号通路激活细胞信号通路和内源抗氧化酶[59,60]，从而减少脂质过氧化。氧化状态的结果支持了这种组合补充在两种成分之间产生协同作用的观点，比单独使用任何一种成分更有效地改善了热应激条件下的氧化还原平衡。

热应激引起的氧化应力会导致脂肪氧化增加[57]，并通过增加自由基的产生而导致肝脏和肾脏功能受损[37]以及兔子内部氧化系统的紊乱[35]。在本研究中，抗坏血酸和精油混合物的联合饮食降低了胆固醇、甘油三酯、AST、尿素和肌酐的水平，同时提高了HDL-C和总蛋白水平。研究表明，添加精油可以改善血液生化指标，减少脂质过氧化[60,61]，并增强抗氧化能力[35]，这归因于精油成分在维持肾脏和肝脏细胞完整性方面的作用，肾脏和肝脏是脂肪代谢的主要场所[61]，这一点从AST、尿素和肌酐水平的降低中得到了证明。此外，精油通过抑制参与胆固醇代谢和合成的酶（包括3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR）和胆固醇7-α-羟化酶（CYP7A1）的活性来改善脂肪代谢和消化[62]。抗坏血酸还可能通过参与氧化还原反应并清除热应激期间产生的自由基来保护肾脏和肝脏组织细胞免受氧化损伤[32,56]。

血糖和三碘甲状腺原氨酸（T3）水平以及热休克蛋白70（HSP70）是热应激作为细胞保护反应的最敏感指标[8]。我们的结果显示，将抗坏血酸和精油混合物添加到饮食中通过调节代谢降低了血糖和HSP70水平，同时提高了血液中的T3水平，这些变化表明补充组的代谢状态更加稳定，细胞应激减轻[64,65]。HSP70水平的下降可能表明细胞应激程度较低，因为HSP70通常在蛋白质损伤和氧化挑战下上调[43,64]。这一观察可能表明饮食治疗在支持抗氧化防御和限制细胞水平上的氧化损伤方面具有潜在作用，从而改善蛋白质合成并维持细胞完整性[66,67]。此外，T3水平的提高表明甲状腺活性和代谢平衡得到改善，这些在热应激条件下通常会受到抑制[10,67,68]。这种恢复可能与内分泌组织的氧化损伤减少和生理调节的改善有关[31,67,69]。相比之下，血糖的降低表明在热应激条件下能量代谢得到了更好的调节，可利用的能量底物得到了更有效的利用[17,67]。这些结果表明，无论是单独还是联合使用，精油主要影响脂肪代谢，而组合处理对蛋白质代谢的影响更为明显，减少了应激标志物，这可能有助于减少氧化损伤，提高代谢稳定性、细胞完整性和营养利用。

本研究的结果显示，对照组具有更高的炎症细胞因子水平以及显著较低的免疫球蛋白水平。这些发现可能归因于热应激引起的免疫器官炎症和氧化损伤，这会抑制免疫细胞功能，改变小肠和血浆中炎症细胞因子（如TNF-α和IL-6）的表达；此外，热应激还会导致皮质醇水平升高，从而抑制抗体产生[70,71,72]。然而，给兔子喂食抗坏血酸和精油混合物可以增强免疫反应，提高IgA、IgM、IgG和IL-10的水平，同时降低IL-6和TNF-α的水平。这些变化可能表明补充组的免疫谱更加平衡。这种效果可能与抗坏血酸和精油中存在的酚类化合物的抗氧化特性有关，这些化合物可以减少活性氧（ROS）并支持内源性抗氧化系统[50,73,74]。反过来，这增强了抗体产生并调节细胞因子平衡[42,74,75]，从而支持和稳定免疫系统。此外，精油还在减少炎症反应紊乱[22,76]和改善肠道完整性[24,76]以及黏膜免疫方面发挥作用，从而促进免疫球蛋白A（IgA）合成所需的营养吸收[60,63]。这些观察表明，联合补充对促炎和抗炎细胞因子都有较强的影响，这可能有助于在热应激条件下提高免疫系统效率。

