基于多组学和机器学习技术对羊肉中特定品种挥发性风味化合物的特征分析

《Applied Food Research》：Characterization of breed-specific volatile flavor compounds in mutton based on multi-omics and machine learning

　　杨梦杰|李毅|苏传友|刘开桢|高彦浩|李文涛|徐慧芬|高腾云|傅彤|马森|孙宇|张天流
中国河南省郑州市河南农业大学动物科学技术学院，邮编450046

**摘要**
羊肉的风味在消费者偏好中起着关键作用，然而本土山羊品种间风味特征的描述仍有不足。本研究旨在通过结合挥发组学和非靶向脂质组学技术，阐明淮山羊（HG）和 Funiu 白山羊（FWG）肉质中的挥发性化合物和脂质组成差异，并探讨这些分子成分之间的潜在关联。采用十种机器学习（ML）模型来识别用于区分羊肉来源的潜在生物标志物。比较分析显示，HG 的剪切力和肌内脂肪（IMF）含量显著高于 FWG（P < 0.01）。挥发组学分析检测到 834 种挥发性化合物，其中 43 种已知差异性挥发性化合物（DVCs，VIP ≥ 1，P < 0.05）是导致两种山羊品种风味差异的主要原因。脂质组学分析鉴定出 2,490 种脂质代谢物，这些代谢物被系统分类为 37 个类别，其中 106 种差异性脂质分子（DLMs，VIP ≥ 1，P < 0.05）是主要的风味前体，主要源自磷脂乙醇胺（PE）和磷脂胆碱（PC）。此外，机器学习模型确定了一组 13 个具有强区分能力的生物标志物（6 种挥发性化合物和 7 种脂质代谢物），用于精确区分羊肉来源。这些发现为 HG 和 FWG 羊肉的挥发组学和脂质组学特征提供了全面描述，为中国本土羊肉品种的精准鉴定提供了宝贵见解。

**1. 引言**
风味作为重要的感官属性，显著影响消费者的偏好和满意度（Juhrich 等，2025；Moyes 等，2025）。肉的风味来源于热处理过程中产生的挥发性化合物和非挥发性风味化合物，这些化合物共同决定了其感官特征（Indriani 等，2024；Quan 等，2025）。这些挥发性化合物是通过脂质和低分子量水溶性前体在热处理过程中的复杂生化转化产生的（Saengsuk 等，2024）。脂质在决定生肉气味和熟肉风味方面起着关键作用，主要通过脂质氧化和美拉德反应（Fu 等，2022；Zhou 等，2025；Wu 等，2025）。脂质的热氧化敏感性主要受 IMF 含量、脂肪酸组成和分子结构构象的影响（Bassam 等，2022；Su 等，2025）。近期研究表明，较高的 IMF 含量与更强的肉味强度正相关，而较低的 IMF 水平则限制了风味前体的可用性（Hou 等，2023；Lebedová 等，2022；Ma 等，2023）。此外，脂肪酸的位置分布（Sn-1 位置为饱和脂肪酸，Sn-2 位置为不饱和脂肪酸）对甘油基脂质的热氧化稳定性至关重要（Chen 等，2020）。因此，全面描述肉的脂质组成对于阐明风味形成机制至关重要。
随着健康意识的提高以及消费者对其营养价值、感官属性和独特风味的关注，羊肉消费量稳步增加（Henchion 等，2021；Wang，2022）。为了解释羊肉品质的决定因素，大量研究集中于羊和山羊的物理化学性质、饲料类型和生产管理的比较分析（Dou 等，2023；Hoa 等，2025；Zhang 等，2022）。关于风味前体的研究主要关注 IMF 含量、氨基酸组成和加工技术（Realini 等，2021；Su 等，2025）。例如，Hastie 等（2022）发现湿熟和干熟羊肉之间存在明显风味差异，湿熟样品中的 1-辛烯-3-酮含量较高，而干熟样品富含吡嗪化合物。Li 等（2023）确定 γ-壬内酯是淮山羊和 Tan 山羊肉之间挥发性化合物的主要差异因子。Aung 等（2023）报告称，对韩国本土黑山羊进行去势处理可减少山羊肉味，提高感官接受度。中国本土羊肉具有通过长期自然选择和人工选择形成的独特特征（Liu 等，2019）。HG 主要分布在平原地区，以其 tender 的肉质和较低的山羊肉味而闻名；FWG 则分布在丘陵地区，表现出较强的适应性和细腻的肉质（Han 等，2025；Li 等，2023；Zhang 等，2020）。然而，其卓越感官品质的形成机制和地理真实性鉴定仍不完全清楚。因此，全面分析挥发性化合物和脂质化合物对于识别生物标志物和建立羊肉真实性验证框架至关重要。
鉴于代谢组数据的复杂性和传统分析方法的局限性，机器学习算法已成为通过多组学数据整合发现生物标志物的强大工具（Dakal 等，2024；Huang 等，2025；Reel 等，2021）。多种机器学习方法的结合不仅提高了数据分析的精确度，还简化了预测建模过程，同时减少了主观偏见（Picard 等，2021；Stahlschmidt 等，2022）。例如，Chu 等（2023）将机器学习与中红外光谱结合，用于区分和量化牛奶掺假，支持向量机、贝叶斯正则化神经网络和投影追踪回归均表现出稳健的性能。Du 等（2024）使用四种机器学习模型识别影响山羊奶肽抗氧化活性的关键分子特性，从而筛选潜在的生物标志物候选物。同样，Li 等（2025）应用五种机器学习模型对禽蛋类型进行分类并识别生物标志物，发现九种与脂肪酸、PE、PC 和甘油三酯（TAG）相关的重要风味化合物。尽管机器学习模型在处理复杂数据方面表现出色，但其在识别羊肉品种鉴别生物标志物方面的应用仍需进一步探索。
因此，本研究分析了 HG 和 FWG 羊肉的挥发性化合物和脂质组成，并构建了机器学习分类模型以识别区分这两种山羊羊肉的潜在生物标志物。此外，还进行了相关性分析，以探讨肉质特征、风味化合物和脂质代谢物之间的关系，为进一步研究地理因素对羊肉风味形成的影响提供了理论基础。

