随着日粮中大豆油含量的增加，奶牛产奶量、乳汁成分及脂肪酸组成的变化：一项剂量-反应研究 作者：Yanitl Citlali Acho-Martínez、Pedro Abel Hernández-García、Enrique Espinosa-Ayala、Enuela Márquez-Molina、Germán David Mendoza-Martínez、Gabriela Vázquez-Silva、Pablo Benjamín Razo-Ortiz、Cesar Diaz-Galván 和 José Felipe Orzuna-Orzuna

《Veterinary Sciences》：Milk Production, Composition, and Fatty Acid Profile in Milk from Dairy Cows Fed Increasing Levels of Dietary Soybean Oil: A Dose-Response Study Yanitl Citlali Acho-Martínez, Pedro Abel Hernández-García, Enrique Espinosa-Ayala, Ofelia Márquez-Molina, Germán David Mendoza-Martínez, Gabriela Vázquez-Silva, Pablo Benjamín Razo-Ortiz, Cesar Diaz-Galván and José Felipe Orzuna-Orzuna

　　**简单总结**
本研究旨在开发一种高效且精确的单碱基基因编辑和敲除系统，适用于鸡体细胞和生殖干细胞。生殖干细胞对于创造基因编辑后的鸡至关重要，但其低转染效率限制了其实际应用。与可能损伤DNA结构的传统基因编辑工具不同，本研究使用的胞嘧啶碱基编辑技术能够精确修改单个DNA字母，而不会断裂DNA链，从而大大提高了对鸡进行基因修改的安全性。我们针对两个控制鸡性别发育的关键基因，添加了早终止信号以关闭这些基因，并筛选出了最有效的编辑引导子。该系统在鸡体细胞和生殖干细胞中均表现出高编辑效率，且在体细胞中未检测到任何非目标突变。我们的工作为家禽遗传研究和精准育种提供了一种安全可靠的基因编辑工具，有助于推动禽类生物技术和可持续畜牧业的进步。

**摘要**
本研究旨在建立一种高效且精确的胞嘧啶碱基编辑器（CBE）介导的敲除系统，应用于鸡体细胞和原始生殖细胞（PGCs）。PGCs在生成基因编辑鸡中起着关键作用，但其低转染效率限制了其应用。与CRISPR/Cas9不同，CBE能够在不引起DNA双链断裂或需要供体模板的情况下实现精确的C到T转换，因此更适用于禽类基因组工程。我们使用CBE在决定性雄激素受体（AR）和DMRT1基因的外显子1中引入早终止密码子以实现靶向敲除。在12种筛选出的sgRNAs中，sgRNA6（AR，94.67 ± 6.66%）和sgRNA9（DMRT1，6.67 ± 6.51%）在DF-1细胞中的编辑效果最佳；在PGCs中，它们的编辑效率分别达到51.0%和91.0%。编辑后的DF-1细胞中未检测到任何非目标突变。这些发现证实，CBE介导的敲除技术在鸡体细胞和生殖细胞中具有高效性和安全性，为禽类基因组编辑提供了一个强大的工具。

**1. 引言**
基因编辑鸡的发展经历了从随机转基因整合到精确靶向编辑的技术进步。目前，CRISPR/Cas9是生成基因编辑鸡的主流技术，通常与PGCs培养和移植系统或精子转染结合使用以实现高效基因组编辑[1,2,3]。PGCs是多能的生殖前体细胞，在胚胎第2.5天时循环于胚胎血液中，迁移到发育中的生殖腺，并最终在成年鸡中分化为成熟的卵子或精子[4,5,6]。为了生成基因编辑鸡，可以分离PGCs进行体外遗传修饰后再重新植入受体胚胎[7]，或者直接在它们在胚胎血液中循环时进行体内编辑[8]。经过修饰的PGCs可以通过配子生成过程将编辑后的遗传特征稳定传递给后代[9]。然而，由于转染效率低，将DNA有效传递给PGCs仍然具有挑战性，这限制了基因编辑鸡的生产[10,11]。目前，实验室中已广泛建立了稳定的鸡PGCs培养系统[12]。此外，我们实验室之前已经解决了PGCs转染效率低的瓶颈问题，为快速生成基因编辑鸡奠定了坚实的基础[10]。迄今为止，CRISPR/Cas9仍然是鸡中使用的主流基因编辑工具，而其他先进的编辑系统很少被报道。与CRISPR/Cas9系统相比，碱基编辑器（BEs）代表了更为精确和安全的基因编辑工具，在家禽遗传改良中具有巨大潜力。