兔子的精子膜富含不饱和脂肪酸，这可能使其在热应激期间更容易受到自由基的攻击[2]。这可能会导致脂质过氧化，可能损害DNA稳定性和膜完整性，从而降低精子的活力和受精能力[77]。这种改善归因于抗坏血酸和精油混合物在热应激条件下增强抗氧化防御和改善内分泌调节的协同作用[70,73]。这一点通过精油中的生物活性化合物增强内源抗氧化酶的活性得到证明[60,63]。此外，抗坏血酸作为一种强效的自由基清除剂[34,46]。这些作用可能有助于限制脂质过氧化并保持精子膜功能[34,74]。此外，补充剂还能减少氧化和炎症损伤[21,26,67]，保护睾丸组织并支持精子的形成和完整性[2,77]。这反过来可能有助于提高精子的活力、存活率和浓度，同时减少精子异常。组合补充组在所有精液特性上的显著改善提供了强有力证据，表明综合抗氧化保护在优化生殖性能方面的作用超过了单独使用任何一种成分的效果。然而，还需要进一步的研究来调查这种混合物对生殖效率、后代存活率和整体后代健康的长期影响。

维持肠道完整性对于提高营养效率、系统免疫平衡和生长表现至关重要，尤其是在热应激期间，因为热应激可能会对肠道通透性、炎症状态和微生物组成产生负面影响[23,31,37]。当前研究的数据表明，抗坏血酸-精油混合物或精油的补充对肠道微生物群有调节作用，表现为病原菌数量减少。这些结果与许多先前报告一致，证明了精油和抗坏血酸的抗菌特性[78,79,80,81,82]。这种效果归因于精油中的活性化合物对病原菌的选择性抗菌作用[31,60]，通过削弱代谢过程和破坏细胞膜[83]，而抗坏血酸可以降低肠道环境的pH值，从而限制病原体的增殖[71,73]，证明其在改善微生物平衡和肠道健康方面的作用。因此，无论是单独使用还是组合使用，精油都可能具有抗菌作用，因为组合补充在没有额外添加的情况下仍保持了这种效果，这可能通过抑制病原微生物来促进肠道健康，从而减少来自病原微生物组和局部炎症的毒素。

热应激下的兔子会发生深度分子变化，改变与应激反应、抗氧化防御、代谢、免疫调节以及负责肠道屏障功能的基因的表达，同时增加促炎细胞因子的表达，从而影响生长率、喂养效率和免疫系统效率以及肠道完整性。我们的结果显示，接受抗坏血酸和精油混合物的兔子通过增加CAT-1、CLDN-1和MUC-2基因的表达水平增强了肠道完整性，而IL-1β和IFN-γ的表达水平降低。同样，许多报告指出，抗坏血酸或精油补充剂对热应激下动物的肠道健康相关基因有积极影响[2,9,19]。用抗坏血酸和精油处理的兔子中IL-1β和IFN-γ基因表达水平的显著降低可能归因于它们的抗氧化和抗炎特性[22,26]。这些特性包括强大的活性氧清除活性和增加的氧化应激相关酶活性[34,84,85]，从而减少热应激引起的氧化应激和炎症。同时，抗坏血酸和精油的添加可能通过多种机制促进CAT-1、CLDN-1和MUC-2的表达恢复，包括抑制炎症和氧化损伤[86,87]。这些有益效果减轻了炎症反应的级联反应，维持了上皮组织的稳定性，保护细胞和紧密连接蛋白，并增加了黏液厚度[85,88]，从而支持肠道完整性。基于这些效应，抗坏血酸和精油的共同补充可能在热应激条件下调节基因表达，从而有助于改善热应激兔子的肠道功能、免疫系统效率和营养吸收效率。尽管当前研究取得了令人鼓舞的结果，但仍存在一些局限性，例如来自子样本（如血液、微生物组和基因表达数据）的实验单位较小，以及精油混合物未能进行全面的化学表征，这限制了对各成分的解释。因此，未来需要进行更全面的研究，包括对精油混合物的结构分析（如GC-MS分析），并在多种实验条件下评估这种补充剂的效果。

**结论**
在热应激兔子中，补充精油混合物和抗坏血酸的组合与多方面生理、生殖和生产参数的改善有关。这些改善包括生长性能、抗氧化状态、免疫相关指标和精子质量的提高，以及肠道健康参数的改善。这些发现表明，这种联合营养方法可能有助于缓解热应激的一些负面影响。然而，仍需要进一步的研究来确认其作用机制，并在不同生产条件下验证这些发现。