**2. 材料与方法**
**2.1. 动物准备和样品采集**
本研究方案获得了河南农业大学动物科学研究所动物伦理委员会的批准，所有实验程序均符合该校的动物研究指南（批准号 HNND2024031204）。共饲养了二十只雌性山羊（HG，n = 10；FWG，n = 10），在自然光照条件下自由饮水。经过 7 天的适应期后，所有山羊进行了为期 120 天的正式实验。它们每天喂食三次标准化饲料，饲料中含有 17.11% 的粗蛋白、39.00% 的中性洗涤纤维、24.99% 的酸性洗涤纤维、0.96% 的钙和 0.45% 的磷（饲料成分详见表 1）。所有动物被 transportation 到当地商业屠宰场，并按照标准程序进行人道屠宰。禁食一夜后（仍可自由饮水），在放血前对山羊进行麻醉。从每只宰杀后的山羊左侧第 9 至第 11 肋骨之间的最长背肌（longissimus dorsi）中采集样本。样本立即在液氮中速冻用于脂质组学和挥发性化合物分析，同时保留约 100 克新鲜组织用于肉质特性评估。

**表 1. 实验饲料的成分组成和营养值（% DM 基准）**
| 成分 | 比例，% | 营养值 |
| ---- | ---- | ---- |
| 花生草 | 31.80 | 能量（MJ/kg） | 11.41 |
| 稻草 | 17.20 | 粗蛋白（%） | 17.11 |
| 大豆粕 | 6.62 | 中性洗涤纤维（%） | 39.00 |
| 玉米 | 19.87 | 酸性洗涤纤维（%） | 24.99 |
| 小麦麸皮 | 13.25 | 钙（%） | 0.96 |
| 棉籽粕 | 5.30 | 磷（%） | 0.45 |
| 碳酸氢钙 | 1.32 | 碳酸氢钠 | 0.66 |
| 预混合物（微量元素、多种维生素、 Monensin、离子平衡剂、生长因子） | 3.97 | 总计 | 100.00 |

**2.2. 肉质检测**
选择每种品种的所有动物进行肉质特性检测，包括 pH 值、滴水损失、烹饪损失、剪切力和 IMF 含量。使用校准的 pH 计（Hanna Instruments，美国）在死后 24 小时测量羊肉样本的 pH 值，每份样本记录三次读数，平均值用于分析。IMF 含量通过 Soxtec? 2050 自动分析仪（FOSS Analytical，丹麦）的醚萃取法测定，以湿肌肉重量的百分比表示。滴水损失百分比通过在 4°C 条件下储存 24 小时后测量样品（1 cm × 1 cm × 2 cm）的重量减少来确定。烹饪损失则是将样品（1 cm × 1 cm × 2 cm）在 85°C 水浴中煮沸 20 分钟后，按相对于初始样品重量的百分比计算。此外，使用 Warner-Bratzler 剪切力（WBSF）机器在 80°C 水浴中煮至内部温度达到 70°C 后测量羊肉的嫩度。