**2. 材料与方法**
**2.1. CBE介导的基因敲除的sgRNA设计与筛选**
所有sgRNAs都是根据CBE系统的要求设计的。单引导RNA（sgRNA）设计首先需要从权威数据库NCBI中检索AR基因的参考序列。从NCBI网站获取AR（NCBI基因ID：NC_052535.1）和DMRT1（NCBI基因ID：NC_052572）基因的外显子1序列，并确定AR和DMRT1的内含子和外显子序列。使用在线工具CRISPOR v5.2（http://crispor.tefor.net/，访问日期2025年10月4日）设计每个基因的sgRNAs。输入目标序列，选择物种基因组和相应的PAM（20 bp-NGN-SpG），就可以获得目标序列上的所有潜在sgRNAs。然后对这些sgRNAs进行筛选，优先选择含有CAG、CAA或CGA序列的sgRNAs。最后根据特异性、切割效率得分、脱靶得分等标准选择合适的sgRNAs。这些选定的sgRNAs被验证为最终设计的针对AR基因外显子1的sgRNAs，并用于后续的基因编辑实验，其中QH173多功能载体同时表达SpGCas9蛋白和目标sgRNA。表1显示了所有sgRNAs的相关信息。

**2.2. 质粒构建**
进行了CBE质粒的设计和构建。采用一步法将sgRNA连接到编辑质粒QH173中（图1A）：(1) 合成两条寡核苷酸后，使用T4缓冲液将其退火成双链；(2) 使用T4 DNA连接酶和限制性内切酶BbsI（Thermo, Waltham, MA, USA）将每个sgRNA分别插入QH173骨架载体的BbsI位点；(3) 连接后，将产物转化到DH5α（WEIDI Shanghai, China）中，接种在含有氨苄西林的LB培养基上，并进行单菌落培养和测序。获得正确序列后，扩大培养规模。最后，使用无内毒素的质粒提取试剂盒（Omega, Beijing, China）提取ZXP1-12质粒，并将纯化的质粒用于后续实验[24,25]。先前的实验发现CMV启动子在PGCs中的表达效率较低。以sgRNA6和sgRNA9为模板，分别用限制性内切酶SalI和NotI（Thermo, Waltham, MA, USA）双酶切回收载体骨架。同时，使用从PGK-EGFP供体质粒设计的引物通过PCR扩增PGK-EGFP片段并进一步纯化。纯化的骨架和PGK-EGFP片段以1:3至1:10的摩尔比连接，加入T4 DNA连接酶（总量的一半）。所得重组质粒分别命名为ZXP6-EGFP和ZXP9-EGFP。引物信息见补充表S1。

**2.3. 细胞培养**
鸡DF-1细胞系在添加了10%（v/v）胎牛血清（FBS, Sciencell, Carlsbad, CA, USA）、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA）中培养，培养条件为37°C、5% CO2。细胞每2–3天传代一次。DF-1细胞接种到6孔板中，24小时后用于转染。PGCs培养基的组成参考了之前的研究并稍作修改。培养基中添加了1× B-27（17504044, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）、1×非必需氨基酸（11140050, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）、0.1 mM β-巯基乙醇（ES-007-E, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA）、1×核苷（12571063, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）、0.15 mM CaCl2（C7902, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA）、0.01%肝素钠（H3149, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA）、0.2%卵白蛋白（S7951, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA）、5 μg/mL OT（C7786, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA）、4 ng/mL FGF2、25 ng/mL Activin A（120-14, PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA）和1% KOSR（10828028, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）。PGCs在含有5% CO2的气氛中于37°C培养。PGCs接种到6孔板中用于转染[3]。

