综述：弓形虫疫苗开发的进展与转化挑战：从抗原发现到mRNA技术及“同一健康”策略 阿卜杜勒·卡迪尔（Abdul Qadeer）、 穆罕默德·塔尔瓦特（Mohamed Tharwat）、 穆罕默德·扎胡尔·汗（Muhammad Zahoor Khan）、 亚历山德拉·尤哈什（Alexandra Juhasz）和 法哈德·A·阿尔尚巴里（Fahad A. Alshanbari）

《Veterinary Sciences》：Advances and Translational Challenges in Toxoplasma gondii Vaccine Development: From Antigen Discovery to mRNA and One Health Strategies Abdul Qadeer, Mohamed Tharwat, Muhammad Zahoor Khan, Alexandra Juhasz and Fahad A. Alshanbari

　　**简单总结**
本文回顾了全球范围内为开发针对刚地弓形虫（Toxoplasma gondii，T. gondii）的疫苗所做出的努力。这种寄生虫会对未出生的婴儿和免疫系统较弱的人造成伤害。虽然已经有一种疫苗（Toxovax）用于绵羊以减少流产，但目前尚无适用于人类的安全疫苗，而且由于安全问题，这种活疫苗不能用于人类。本文用通俗的语言解释了科学家们关注的寄生虫部位、正在测试的主要疫苗类型（包括基于新冠病毒疫苗相同技术的新型疫苗），以及为何研发此类疫苗如此困难。我们认为，减少人类感染的最快途径可能不仅仅是开发人类疫苗，还需要为猫（在环境中传播寄生虫）和农场动物（可能通过肉类携带寄生虫）接种疫苗。将动物和人类健康结合起来——即所谓的“同一健康”（One Health）方法——提供了一种切实可行的短期策略，以减轻这种寄生虫的全球负担。

**摘要**
由专性胞内寄生虫刚地弓形虫引起的弓形虫病是全球最常见的寄生虫感染之一，影响约三分之一的人口。尽管经过数十年的深入研究，仍没有有效的疫苗。目前唯一可用的商业疫苗Toxovax仅限于兽医在绵羊身上的使用，由于安全原因不适合人类使用。本文不仅总结了相关文献，还批判性地分析了疫苗研发停滞的原因，并指出了未来的研究方向。在临床前模型中，减毒活疫苗具有最佳的免疫原性，但在人类应用方面面临重大挑战。主要抗原靶点包括表面抗原（SAG）、致密颗粒抗原（GRA）、罗普特里蛋白（ROP）和微针蛋白（MIC）。保护性免疫主要依赖于产生干扰素-γ的Th1型免疫反应。主要障碍包括寄生虫复杂的生命周期、菌株多样性以及难以实现无菌免疫。亚单位疫苗和mRNA疫苗平台具有更好的安全性，并有成熟的临床先例，是最可行的候选方案。CRISPR/Cas9基因编辑和新兴的mRNA疫苗技术为疫苗研发提供了新的方向。本文从三个方面推动了该领域的发展：（1）将针对多阶段保守抗原的mRNA和佐剂亚单位疫苗视为最现实的短期候选方案；（2）指出现有研究对缓殖体阶段生物学机制关注不足的缺陷；（3）提出未来的发展应分为三个互补的“同一健康”目标：预防人类先天性疾病、减少牲畜组织囊肿负担以及通过为猫接种疫苗来阻断环境传播。实际上，优先在兽医领域应用疫苗是减少人类和人畜共患病负担的最直接有效途径。

**1. 引言**
刚地弓形虫（T. gondii）是一种具有广泛全球分布的专性胞内顶复门寄生虫，几乎可以感染所有温血动物[1,2]。不同地区的血清阳性率估计从10%到80%以上不等，弓形虫病是一个重要的公共卫生问题，影响了约20亿人[3]。该寄生虫具有复杂的生命周期，猫科动物是其终末宿主，人类则是众多中间宿主之一。已确定了四种主要传播途径：摄入受污染环境中的卵囊；食用未煮熟的受感染肉类中的组织囊肿；器官移植；以及胎盘传播[4]（图1）。

**图1. 刚地弓形虫的传播途径和临床表现**
该图总结了终末宿主（猫科动物）和中间宿主、四种主要传播途径（摄入卵囊、含组织囊肿的肉类、器官移植以及垂直传播），以及五种临床表现形式。每种临床表现的详细信息在正文中有描述。该图使用BioRender生成（Khan, M. Z., 2026年4月27日: https://BioRender.com/12gursm）。

**2. 文献选择与搜索策略**
这是一篇叙述性综述，而非系统性综述。文献通过PubMed、Scopus和Web of Science检索，检索时间截至2025年10月，使用了“T. gondii”、“疫苗”、“mRNA”、“DNA疫苗”、“减毒活疫苗”、“亚单位疫苗”、“纳米颗粒”、“CRISPR”、“缓殖体”、“同一健康”及相关抗原名称（SAG、GRA、ROP、MIC、CST1、BAG1”等术语。优先选择过去十年内的原创研究文章、系统综述和方法学研究，也包括具有历史意义的早期文献（如Toxovax）。非英语文献、未提供完整数据的会议摘要、书籍章节和缺乏明确实验结果的报告通常被排除在外。这种选择方法具有包容性，但并不全面。