**2.3. 挥发性化合物分析**
使用顶空固相微萃取（HS-SPME）结合气相色谱-质谱（GC-MS；NX 2030 系统）分析羊肉样本中的挥发性化合物。将羊肉样本在液氮中研磨成粉末，取 2 克样品放入 20 mL 的顶空瓶中。在 SPME 纤维插入前，将样品瓶在 60°C 下平衡 15 分钟。然后将纤维在 60°C 下暴露于顶空 30 分钟。萃取后，将纤维在 GC 装置（Model 8890；Agilent）中以 250°C 热脱附 5 分钟，以便进行后续的 GC-MS 分析。挥发性化合物的鉴定和定量使用 DB-Wax 柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，美国）在 Agilent Model 8890 GC-MS 系统中进行。氦气载气流速保持为 1.2 mL/min。注射口和检测器温度分别保持在 250°C 和 280°C。烤箱温度程序从 40°C 开始，经过三个升温阶段：10°C/min 至 100°C，7°C/min 至 180°C，以及 25°C/min 至 280°C，持续 5 分钟。质谱数据采用电子电离（EI）模式在 70 eV 下采集。四极杆、离子源和传输线的温度分别保持在 150°C、230°C 和 280°C。化合物的鉴定和定量采用选择性离子监测（SIM）模式。使用 R 软件（v.4.1.1，Worley 等，2016）通过无监督主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）进行聚类和可视化。基于投影重要性（VIP）≥ 1，P < 0.05，识别出品种间的显著 DVCs。使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库（https://www.genome.jp/kegg/）对 DVCs 进行功能注释和途径富集分析。

**2.4. 非靶向脂质组学分析**
使用超高效液相色谱结合 Orbitrap 质谱（UPLC-Orbitrap MS，Thermo Scientific）对每种品种的羊肉样本进行脂质组学分析。对于脂质提取，将约 60 mg 羊肉样本在 600 μL 的氯仿：甲醇（2:1，v/v）溶液中匀浆。涡旋混合后，样品以 12,000 rpm 的速度离心 15 分钟（4°C）。小心收集有机相（下层氯仿层）并在氮气流下蒸发。所得脂质提取物以干 pellets 的形式存储在 -80°C 下，以备后续分析。分析在 Full Scan-MS2 模式下进行，优化电喷雾离子化（ESI）参数：喷射电压分别为 +3.0 kV（正）和 -2.8 kV（负），鞘气流量为 60 arb（350°C 加热器温度），辅助气流量为 10 arb，毛细管温度保持在 320°C。质谱数据使用 Xcalibur 4.1 软件（Thermo Fisher Scientific）采集，前体离子和产物离子的质量容忍度均为 5 ppm，产物离子强度阈值为 5%。后续数据分析和脂质鉴定使用 LipidSearch 软件（Thermo Fisher Scientific）进行，相对定量通过标准化峰面积的比较分析确定。使用 MetaboAnalyst 6.0（Pang 等，2024）通过 PCA 进行无监督模式识别和 OPLS-DA 进行监督模式建模。基于 VIP ≥ 1.0 识别出具有统计意义的 DLMs（P < 0.05，Student’s t-test），并结合倍数变化（FC）≥ 1.5 或 FC ≤ 0.67 进行潜在生物功能分子的筛选。