**2.4. 细胞转染**
转染前约24小时，将DF-1细胞传代并接种到6孔板中，细胞浓度为60–70%。使用Lip3000转染试剂盒（Vazyme, Nanjing, China）进行脂质体介导的转染。转染后6–12小时，更换培养基为新鲜的完全培养基（DMEM加10% FBS），以提供充足的营养支持。转染24小时后观察荧光情况以初步评估转染效率。PGCs的转染方法参考了我们实验室之前发表的文章并进行了少量修改[10]。PGCs在无饲养因子的完全培养基中培养，接种密度为30–50%，然后在T75培养瓶中培养。细胞在37°C、5% CO2的培养箱中培养24小时，达到70–90%的密度后用于转染实验。转染使用Lonza电穿孔系统。细胞转入离心管中，以200× g离心3分钟，去除上清液，将细胞沉淀重新悬浮在2 mL PBS中计数。如上所述进行细胞计数。再次以200× g离心3分钟后，将总计3 × 10^6个PGCs重新悬浮在100 μL Entranster?-E电穿孔缓冲液（98668-20, Engreen, Beijing, China）中，并加入不同量的质粒。转染混合物转移至电穿孔 cuvette中，使用Lonza AAD-1001S Nucleofector?系统（Lonza, Baden-Wurttemberg, Germany）进行电穿孔。电穿孔后，PGCs接种到6孔板中并在37°C的完全培养基中维持。

**2.5. 流式细胞术**
转染48小时后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）消化DF-1细胞，然后加入含有10% FBS的停止培养基（Servicebio, Wuhan, China）终止消化过程。收集细胞悬浮液。随后，将细胞悬浮液以600×g的离心力离心5分钟；弃去上清液，将收集到的细胞沉淀重悬于无菌PBS缓冲液中以去除残留的培养基成分。最后，使用多功能自动流式细胞术分析仪（FACS，Sony SH800，索尼公司，东京，日本）对荧光阳性率最高的顶部5–10%的细胞进行分离。该仪器具有较高的分离纯度（>98%）和出色的荧光分辨率，分离出的细胞可以直接用于后续实验。将PGCs以200×g的离心力离心3分钟，并用PBS洗涤两次。然后将细胞转移到BD管中（Becton Dickinson，Franklin Lakes，新泽西州，美国），使用Sony FACS进行流式细胞术检测荧光信号。数据使用FlowJo V10软件进行分析[26]。

2.6. 基因分型和测序
按照制造商的方案，使用KOD One? PCR Master Mix—Blue—（TOYOBO）进行PCR，引物如下（5′→3′）和PCR设置：AR：GAGCACCTCCCGGCCCAACT（正向），TCTCGACGGCCAGCCCCAT（反向），在68°C下退火34轮；DMRT1：GGGGAGCGTAGGGACGGA（正向），AAAGCAGAAGCACGGTCAGATGTT（反向），在64°C下退火34轮。每个PCR反应都包含一个水控制组。PCR产物被加载到含有2 kb DNA Marker（Trans）的1.5% TBE凝胶上。观察到的条带符合预期，AR为571 bp，DMRT1为805 bp。通过凝胶电泳分析PCR产物，随后在中国北京的天益汇源公司进行插入位点的测序以进一步分析。

2.7. 脱靶位点预测和验证
对于针对AR基因的sgRNA6和针对DMRT1基因的sgRNA9，使用Cas-OFFinder在线工具（RGENOME.net网站，https://www.rgenome.net/cas-offinder/，访问日期2025年9月15日）预测潜在的脱靶位点，参数设置为：错配数=3，DNA凸起大小=1，RNA凸起大小=1。根据与目标序列的同源性及基因组保守性，选取了18个高风险的脱靶位点（包括sgRNA结合区域和旁侧序列）进行验证。使用One Step Mouse Genotyping Kit（Vazyme Biotech Co., Ltd.，南京，中国）从流式细胞术分离出的CBE编辑过的DF-1细胞（实验组）和野生型（WT）DF-1细胞（阴性对照）中提取基因组DNA（gDNA）。为每个候选脱靶位点设计特定的引物（补充表S2）以扩增500–600 bp的基因组片段，涵盖sgRNA结合区域、前间隔序列（PAM）以及上下游旁侧序列。使用高保真度的KOD FX酶（TOYOBO）在30 μL的反应体系中进行PCR扩增，体系中包含100 ng的gDNA、0.9 μL的每个正向和反向引物（10 μmol/L）、15 μL的2×PCR缓冲液、6 μL的dNTP（2 μmol/L）和0.6 μL的KOD FX酶。扩增程序设置为：94°C下初始变性2分钟；98°C下变性35轮，每次10秒；60°C下退火30秒；68°C下延伸1分钟；最后在68°C下延伸5分钟。通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物的特异性后，进行Sanger测序。测序结果使用SnapGene v5.2软件（https://www.SnapGene.com，访问日期2025年10月11日）与鸡参考基因组（Galgal6）对齐。比较实验组和对照组的峰型，以分析脱靶位点及其邻近区域的插入/缺失（indels）、C-T转换和其他碱基替换，从而评估CBE的编辑特异性。