**3. 弓形虫病疫苗的现状**
**3.1. Toxovax：唯一的商业疫苗**
Toxovax（MSD Animal Health，新西兰惠灵顿）基于减毒的S48株刚地弓形虫，是唯一获得商业许可的弓形虫病疫苗[11,12]。该疫苗已获多个国家（包括欧洲和新西兰）的兽医使用许可，主要用于预防绵羊的先天性弓形虫病和流产。S48株最初是从新西兰的一只流产羔羊中分离出来的，经过大量实验室培养后失去了形成组织囊肿的能力，从而实现了保护作用而不引发持续感染。在绵羊身上的应用表明，针对弓形虫病的活疫苗在生物学上是可行的，但也暴露出在实际应用中的安全性、保质期和可转化性方面的限制[14]。虽然Toxovax能有效降低流产率，但其极短的保质期（仅10天）要求在生产后迅速使用，存在潜在的毒性恢复风险，且其安全性在人体临床试验中尚未得到评估，因此不符合现行监管要求[11,12]。尽管如此，它在绵羊和山羊身上的成功为人类疫苗研发提供了借鉴。它的例子说明，即使是减毒的活疫苗也能诱导强烈的保护性免疫，这正是人类疫苗的关键目标。然而，使其无效的特性（具有复制能力）也使得其在人类应用中不可接受。这种免疫原性与安全性之间的权衡促使研究人员转向非复制型疫苗平台，以牺牲部分免疫原性来换取更高的安全性。

**3.2. 人类疫苗研发的目标**
针对弓形虫病的疫苗研发需要考虑具有不同免疫学和临床需求的多种目标人群。对于孕妇和育龄妇女，主要目标是通过孕前免疫或孕期预防初次感染来防止先天性传播。对于免疫功能低下的人群，疫苗可以增强现有免疫并防止潜伏感染的重新激活。这些以人类为中心的目标要求疫苗具备安全性，优先选择非复制型平台并提供明确的免疫反应特征。对于兽医应用，疫苗可以减少食品生产动物中的组织囊肿形成，从而降低人类通过食用未煮熟肉类的风险；对于猫用疫苗，则可能减少环境中的卵囊污染[13]。与人类疫苗不同，兽医疫苗更容易采用减毒活疫苗，并主要依据其减少寄生虫负担和阻断传播的效果进行评估，而非针对免疫功能低下或孕妇的临床安全性。理想的弓形虫病疫苗应具备多种特性：在包括免疫功能低下者在内的多种人群中证明安全；能够诱导强烈的持久保护性免疫；对全球主要基因型的多种刚地弓形虫株有效；具有储存稳定性和易于使用的特点；以及成本效益高，以便在流行地区广泛使用[9]。

综上所述，未来针对刚地弓形虫的疫苗研发至少应分为三个不同的目标，每个目标需要不同的疫苗设计和成功标准。第一个目标是预防先天性疾病，需要非复制型疫苗并确保人类使用的安全性；第二个目标是减少食品生产动物中的组织囊肿负担，可以采用减毒活疫苗或佐剂疫苗；第三个目标是阻断环境传播，需要专门针对猫的疫苗，无论是否具有全身保护效果。明确这些差异对于选择合适的抗原、疫苗平台和评估效果至关重要。

**4. 疫苗研发的抗原靶点**
选择适当的抗原靶点是疫苗效果的关键。这些抗原主要来自顶复门寄生虫特有的分泌器官：微针、罗普特里蛋白和致密颗粒[15]（图2）。

**4.1.**表面抗原（SAGs）构成了寄生虫的最外层，是弓形虫（T. gondii）与宿主细胞初次接触的点。SAG1（也称为P30）是速殖子中最丰富表达且最具免疫优势的表面抗原，因此成为研究最广泛的疫苗候选物[16]。这种锚定在糖基磷脂酰肌醇上的蛋白质在宿主细胞附着和入侵过程中起着关键作用，众多研究表明基于SAG1的疫苗能够引发体液和细胞免疫反应，产生大量抗体并分泌IFN-γ。然而，仅含SAG1的疫苗通常只能提供部分保护，这促使人们研究多抗原配方。其他表面抗原，包括SAG2、SAG3以及SAG1相关序列（SRS）超家族的成员，也作为疫苗候选物进行了评估，取得了不同程度的成功[12]。

4.2. 密集颗粒抗原（GRAs）
GRAs在宿主细胞入侵后被分泌到寄生虫吞噬泡中。GRA家族包含超过40个成员。GRA1是最早被克隆的成员之一[17]；GRA2、GRA4、GRA6和GRA7能诱导强烈的Th1偏向免疫反应并增加IFN-γ的产生。系统评价指出GRA4和GRA7具有特别的保护作用[18]。其他成员，如GRA14[19]、GRA17[20]、GRA23[20]、GRA15[21]和GRA24[21]也被研究作为疫苗靶点，通常与其他抗原联合使用以增强保护效果。

4.3. Roptry蛋白（ROPs）
Roptry细胞器包含球状蛋白（ROPs）和颈部蛋白（RONs）。ROP蛋白受到了广泛关注。如上所述，ROP18是一种关键的致病因子，基于ROP18的疫苗已被证明能诱导保护性免疫，提高Th1细胞因子水平并延长生存期[22]。此外，ROP2是最常用于疫苗研究的roptry抗原之一，具有强烈的免疫原性，并被纳入多种联合疫苗配方中。其他roptry蛋白，包括ROP5、ROP8、ROP13和ROP16以及ROP54，也被评估为潜在的疫苗候选物，生物信息学分析显示某些ROP蛋白（如ROP19）比传统的SAG1等候选物具有更好的抗原特性[22]。