**2.5. 使用机器学习进行羊肉分类**
对所有特征（DLMs/DVOCs）进行标准化处理，以确保可比性并提高模型稳定性。评估了十种不同的机器学习算法以识别潜在的品种分类标志物化合物：（1）随机森林，（2）梯度提升，（3）基于核的支持向量机（SVM_Kernel），（4）逻辑回归，（5）k-最近邻（KNN），（6）偏最小二乘（PLS），（7）人工神经网络（ANN），（8）线性判别分析（LDA），（9）套索回归（Lasso Regressions），（10）自适应提升（AdaBoost）。每种算法的详细参数配置如下：随机森林使用500棵决策树，基于Gini不纯度分裂准则；梯度提升算法配置为100次迭代，最大树深度为3，学习率为0.1，列子采样比为0.7；SVM采用径向基函数核，并自动调整正则化参数；逻辑回归使用最大似然估计，不进行正则化；KNN通过交叉验证确定最佳邻居数量；PLS自动选择潜在成分的数量；ANN具有一个隐藏层，使用Sigmoid激活函数和权重衰减正则化；LDA假设各类别的协方差矩阵相同；套索回归通过L1正则化自动选择特征；AdaBoost使用决策树桩作为弱学习器，迭代次数为50次。所有机器学习模型算法均使用caret包实现，训练迭代100次，数据集中训练集占80%，测试集占20%。性能通过多个指标严格评估：准确性、敏感性、特异性、阳性/阴性预测值（PPV/NPV）、F1分数和召回率分数。每种机器学习分类模型都生成了接收者操作特征（ROC）曲线。为了识别区分两种山羊品种的稳健生物标志物，我们首先选择了在训练集和测试集上都表现出完美分类准确性的最佳模型（准确率=1.00）。随后，我们使用shapviz包（v.10.2）进行Shapley加性解释（SHAP）分析，以通过全局特征解释提高模型的可解释性，并按相对重要性对特征进行定量排名。候选生物标志物是通过交叉验证确定所有模型中最重要的前20个特征来识别的，以确保具有品种特异性区分能力。

2.6 统计分析
所有统计分析均以个体动物作为实验单位进行。品种被视为固定效应，两种品种之间的差异使用独立样本t检验进行评估。肉质特性数据以平均值±标准差（SD）表示。在分析之前，使用Shapiro-Wilk检验评估数据的正态性，使用Levene检验评估方差的同质性。由于本研究中只包括两个品种，因此不适用事后多重比较。P值使用单因素方差分析（ANOVA）和Student’s t检验进行成对比较。通过计算皮尔逊相关系数来评估肉质特性、挥发性化合物和脂质代谢物之间的关系。星号表示不同的显著性水平（*P ≤ 0.05，**P ≤ 0.01，***P ≤ 0.001）。

结果与讨论
3.1 肉质特性分析
肉质的物理化学性质，包括IMF含量、pH值、滴水损失、烹饪损失和剪切力，是决定消费者接受度和整体羊肉可口性的关键质量属性（Ma等人，2025；Prache等人，2022）。IMF含量是羊肉风味形成的基础，因为它直接影响挥发性化合物和脂质分布（Wang等人，2022）。在本研究中，HG羊肉的IMF含量显著高于FWG羊肉（P < 0.001），表明在脂肪生成或脂质沉积途径上存在品种特异性差异。多汁性是一个关键的感觉属性，与持水能力正相关，后者取决于肌肉纤维的结构完整性和渗透压的平衡（Hossain等人，2023；J. Liu等人，2022）。为了评估羊肉的持水能力，测量了HG和FWG样本的滴水损失百分比。虽然HG羊肉的滴水损失低于FWG羊肉，但差异没有统计学意义（P > 0.05）（表2）。此外，还确定了烹饪损失百分比以评估肉的多汁性。如表2所示，HG组的平均烹饪损失百分比为61.58 ± 2.77%，而FWG组为59.67 ± 5.66%，两种品种之间没有统计学上的差异（P > 0.05）。这些发现表明两种品种都具有良好的持水能力，可能提高了肉的多汁性。屠宰后，由于糖酵解代谢和H+离子的积累，肉的pH值会逐渐下降（Prache等人，2020）。HG羊肉的24小时pH值高于FWG羊肉（P < 0.001），这一现象可能归因于较慢的糖酵解速率或屠宰前糖原储备的减少。HG羊肉的剪切力显著高于FWG羊肉（P < 0.001）。我们的发现支持了先前的研究，表明升高的肉pH值与增加的剪切力值之间存在关联，这可能是由于在较高pH值下蛋白水解活性降低（Coria等人，2022）。

表2. HG和FWG羊肉之间的肉质特性比较
项目 HG FWG
P值 6.87±0.24a 6.45±0.19b <0.001
滴水损失（%） 1.7±1.26b 2.84±2.74a 0.124
烹饪损失（%） 61.58±2.77 59.66±5.66 0.174
剪切力（N） 45.62±20.91a 10.32±1.02b <0.001
IMF含量（g/100g） 4.71±1.39a 1.91±0.03b <0.001a,b
同一行中不同字母的均值具有显著差异（P < 0.05）。数据以平均值±标准差（n = 10）表示。HG：淮山羊；FWG：Funiu白山羊。