2.8. 编辑效率分析
先前的研究表明，CBE的编辑窗口位于PAM序列上游4–8个核苷酸处，我们专注于该窗口内的C到T的替换，这些替换会产生所需的终止密码子（CAG → TAG）。Sanger测序数据处理方法如下：将每个测序样本的应用生物系统Sequence Trace（ab1）文件以及20 bp的sgRNA序列导入在线工具EditR v1.0.10（https://moriaritylab.shinyapps.io/editr_v10/，访问日期2025年12月15日），以确定目标位点的编辑效率。所有在DF-1细胞中的实验都进行了三次生物学重复实验。由于鸡原始PGCs培养和转染的技术挑战，PGCs中的编辑效率分析进行了两次独立的生物学重复实验。所有重复实验的编辑效率值被导出并使用Microsoft Excel整理成表格。所有编辑效率结果使用GraphPad Prism软件（GraphPad Prism 9，访问日期2026年2月1日）进行统计分析和图形展示。所有数据以平均值±标准差（SD）的形式呈现。单因素方差分析（ANOVA）用于比较多个组之间的差异。统计显著性定义为p ≤ 0.05 *，p ≤ 0.01 **，或p ≤ 0.001 ***，n.s.：无显著性。

3. 结果
3.1. 通过CBE在细胞水平上实现的高编辑效率
为了生成AR和DMRT1敲除细胞，我们利用CBE系统针对鸡的AR和DMRT1基因进行编辑。通过将gRNA和CBE表达模块整合到QH173质粒骨架中构建了一个多功能载体（图1A），所有质粒均通过Sanger测序成功验证。设计了12种特定的sgRNA（命名为sgRNA1–8和sgRNA9–12，表1），分别针对AR和DMRT1基因的外显子1（图1B）。对于AR和DMRT1的敲除，CBE通过将谷氨酰胺密码子（CAG）改变为提前终止密码子，从而诱导提前翻译终止和基因沉默。

3.2. 在DF-1细胞中验证质粒转染和阳性细胞筛选
将携带mCherry基因的构建质粒转染到DF-1细胞中。使用荧光显微镜观察转染细胞（图2A）。同一组细胞在两种条件下进行检查：无荧光激发（明场[BF]组）和有荧光激发（mCherry组）。在荧光激发下，明显的红色荧光信号表明DF-1细胞成功转染且mCherry荧光蛋白表达高效且稳定。荧光的强度和分布进一步支持了高转染效率。

3.3. 基因编辑的实验设计和验证
（A）荧光显微镜图像显示了用12种不同的sgRNA质粒（针对AR：sgRNA1–8；针对DMRT1：sgRNA9–12）转染的DF-1细胞中mCherry红色荧光蛋白的表达。省略了比例尺，因为显示了代表性视野。（B）代表性流式细胞术点图，量化了每个sgRNA构建物的mCherry阳性细胞的百分比。数字表示 gated细胞群体的阳性率。（C）所有sgRNA质粒的转染效率的定量分析。转染效率以三次独立实验的平均值±标准差（SD）表示。绿色条形表示针对AR的sgRNA，栗色条形表示针对DMRT1的sgRNA。然后使用FACS评估转染细胞的转染效率（图2B）。在mCherry组中，可见具有强mCherry荧光的细胞群体。将mCherry阳性率最高的顶部5–10%的细胞分离出来用于后续实验。这些结果表明，脂质体介导的转染方法结合流式细胞术分类可以有效分离出mCherry阳性的成功转染细胞，为后续研究提供足够数量的靶细胞。

3.4. 所有设计的sgRNA的转染效果进行定量比较
进一步分析了12种sgRNA构建物的转染效率，并在条形图中总结（图2C）。如图所示，不同sgRNA的转染效率存在差异，其中sgRNA6的转染效率最高（21.20%），其次是sgRNA1（19.20%）和sgRNA2（18.00%）。相比之下，sgRNA5的转染效率最低（4.95%），表明在传递和表达效率方面存在显著的序列依赖性差异。对于两个目标基因，针对AR的sgRNA（sgRNA1–8）显示出整体的强大转染能力，而四种针对DMRT1的sgRNA（sgRNA9–12）也实现了有利的稳定效率，范围从14.10%到15.40%。总体而言，这些数据验证了大多数sgRNA可以在DF-1细胞中高效传递和表达，表现最好的sgRNA可以优先用于后续的基因编辑和功能验证实验。