4.4. 微丝蛋白（MICs）
MICs在宿主细胞识别和附着的初期阶段被分泌，通过粘附域与宿主细胞受体结合，在寄生虫的运动和入侵中起重要作用。MIC1、MIC2、MIC3、MIC4和MIC6已被评估为疫苗候选物，并显示出有希望的结果。系统评价表明，大约57%的基于MIC的疫苗研究集中在MIC3及其表位上[23]。这些蛋白特别有吸引力，因为它们在寄生虫生命周期的入侵阶段表达，而且与多种MIC蛋白联合使用或将其纳入多抗原疫苗中比单一抗原方法能增强保护效果。AMA1（顶端膜抗原1）虽然严格来说不属于微丝蛋白，但在入侵过程中与RON蛋白共同作用，在疫苗研究中显示出强烈的免疫原性[44]。

4.5. 多抗原和表位导向的方法
认识到单一抗原疫苗通常只能提供部分保护，促使人们开发结合不同蛋白质家族表位的多抗原配方。包含SAG、GRA、ROP和MIC家族抗原的联合疫苗一致显示出优于单一抗原疫苗的保护效果[24]。例如，编码TgPF、TgROP16、TgROP18、TgMIC6和TgCDPK3组合的DNA疫苗对急性和慢性弓形虫病都表现出更好的保护作用。利用免疫信息学方法设计的多表位疫苗成为一种有前景的策略，能够合理选择来自多个抗原的B细胞和T细胞表位，以最大化免疫原性同时最小化构建物的体积[25]。

对抗原文献的批判性评估表明，尽管研究广泛，但存在偏颇。尽管SAG1具有高免疫优势，单靠它不足以提供充分保护，可能是因为抗体介导的免疫无法完全控制细胞内的寄生虫。GRA和ROP抗原能引发更强烈的T细胞反应，GRA7和ROP18在多项研究中都显示出有效性。超越简单的目录视图，这些抗原家族可以被大致分为不同的目标：SAG和MIC抗原最适合阻止初始入侵，因此适用于急性期控制；GRA和ROP抗原主要针对速殖子免疫，有助于减少传播；而慢殖子特异性抗原（尤其是BAG1和CST1）对于限制慢性囊泡负担和再激活至关重要。因此，故意结合至少一种入侵相关抗原和一种慢殖子阶段抗原的多抗原构建物相比仅含速殖子的联合疫苗可能提供更全面的生命周期覆盖。

目前许多候选疫苗的一个主要限制是侧重于速殖子的抗原选择。相比之下，在理性疫苗设计中应更明确地考虑阶段转换和慢性慢殖子的持续存在——特别是为了长期保护和减少组织囊肿负担[13]。这个问题不仅仅是理论上的：慢性感染和组织囊肿的持续存在在自然暴露的宿主体内可能有生物学后果，进一步支持了需要针对长期寄生虫持续存在的疫苗策略[26]。因此，如BAG1（一种阶段保守的热休克样蛋白）和CST1（主要的囊壁糖蛋白）等慢殖子特异性抗原在疫苗设计中应占据更重要的位置。实证表明，表达CST1的VLP疫苗在减少慢性囊肿负担方面优于速殖子抗原VLPs[27,28]，这与当前疫苗无法消除但只能减少组织囊肿的观点一致。要实现接近无菌免疫的状态，几乎肯定需要能诱导针对囊泡携带细胞呈递的肽的CD8+ T细胞反应的疫苗——这是以速殖子为主的抗原面板无法满足的要求。

5. 疫苗平台和递送系统
5.1. 减毒活疫苗
减毒活疫苗是最具免疫原性的方法，能够诱导强大且持久的免疫，模拟自然感染。CRISPR/Cas9技术彻底改变了理性减毒菌株的生成[29]（图3）。已经开发并评估了多种基因敲除菌株作为疫苗候选物，并取得了显著成功。ΔGRA17突变株在小鼠模型中对急性、慢性及先天性弓形虫病提供了保护[30]。WH3 Δrop18株对I型（RH）、II型（ME49）和中国1型菌株具有保护作用[31]。其他有前景的减毒株包括ME49Δcdpk3[32]、尿嘧啶依赖性菌株Δompdc和ΔompdcΔuprt[33]、经γ射线处理的减毒菌株（6个月存活率为57.1%；感染减少99.8%[34]、ME49Δ203240[35]以及PruΔUrm1（对致命RH挑战提供完全保护[36]）。表1提供了各种疫苗的定量对比。图3展示了弓形虫疫苗的主要平台：(A) 通过CRISPR/Cas9介导的基因删除生成的减毒活菌株；(B) 核酸疫苗（DNA质粒和mRNA-LNP）；(C) 基于纳米粒子的递送系统（PLGA、壳聚糖、磷酸钙、自组装蛋白质纳米粒子）；(D) 重组蛋白亚单位佐剂以驱动Th1偏向免疫；(E) 结合ROP、SAG和MIC抗原表位的多表位或嵌合构建物；(F) 表达T. gondii抗原的病毒载体和类病毒颗粒（VLPs）。Khan, M. Z. (2026) https://BioRender.com/p3nlpcs (2026年4月27日)。
表1. 主要弓形虫疫苗平台的比较评估。