3.5. 高效的sgRNA筛选
在细胞转染和FACS之后，从三次独立的细胞转染实验中提取基因组DNA。使用特定引物在编辑靶点的两端进行PCR扩增（图3B），并对扩增产物进行Sanger测序和编辑效率分析（图3A,C）。确定了12种针对DF-1细胞的AR和DMRT1基因的sgRNA的CBE编辑效率，每个实验有三次独立重复（n = 3），实验结果经统计分析并以平均值±标准差（SD）表示。不同的字母（A–D）表示组间差异显著（p < 0.05）。进一步对测序谱图进行统计分析以量化C到T碱基转换的效率，并确认每种sgRNA的详细CBE编辑效率：阴性对照（NC）的编辑效率为0.00 ± 0.00%，sgRNA1为95.67 ± 2.52%，sgRNA2为91.00 ± 2.00%，sgRNA3为46.00 ± 1.73%，sgRNA4为86.33 ± 9.29%，sgRNA5为42.67 ± 5.51%，sgRNA6为94.67 ± 6.66%，sgRNA7为59.00 ± 6.24%，sgRNA8为37.00 ± 5.29%，sgRNA9为6.67 ± 6.51%，sgRNA10为0.00 ± 0.00%，sgRNA11为0.33 ± 0.58%，sgRNA12为0.00 ± 0.00%。测序结果进一步显示，在所有上述sgRNA中，sgRNA1（95.67 ± 2.52%）和sgRNA9（6.67 ± 6.51%）在DF-1细胞中实现了最高的C到T碱基转换效率，这直接表明本研究中构建的CBE质粒具有有效的编辑活性，并且编辑效率因编辑靶位点的不同而显著差异。在预测的编辑区域中，包括sgRNA结合位点和原间隔序列相邻基序（PAM），未检测到任何意外的修饰，如C到T的转换或插入和删除（indels）。剩余20个位点的测序结果（见补充表S2）也证实，编辑组的序列与野生型（WT）对照组完全匹配，未观察到脱靶突变。图4. 评估CBE介导的碱基编辑的脱靶效应。(A,B) 在PCR扩增产物中针对sgRNA6 (A) 和 sgRNA9 (B) 预测的脱靶位点进行的琼脂糖凝胶电泳。所有产物都显示出一个500–600 bp的清晰条带，证实了扩增的特异性（sgRNA9的OT6和OT9未能扩增）。(C,D) 代表性高风险脱靶位点sgRNA6 (C) 和 sgRNA9 (D) 的Sanger测序图谱。编辑组的序列与WT对照组相同，在sgRNA结合区域或PAM中未检测到C到T的转换或indels。

3.5. 优化sgRNAs在PGCs中的编辑效率
为了验证CBE系统在PGCs中的有效性，我们修改了之前在DF-1细胞中鉴定的两种最有效的sgRNA质粒（sgRNA6和sgRNA9），生成了重组质粒ZXP6-EGFP和ZXP9-EGFP（图5A）。然后使用这些重组质粒转染PGCs（图5B）。在荧光激发下，检测到明显的绿色荧光信号，证实了PGCs的成功转染和EGFP报告基因的有效表达。图5. CBE介导的PGCs中的编辑。(A) CBE-EGFP表达载体的示意图。(B) 转染了ZXP6-EGFP和ZXP9-EGFP的PGCs中的EGFP荧光。(C) EGFP阳性PGCs的流式细胞术分析。(D) AR和DMRT1靶区的PCR验证。(E) 被编辑位点的Sanger测序图谱，红色框标记了目标胞嘧啶(C)的C→T转换，这将内源性CAG密码子转换为提前终止的TAG密码子。(F) 在分选的PGCs中定量AR和DMRT1的编辑效率。随后使用FACS评估转染效率。我们的结果显示，sgRNA6靶向AR和sgRNA9靶向DMRT1在PGCs中的最大转染效率分别达到了1.92%和1.65%（图5C）。在EGFP组中，识别出一群具有EGFP荧光的细胞，并将所有EGFP阳性细胞分选出来用于后续实验。这些结果表明，电穿孔转染方法结合流式细胞术分选可以有效地从总细胞群体中分离出EGFP阳性细胞，为后续研究提供了足够的目标细胞数量。