一种特别创新的方法涉及产生非感染性卵囊的HAP2缺陷菌株[37]。这种阻断传播的疫苗在猫体内口服给药后，能够完全防止卵囊的排出，突显了一种符合“同一健康”理念的方法，可以在源头上减少环境污染。因此，基因编辑减毒菌株不仅作为免疫原性平台具有价值，还可以作为阻断传播的工具，实验性疫苗策略在猫身上显示可以防止野生型卵囊的排出[37]。ME49Δgra5还减缓了乳腺肿瘤生长和肺转移[38]；GRA4缺失菌株显示出肿瘤免疫治疗活性[39]。尽管有这些进展，减毒活弓形虫疫苗不太可能适用于人类。主要的人类相关障碍包括：(1) 监管机构不愿意给孕妇或免疫功能低下的受试者使用活的顶复门寄生虫；(2) 严格的冷链要求；(3) 尽管有明确的基因缺失，但仍存在恢复毒力的理论风险；(4) 没有人类使用活寄生虫疫苗的监管先例。虽然CRISPR/Cas9技术彻底改变了理性减毒菌株的生成[29]，但两个具体的安全风险尚未得到充分讨论，必须在任何人类应用之前解决。首先，脱靶基因编辑是一个不容忽视的风险；应进行全基因组测序以确保只有预期的缺失存在[29]。其次，即使是有明确缺失的菌株也存在通过基因转换或基因互补恢复毒力的理论风险。对于具有猫科动物有性生殖周期的T. gondii来说，这一风险尤为相关，因为其他大多数疫苗背景下不存在基因交换的途径。因此，任何用于人类或广泛兽医用途的减毒活CRISPR编辑菌株都必须在允许有性重组的条件下评估其遗传稳定性[37]。这些考虑强调了非复制平台（mRNA、亚单位、VLP）更容易转移到人类群体中的观点。

5.2. DNA疫苗
DNA疫苗的优势包括易于生产、稳定性高、成本低以及能够诱导体液和细胞反应[19]。多基因构建物比单基因构建物表现更好：ROP5/ROP7/SAG1组合将脑囊负担减少了76%[40]；ROP21/ROP29通过Th1极化延长了生存期[41]；TgGRA28/TgGRA83与IL-28B佐剂结合使用提高了生存期并减少了囊泡负担[42]。包含五种抗原（ROP5、ROP18、GRA7、GRA15、MIC6）和IL-24的联合疫苗表现出更好的保护效果[43]；包含六种roptry蛋白的联合疫苗延长了生存期[44]；TgIST/TgNSM与IL-36γ结合使用引发了Th1偏向免疫[45]；GRA35/GRA42/GRA43的组合优于单一抗原[46]；七抗原pVAX1-MAF构建物显著延长了生存期[47]。单抗原SRS13 DNA疫苗引发了强烈的IFN-γ和CD8+反应[48]。尽管有这些令人鼓舞的临床前数据，但目前尚未有任何DNA疫苗获得人类使用的许可，考虑到该领域数十年来在鼠类模型中的强大数据但在人类中的免疫原性较弱，这对弓形虫DNA疫苗的转化是一个重要的警告。

5.3. 重组蛋白亚单位疫苗
蛋白亚单位疫苗具有明确的组成和质量控制，但免疫原性较低，需要强效佐剂[11]。嵌合蛋白SGR（SAG2-GRA1-ROP1）和SMMG（SAG1-MIC1-MAG1-GRA2）显示了长期保护作用[49]。重组ROP6在S. cerevisiae中实现了100%的存活率和显著的囊肿减少[50]。重组T. gondii DDX3X蛋白作为疫苗使用时，急性挑战后存活率达100%，并且减少了囊肿负担（免疫小鼠的平均生存期为12天，而对照组为10天）；慢性PRU感染后脑囊肿负担也减少了（410个对比616个，约低33%[51]。可溶性全长rSAG1将生存期延长了约14.5天[52]；rTgCalreticulin使存活率达到了100%，同时减少了囊肿负担[53]；rTgDDX39减少了34%的慢性脑囊肿负担（原始研究[54]）。多抗原蛋白组合也显示出潜力，例如结合TgCDPK3、TgGRA35和TgROP46的联合疫苗在急性挑战后显著延长了生存期，并减少了慢性感染中的脑囊肿负担[55]。然而，重组GRA15的保护效果依赖于菌株，这突显了疫苗设计中的一个重要考虑因素[56]。

5.4. mRNA疫苗
COVID-19 mRNA疫苗的成功促进了针对寄生虫疾病的适应。mRNA疫苗能够快速开发，实现天然抗原的表达和正确的翻译后处理，以及强烈的免疫[57]。对于T. gondii：编码TgNTPase-II的mRNA-LNP减少了囊肿数量并延长了生存期[58]；四价自放大mRNA-LNP（ROP18、TGME49_237490、TGME49_268230、MIC13）在致命速殖子挑战后生存率提高了60–80%，在卵囊挑战后囊肿减少了72.5%[59]；编码TGGT1_278620[60]、TG_200[53]、TGGT1_316290[61]和优化后的ROP6构建物均显示出强烈的Th1偏向免疫并提高了生存期。

5.5. 基于纳米粒子的疫苗
包括PLGA、壳聚糖、磷酸钙和自组装蛋白质纳米粒子在内的纳米粒子递送系统已被广泛探索[63]。装载pVAX1-TgIMC1的PLGA和壳聚糖纳米球引发了强烈的免疫反应，并减少了心脏寄生虫负担[42]。PLGA封装的TgGAP45诱导了平衡的Th1/Th2/Th17反应[64,65]。额外的配方——PLGA/壳聚糖-TgRPS2 [66]；含有MIC6/ROP18的AHACNP-HG水凝胶 [67]；带有TLR配体的PLGA-SAG1 [63]；PLGA-GRA12与GRA7的比较 [68]；海藻酸盐-ES抗原 [69]；含有普萘洛尔/纳曲酮的壳聚糖-SAG1 [70,71]——均显示出了保护作用。5.6. 类病毒颗粒（VLP）疫苗 VLP是一种高度免疫原性的平台，可以模拟病毒结构而不包含遗传物质。ISP3-VLP对致命的ME49攻击提供了完全的保护 [72]。表达GRA5 [73]或GRA7的鼻内VLP减少了脑部炎症和囊肿负担 [74]。表达CST1或MIC8的杆状病毒VLP引起了保护性免疫，其中CST1的效果更佳 [27]。基于CST1的VLP特别值得关注，因为它们是少数能够特异性针对囊壁生物学以及缓殖子阶段的平台之一。其他策略包括痘苗病毒初次接种/VLP加强组合 [75]、CST1/ROP18的比较 [28]、异源口服ROP4 VLP [76]，以及展示CST1的流感VLP以减少慢性囊肿负担 [77]。5.7. 平台对比 对于转化应用来说，一个核心问题是应优先选择哪种平台。以下比较分析将上述定性论点整合到一个框架中（表1）。5.8. 新型佐剂系统 新型佐剂系统在提高针对弓形虫的疫苗效力方面起着关键作用。含有灭活寄生虫的胶体锰盐佐剂实现了50%的急性存活率和90.77%的囊肿减少 [78]。HA201/HA203佐剂分别实现了50%/70%的存活率，而单独使用疫苗时仅为10% [79]。结合Freund佐剂的MIC13/GRA1/SAG1引发了最高的免疫反应 [80]。纳米脂质包裹的褪黑素和视黄酸是更有效的鼻内佐剂 [81,82]。多阶段rBAG1/rGRA1与壳聚糖-伤寒沙门氏菌孔蛋白佐剂结合使用，实现了最高的存活率 [83]。5.9. 重组病毒载体和细菌疫苗 重组病毒载体是弓形虫疫苗接种的一个新兴平台。表达MIC8、AMA1或RON4的鼻内重组痘苗病毒对致命的ME49攻击实现了100%的存活率，其中MIC8-rVV实现了最大的囊肿减少 [84]。表达ROP4的重组痘苗病毒引发了黏膜和系统性的免疫反应 [76,85]。表达GRA12的枯草芽孢杆菌孢子（rBS-GRA12）引发了强效的黏膜免疫，从而减少了寄生虫载量 [86]。5.10. 新方法和新兴平台 近期关于弓形虫疫苗的研究中出现了一些创新方法。包封在尼奥斯体中的ES抗原增强了免疫反应，使寄生虫载量减少了85-90% [87]。来自感染人体细胞的exosomes吸附到明矾上，将脑部囊肿负担减少了75% [88]。经过钙矿化处理的缓殖子产生的热稳定颗粒在超过12个月内保持稳定，并提供了完全的保护 [89]。专门针对缓殖子AMA4/RON2L1移动连接区的疫苗显著减少了慢性囊肿负担 [90]。6. 保护性的免疫机制 6.1. 先天性免疫反应 先天性免疫系统在最初识别和控制弓形虫感染中起着关键作用。寄生虫衍生的分子通过模式识别受体（特别是TLR）被识别。小鼠中的TLR11和TLR12能够识别弓形虫profilin，触发树突状细胞和巨噬细胞产生MyD88依赖性的信号和IL-12 [91]。然而，人类缺乏功能性的TLR11和TLR12，因此基于profilin识别的小鼠数据可能无法直接转化为人类的结果。人类的替代感知途径包括TLR4、TLR2以及细胞内传感器，如cGAS-STING。自然杀伤（NK）细胞提供了早期的IFN-γ来源，而树突状细胞通过处理弓形虫抗原并产生IL-12来连接先天性和适应性免疫（图4）。中性粒细胞通过吞噬作用和释放抗菌化合物做出贡献。图4. 对抗弓形虫的免疫机制。(A) 疫苗吸收：抗原+佐剂被抗原呈递细胞（包括树突状细胞）吸收。(B) MHC-II呈递激活CD4+辅助T细胞。(C) MHC-I交叉呈递激活CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTLs).(D) 来自动树突状细胞的IL-12驱动Th1极化并早期产生IFN-γ。(E) Th1细胞和CTLs产生高水平的IFN-γ，抑制细胞内寄生虫复制。(F) B细胞产生IgG2a抗体，中和并调理细胞外的寄生虫。总体保护特征是Th1极化，伴有升高的IFN-γ和抗原特异性CD8+ T细胞。创建于BioRender。Khan, M. Z. (2026) https://BioRender.com/74vg96m (2026年4月27日)。6.2. 