细胞转染和FACS后，从两个独立细胞转染实验中获得的细胞样本中提取了基因组DNA，并进行PCR扩增（图5D）。这进一步证明了我们基于流式细胞术的正向细胞分选的有效性。PCR扩增产物进一步进行了Sanger测序和编辑效率分析（图5E）。通过分析测序图谱来量化C到T碱基转换的效率。测序结果显示，sgRNA6靶向AR和sgRNA9靶向DMRT1基因在PGCs中的最高C到T碱基转换效率分别达到了51%和91%（图5F）。这与DF-1的结果不同。在这个阳性细胞样本中增加的杂合峰归因于编辑细胞群体的内在异质性和EditR检测的正常技术波动，这与之前报道的EditR的方法学特性一致[27]。

4. 讨论
作为一种高效且精确的基因编辑工具，CBE规避了传统CRISPR/Cas9系统的一些限制，例如由双链断裂（DSBs）引起的意外indels或染色体易位，推动了农业物种遗传改良的创新进展[28]。尽管在有限的鸟类研究[29,30,31,32]中已经验证了碱基编辑，但我们的工作代表了首次系统性地应用CBE通过引入提前终止密码子来实现AR和DMRT1的靶向基因敲除，在鸡体细胞（DF-1）和PGCs中进行了验证，最高编辑效率分别在DF-1细胞中达到了98%，在PGCs中达到了91%。通过诱导精确的C到T转换（生成TAG终止密码子）而不会产生DSBs，我们不仅扩展了CBE在禽类研究中的应用范围，还建立了一个标准化、可重复的工作流程，可以扩展到其他鸟类物种和目标基因。高效的CBE编辑依赖于高活性的sgRNA设计和严格的筛选，我们的结果揭示了sgRNA性能的显著异质性（例如，sgRNA6在DF-1中的编辑效率为94.7% ± 6.7%，而sgRNA8的效率低于40%），这与之前的发现一致，即sgRNA的有效性受到多个序列特异性因素的影响，包括GC含量、PAM附近的不匹配以及染色质的可访问性[33]。鸡细胞中的编辑效率受到sgRNA序列特征和转染效率的共同调节，方法上的波动也会影响定量结果，这突显了同时进行sgRNA筛选和转染条件优化的必要性[34,35,36]。

PGCs被认为是制备基因编辑鸡的最佳载体，因为它们可以在体外培养、修改，然后移植到受体胚胎中以实现种系传递[37]。在这项研究中，我们观察到由CBE介导的编辑在PGCs和DF-1纤维细胞之间存在明显的细胞类型和目标基因依赖性差异，这与我们的核心发现一致：靶向AR和DMRT1基因的平均编辑效率在两种细胞类型中表现出不同的模式。虽然DF-1细胞为初始的sgRNA筛选提供了便利的平台，但我们观察到DF-1细胞中的sgRNA活性与PGCs中的最终性能之间的相关性较差。这种差异可能部分可以通过DF-1细胞的基因组特征来解释：如先前报道的，DF-1细胞具有复杂的非二倍体核型，伴随染色体融合和拷贝数变化，这可能会影响sgRNA的访问性和碱基编辑器的活性[38]。相比之下，原始PGCs保持正常二倍体基因组和种系特异的染色质状态，这可能有助于DMRT1-sgRNA9在这种细胞类型中观察到的更高编辑效率。此外，我们的编辑效率分析是在大量PGCs群体上进行的，这阻止了对编辑细胞中的纯合子/杂合子比例的明确评估。未来的工作将涉及克隆PGC系，以确定纯合子/杂合子编辑比例并确认引入编辑的稳定性。同时，DMRT1和AR基因的目标位点在两种细胞类型之间存在内在的染色质开放性、表观遗传修饰和基因表达丰度的差异，这最终导致了不同基因-细胞组合之间的CBE编辑效率差异[39,40]。有趣的是，即使在完全相同的实验条件下应用相同的sgRNA，PGCs中的编辑效率仍然表现出显著波动。这种现象的根本原因与前述的基因-细胞间编辑效率差异完全不同，其核心驱动因素是PGCs群体的内在异质性。作为未完全分化的生殖细胞，PGCs在群体内的单个细胞中自然表现出细胞周期进展、表观遗传修饰状态和代谢活动的固有变化，即使在标准化的体外培养后也是如此[41,42]。这些细胞特性直接决定了sgRNA与目标DNA的结合效率以及CBE编辑酶的催化活性，因此在单细胞水平上产生了异质性的编辑效率，表现为群体水平测序检测中的显著波动；测序和量化的细微技术变化只是次要的叠加因素。