适应性免疫反应 细胞介导的免疫，特别是Th1反应，对于长期保护至关重要。CD4+ Th1细胞产生IFN-γ，通过激活受感染的巨噬细胞、诱导抗菌效应器并协调整体反应来控制弓形虫 [92]。IFN-γ激活与免疫相关的GTP酶（IRGs）和鸟苷酸结合蛋白（GBPs），这些蛋白可以靶向并破坏寄生虫吞噬泡。在慢性感染期间，CD8+细胞毒性T淋巴细胞不可或缺，它们可以清除在MHC-I上呈现弓形虫肽的寄生虫携带细胞 [93]。体液免疫通过中和、调理作用和抗体依赖的细胞毒性提供保护；保护性反应与Th1相关的IgG（特别是小鼠中的IgG2a）相关，而黏膜IgA可能在肠道入口处限制感染。6.3. 佐剂的作用 佐剂的选择对疫苗的免疫原性和产生的反应类型有重大影响。对于弓形虫疫苗，优先选择促进Th1反应的佐剂。明矾主要诱导Th2反应，因此对于弓形虫来说不是最佳选择 [94]。更合适的选择包括TLR9激动剂（CpG寡脱氧核苷酸）、GLA-SE（葡萄糖吡喃糖脂佐剂稳定乳液）和细胞因子佐剂，如IL-12、IL-15、IL-21和GM-CSF。由于增强了抗原吸收和储存效应，纳米颗粒配方本身具有佐剂特性 [95]。从转化应用的角度来看，几个免疫学要求应指导疫苗开发：(1) 有效的疫苗必须诱导强效、持久的IFN-γ产生型CD8+ T细胞反应——这应该是临床前评估中的主要免疫学终点；(2) 鉴于人类缺乏TLR11/12，那些在小鼠中通过TLR11依赖机制显示出保护作用的候选疫苗可能无法有效转化，研究应包括TLR11敲除小鼠或替代指标；(3) 该领域缺乏标准化的保护性免疫学指标——建立共识性的替代标志物将有助于跨研究比较；(4) 应更多关注肠道入口处的黏膜免疫。7. 疫苗开发中的挑战 7.1. 复杂的生命周期和阶段特异性抗原 弓形虫复杂的生命周期涉及缓殖子、速殖子和孢子，它们具有不同的抗原表达，这使得疫苗设计变得复杂。有效的疫苗应针对多个阶段表达的抗原 [13]。从速殖子到缓殖子的转变伴随着基因表达的显著变化；仅针对速殖子抗原的疫苗可能无法预防慢性感染。7.2. 基因多样性和菌株变异 弓形虫表现出显著的基因多样性。北美和欧洲主要存在三个克隆谱系（类型I、II、III）；在南美、非洲和亚洲则存在更多样化的非典型基因型；中国1（ToxoDB#9）在东亚占主导 [54]。抗原变异引发了关于交叉保护的担忧，而重复感染进一步复杂化了疫苗设计。疫苗应包含保守的表位或多个菌株特异性抗原。7.3. 实现无菌免疫 尽管有许多候选疫苗展示了延长存活时间和减少囊肿负担的能力，但尚未有疫苗实现无菌免疫 [12]。为什么对于弓形虫来说实现无菌免疫如此困难？几个生物学上的原因使得这一目标特别具有挑战性。首先，弓形虫是一种专性细胞内寄生虫，能够迅速扩散到免疫特权组织（如大脑、眼睛和胎盘），这些组织的免疫监视受到生理限制 [6]。其次，组织囊肿内的缓殖子在厚厚的糖蛋白囊肿壁后仅表达有限的抗原库，这限制了抗体和效应细胞的进入；它们的复制速度也非常慢，从而减少了MHC-I呈现的肽的周转率，从而限制了CD8+ T细胞的监视 [13]。第三，寄生虫通过ROP和GRA效应子主动调节宿主细胞信号通路，在容纳囊肿的细胞中抑制IFN-γ反应 [89]。第四，即使是在自然清除急性感染的免疫健康个体中，仍然存在持续感染——表明自然界本身并不提供无菌免疫。因此，无菌免疫可能不应作为实际的疫苗目标；相反，具有临床意义的目标应该是减少胎儿感染、减少食品动物体内的组织囊肿负担以及防止猫排出卵囊 [12,13]。7.4. 从动物模型到人类的转化 大多数弓形虫疫苗研究都是在小鼠模型（BALB/c, C57BL/6）中进行的。小鼠和人类之间的免疫反应存在显著差异；小鼠表达能够识别弓形虫profilin的TLR11和TLR12，而人类缺乏功能性等同物 [13]。这些差异可能导致在小鼠中有效的候选疫苗无法转化为人类效果。人源化小鼠模型或其他动物模型可能有助于弥合这一差距。更广泛地说，有希望的临床前结果转化为现实疫苗候选物的转化有限，这不仅反映了抗原的复杂性，还反映了缺乏标准化的挑战模型、统一的效力标准以及以临床为导向的开发流程 [12]。解决这些问题需要该领域就少数参考挑战模型（例如，II型ME49慢性感染模型和猫的卵囊挑战模型）以及所有疫苗研究中必须报告的最低限度的免疫学指标达成一致。7.5. 安全性考虑 对于孕妇和免疫功能低下者使用的疫苗，安全性始终是首要考虑因素。减毒活疫苗尽管具有高度免疫原性，但存在潜在风险，包括可能恢复毒力、减毒寄生虫的持久存在以及在免疫功能低下者中的禁忌症 [96]。即使是基因定义的减毒菌株也需要进行广泛的安全性评估。如第5.1节所讨论的，两个特定的CRISPR相关风险——脱靶基因组编辑和在猫科动物性周期中的基因交换导致的逆转——必须通过全基因组测序疫苗菌株并进行生产过程中的野生型弓形虫共感染禁止来解决。非活性疫苗平台提供了更好的安全性，但通常需要佐剂。7.6. 目标人群的监管和临床试验挑战 弓形虫疫苗开发的一个相对被忽视的方面是监管和临床试验路径。目前尚无获得许可的弓形虫疫苗，因此主要的监管机构（包括FDA和EMA）尚未正式接受任何验证的监管框架或保护性指标。这种缺乏先例的情况导致了几个相互关联的挑战。首先，对活体和基因修饰生物的分类是一个即时障碍。在大多数司法管辖区，减毒活体和CRISPR编辑的弓形虫菌株将被视为基因修饰生物，需要同时进行环境风险评估和标准疫苗安全性评估——这大大延长了开发时间线。其次，适当的临床终点尚未明确。由于无菌免疫被广泛认为不现实，因此必须确定实用性的终点——例如，在怀孕期间可测量的血清转化率下降或先天传播率的减少。监管机构、行业利益相关者和学术研究者之间尚未就这些终点达成共识，这构成了一个重要的转化瓶颈。两个最高优先级的人群——孕妇（和育龄妇女）和免疫功能低下者——在临床试验设计中面临独特的伦理和操作障碍。对于孕妇，传统的安慰剂对照试验在伦理上受到限制。采用孕前疫苗接种策略并进行妊娠结局的纵向随访是一个可行的替代方案，但这需要非常大的队列和延长的随访期。在高血清流行率的环境中（例如巴西、法国），上市后的实际效果研究可能比传统的三期试验更可行。对于免疫功能低下者（例如HIV/AIDS患者或移植受者），挑战包括在治疗选择有限时获得知情同意、选择合适的对照组（例如继续化疗与接种疫苗的比较），以及在主动免疫抑制期间管理疫苗失败的高风险。解决这些差距需要疫苗开发者和监管机构之间的早期和持续合作。8. 针对特定宿主的疫苗开发 采用“同一健康”方法针对弓形虫感染的疫苗开发，旨在针对传播周期中的多个环节。在猫科宿主体内，一种重组GRA12疫苗佐以ISA 201诱导了混合的Th1/Th2反应，减少了20-28%的卵囊排出，并将存活时间延长至60天 [97]。对于猪的应用，一种含有速殖子和缓殖子抗原以及Quil-A佐剂的新型灭活多阶段疫苗诱导了强烈的IgG和IFN-γ反应，导致肌肉组织中的寄生虫载量减少了≥95% [98]。减毒活的Pru: Δcdpk2菌株在猪体内引发了以Th1为主的保护性反应，促进了NK、γδ T和CD3αβ T细胞的扩增 [99]。对于羊的应用，基于植物的SAG1疫苗融合了植物HSP90佐剂，减少了病理反应并刺激了羔羊的相关免疫 [100]。从“同一健康”的角度来看，猫和家畜应被视为独立的但互补的疫苗目标。在猫身上，目标是阻断传播——特别是防止卵囊排入环境中，从而在源头中断寄生虫的性周期，并减少对所有下游宿主（包括人类）的环境污染。在牲畜（羊、猪、牛）身上，目标是减少肉中的组织囊肿负担，从而在肉类未煮熟时降低人类暴露于食源性病原体的风险。这两个目标需要不同的疫苗策略：猫的疫苗必须在感染后阻止卵囊排出（以每克粪便中的寄生虫数量来衡量），而牲畜的疫苗必须在屠宰时减少组织囊肿负担（通过定量PCR或肌肉组织组织学来衡量）。将这两种风险混为一谈、优化对任一目标都不理想的疫苗，以及区分这两种风险，能够使产品开发与公共卫生产生积极影响，并适应伴侣动物与食品生产物种不同的监管框架。9. 计算方法和计算机模拟研究 计算方法加速了疫苗抗原的发现和理性设计。通过对弓形虫细胞骨架的蛋白质组学筛查，发现了313种抗原蛋白，其中63种被IgM抗体识别，250种被IgG抗体识别，为未来的理性疫苗设计提供了优先抗原列表[101]。多项生物信息学分析确定了有前景的抗原，包括GRA10，预计其具有免疫原性且无过敏反应性，并含有大量B细胞和T细胞表位[102]；TgROP18具有良好的免疫原性和稳定结构；roptry neck蛋白TgRON9和TgRON10已被证实具有抗原性和可溶性[103]；ROP41则是一种无过敏反应性的免疫原性疫苗候选物[104]。多表位疫苗设计也取得了显著进展，例如[25]设计了结合GRA6和MIC3表位的疫苗，这些表位被认为具有高度免疫原性，并能强烈结合TLR2和TLR4。同样，Majidiani等人设计了TgVax452，这是一种针对SRS表面蛋白的表位疫苗，预计能强烈激活TLR4介导的先天免疫[105]。Li等人[106]通过全基因组筛查从膜蛋白中鉴定出了新的B细胞和T细胞表位，选择了14个预测具有高群体覆盖率的线性B细胞表位。这些计算方法使得从多种抗原中合理选择B细胞和T细胞表位成为可能，从而在最大化免疫原性的同时最小化构建物体积，为未来的疫苗开发提供了一种有前途的策略[106]。10. 未来展望和新兴技术 几种新兴技术和方法为推进弓形虫疫苗的开发提供了希望。CRISPR/Cas9等基因编辑工具的持续应用使得可以创建具有明确遗传修饰的减毒菌株，可能在安全性和免疫原性之间达到最佳平衡[31]。高通量筛选弓形虫中对毒力或生存至关重要的基因可能会发现新的减毒靶点或新的保护性抗原。