对鸡基因组进行单碱基精确定位编辑是禽类生物技术和家畜遗传育种的关键焦点；传统策略依赖于CRISPR/Cas9-ssODN介导的同源定向修复（HDR）来生成靶向突变，但由于HDR活性低，特别是在PGCs中，导致编辑效率低下和筛选周期长[43,44,45]。Roslin研究所报告称，鸡ANP32A（在DF-1中为9–14%，在PGCs中为4–7%）和NHE1（在DF-1中为12–18%，在PGCs中为5–9%）的HDR效率较低[46,47]。同样，一个韩国团队使用相同的方法在DF-1中仅实现了9–16%的编辑效率，在PGCs中为4–7%，这突显了这种传统方法的瓶颈[48]。此外，通过药物筛选和限制稀释分离阳性克隆需要3–5个月的时间，大大增加了实验时间和成本。相比之下，我们的CBE介导的碱基编辑系统不需要DNA双链断裂、HDR或外源ssODN，实现了AR和DMRT1的显著提高的编辑效率：在DF-1细胞中分别为94.7% ± 6.7%和6.67 ± 6.51%，在PGCs中分别为51.0%和91.0%。值得注意的是，尽管CBE在PGCs中的转染效率相对较低，但此处实现的高编辑效率表明，一旦CBE成功递送到PGCs中，它就能在这些细胞中有效介导基因组修饰。结合流式分选，正编辑克隆在1个月内获得，将实验周期减少了80%以上。

普遍认为CRISPR-Cas系统有可能导致脱靶突变，有时频率出乎意料[49,50]。为了评估潜在的脱靶效应，我们检查了每个使用的gRNA对应的十六个接近不匹配的gRNA位点。在这项研究中，脱靶验证仅在DF-1细胞中进行，通过Sanger测序未在预测的高风险位点检测到任何脱靶突变。这些结果与先前的报告一致，表明CBEs比传统的CRISPR/Cas9系统具有更高的精确度和安全性[51,52]。在体细胞DF-1细胞和具有生殖能力的PGCs中建立的CBE介导的敲除模型也为探索鸟类雄性发育中AR和DMRT1的分子机制提供了新的实验工具，从而能够生成用于体内功能验证的转基因鸡。

尽管这项研究在鸡细胞中实现了AR和DMRT1的有效且精确的编辑，但仍存在一些限制。首先，可以通过优化转染参数、递送系统和酶工程进一步提高PGCs中的编辑效率。其次，目前的研究仅验证了细胞水平的编辑效果，还需要使用基因编辑鸡来进一步验证AR和DMRT1的体内功能。此外，目前的CBE系统只能进行C到T的转换，未来可以通过结合ABE和prime editing来扩展应用范围。尽管存在这些限制，这项研究成功建立了用于鸡细胞的高效且特定的CBE编辑平台，填补了禽类生殖基因编辑中碱基编辑技术的应用空白。总之，这项研究在鸡DF-1细胞和PGCs中成功建立了一个高效且安全的CBE介导的基因敲除系统，目标基因是性别决定基因AR和DMRT1。我们的发现证实，CBE可以在不产生双链断裂的情况下实现精确的单碱基编辑，填补了禽类生殖细胞中碱基编辑应用的空白，并为制备基因编辑鸡提供了一个可靠的技术平台。这项研究促进了家禽精准育种的发展。对于未来的研究，我们将进一步优化CBE在PGCs中的递送效率，验证PGCs全基因组水平的脱靶效应，并通过种系传递生成基因编辑鸡，以探索AR和DMRT1基因的体内功能。

补充材料
以下支持信息可以下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/vetsci13050455/s1
表S1：用于构建质粒的引物；
表S2：用于分析鸡DF1胞嘧啶碱基编辑的脱靶位点（OTS）及其对应的引物。