针对COVID-19的mRNA疫苗平台的成功重新激发了将这项技术应用于寄生虫病的兴趣，mRNA稳定性的提高、脂质纳米粒配方的发展以及靶向递送技术的进步可能有助于开发有效且安全的弓形虫mRNA疫苗。自我扩增的mRNA疫苗能够在每剂使用时产生更多的抗原，代表了这一平台的一个有吸引力的发展方向[60]。免疫信息学和反向疫苗学方法使得能够理性设计结合多种抗原中优化过的B细胞和T细胞表位的多表位疫苗。机器学习和人工智能工具被用来预测免疫原性表位和最优疫苗结构。结合不同疫苗平台的初免-加强接种策略（例如，先使用DNA初免然后使用蛋白或VLP加强）显示出增强的免疫原性，并可能帮助克服单个平台的局限性。这种策略的一个有趣扩展是“初免-再激活”策略，用于慢性感染，首先建立对速殖子的基线免疫力，然后通过控制免疫抑制来理论上重新激活处于休眠状态的缓殖子，使其易于被特定的抗缓殖子抗体或治疗性血清靶向。虽然实验性尝试将感染动物从慢性状态转变为急性状态以测试疫苗效力仍有限，但这一概念作为潜在的治疗性接种方法值得进一步研究。黏膜接种途径通过肠道黏膜这一弓形虫的自然入侵点进行接种，除了诱导全身性免疫外，还可以通过诱导局部IgA反应提供更强的保护。采取“一个健康”（One Health）的方法，针对传播周期中的多个环节，包括中间宿主（食品动物）和终末宿主（猫），可能比单纯关注人类接种更有效。从兽医和公共卫生的角度来看，优先考虑动物接种是一种更为可行的策略，因为人类接种面临着巨大的心理接受障碍和更严格的监管要求。Toxovac在羊身上的成功应用证明了其在兽医领域的可行性，扩大在牲畜和伴侣动物中的疫苗接种计划可以通过从源头上减少环境和人畜共患病负担来实现“一个健康”的目标。减少食品动物体内的组织囊囊负担可以降低通过肉类消费的人类暴露风险，而防止猫排卵囊的疫苗可以减少环境污染。这种综合性的“一个健康”策略——同时针对猫、牲畜和人类——在图5中进行了说明，该图总结了“一个健康”框架内的互相关联的传播途径和干预点。采取兽医优先的方法提供了一种实用途径，通过降低暴露风险来保护人类健康，而不是仅仅依赖直接的人类医学干预，从而同时解决感染周期中的多个脆弱环节。图5. 通过疫苗接种控制弓形虫病的“一个健康”方法。(A) 终末宿主（猫）：接种疫苗以防止卵囊排出，从而在源头中断寄生虫的生命周期。(B) 中间宿主（牲畜和野生动物）：使用活减毒疫苗（如Toxovax用于羊）、蛋白亚单位疫苗或多抗原疫苗对食品生产动物（猪、羊、牛）进行接种，以减少组织囊囊负担。局限性包括安全性问题、对冷链的依赖以及较短的保质期，限制了在食品动物中的使用。(C) 人类健康策略：针对孕妇和育龄妇女预防先天性弓形虫病，以及针对免疫功能低下者预防病情复发。尽管存在巨大的未满足需求，但目前尚无获许可的人类疫苗。(D) 环境污染减少。猫的疫苗接种计划可以减少卵囊向环境中的排放，而牲畜的疫苗接种可以减少肉中的组织囊囊负担，从而降低因食用未煮熟肉类而导致的人类暴露风险。多抗原和多阶段策略正在研究之中。(E) 食品安全提升：对牲畜进行疫苗接种可以减少肉制品中的组织囊囊负担，直接提高食品安全性并降低因食用未煮熟肉类而导致的人类暴露风险。(F) 当前状况和展望：目前尚无人类疫苗可用；只有一种不够理想的兽医疫苗。新型平台（mRNA和VLPs）在临床前研究中显示出潜力。主要挑战包括实现无菌免疫。未来的发展方向强调免疫疗法、为高风险群体开发安全疫苗，以及将黏膜平台推进到临床试验中，这一切都在“一个健康”的综合框架内进行。创建于BioRender。Khan, M. Z. (2026) https://BioRender.com/18adzpd (2026年4月27日)。11. 结论 过去二十年来，弓形虫疫苗开发在抗原发现、免疫学理解和平台多样性方面取得了实质性进展，但在获许可的人类产品数量上进展相对有限。核心的未解决矛盾在于安全性和免疫原性之间的权衡：能够复制活病毒的疫苗平台可以实现广泛的多阶段免疫，但不能用于孕妇或免疫功能低下者；而非复制型平台虽然安全，但在历史上未能充分针对导致慢性感染和再激活的缓殖子生物学特性。解决这一矛盾需要三个方面的转变。首先，应在多抗原疫苗中刻意包含缓殖子阶段的抗原（BAG1、CST1、MAG1、SAG2Y、ENO1、LDH2），而不仅仅是依赖速殖子选择。其次，应将mRNA和佐剂亚单位平台作为近期实现人类接种的现实途径，这需要标准化挑战模型和统一的疗效评估标准。第三，明确采用差异化的“一个健康”策略，即优先在兽医领域进行疫苗接种——通过接种猫来阻断环境传播，同时接种牲畜以减少食源性负担——这与人类疫苗开发并行进行，而不是依赖于后者。我们认为，采取兽医优先、基于mRNA的技术，并关注缓殖子的策略是从临床前潜力到实际减少全球弓形虫病负担的最可行路径。要实现这一目标，监管机构需要接受至少两种动物物种（例如小鼠和猪或小鼠和猫）针对多种弓形虫菌株的稳健疗效数据；这些临床前要求的国际标准化将大大加速疫苗的转化过程。