3.2 HG和FWG羊肉之间的挥发性化合物比较
挥发性化合物是肉 flavor 的关键决定因素，来源于死后老化过程中的脂质氧化、氨基酸分解代谢和微生物代谢（Park等人，2025）。在本研究中，我们使用顶空GC-IMS在羊肉中检测到834种挥发性化合物。经过严格的质量控制程序，包括偏差分析、缺失值过滤和数据标准化后，我们确定了712种可靠的挥发性化合物进行后续分析（补充材料表S1）。这些挥发性化合物被分为七个超级类别：有机酸及其衍生物（39.53%）、脂质和类脂质分子（25.58%）、有机氧化合物（11.63%）、苯类化合物（4.65%）、核苷、核苷酸及其类似物（2.33%）、苯丙素和多酮类（2.33%）以及其他（13.95%）（图1 A）。在羊肉中检测到的挥发性化合物超级类别与以往的研究结果一致，证实了我们方法学的可靠性（Xu等人，2025）。类别水平显示，羧酸及其衍生物在羊肉中的相对丰度最高，占总量的34.88%，其次是脂肪酰基（20.93%）。PCA显示前两个主成分解释了总方差的38%（图1 B），HG和FWG样本明显聚类。值得注意的是，HG和FWG样本明显分开，暗示了品种间的独特差异特征。
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图1. HG和FWG羊肉之间的挥发性风味化合物谱。（a）基于超级类别和类别水平的挥发性风味化合物百分比。（b）所有羊肉样本的PCA。（c）HG和FWG羊肉之间挥发性风味化合物的火山图。x轴代表log2（折叠变化）值，y轴表示-log10（P值）值。下调的挥发性化合物用蓝色节点表示，上调的挥发性化合物用红色节点表示。（d）所有羊肉样本中已知命名DVC的热图。（e-f）HG和FWG羊肉中天冬氨酸1和缬氨酸的箱形图。（g）DVC的功能富集分析。

为了识别能够区分羊肉品种来源的潜在挥发性化合物，我们构建了OPLS-DA模型，并通过该程序生成的VIP分数进行了估计。在VIP ≥ 1和P < 0.05的条件下，我们获得了85种DVC，包括37种上调和48种下调的DVC，作为两组分类的潜在标记（图1 C）。为了探索DVC的功能相似性，层次聚类结果显示了43种已知命名DVC的表达模式（图1 D）。例如，某些化合物在HG羊肉中显著丰富（P < 0.05），可能是由于氨基酸分解代谢增强或蛋白质合成减少（图1 E）。HG羊肉中的缬氨酸水平较低（P < 0.05），可能反映了通过支链氨基酸（BCAA）转氨酶活性的增加分解产生风味活性醛类（图1 F）。功能富集分析表明，这些DVC参与柠檬酸循环（TCA循环）（chx00020）、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（chx00250）、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成（chx00290）、氨基酰-tRNA生物合成（chx00970）以及甘油酸和二羧酸代谢（chx00630）（图1 G）。

3.3 HG和FWG羊肉之间的脂质谱比较
脂质是挥发性化合物的关键前体，通过脂质氧化、酶促水解和热降解显著影响肉的风味形成（Fu等人，2022；Shahidi等人，2022）。为了阐明HG和FWG羊肉之间的品种特异性脂质组学差异，我们进行了基于LC-MS/MS的非靶向脂质组学分析，共鉴定出2,490种脂质（正模式下976种，负模式下1,514种）（补充材料表S2）。PCA得分显示质量控制样本聚在一起，表明数据和分析方法的稳定性（图2 A）。值得注意的是，HG和FWG样本明显分开，表明由遗传或代谢差异驱动的品种特异性脂质谱（图2 B）。为了进一步阐明导致品种差异的脂质类别，2,490种脂质被系统地分为37个脂质类别。图中展示了羊肉中每种脂质类别的数量（图2 C）。PC类在羊肉中的相对丰度最高，占18.19%，其次是甘油三酯（TG，17.79%）和磷脂乙醇胺（PE，14.54%）。PC类作为主要的膜成分，调节膜流动性和信号转导，而其代谢物（如溶血磷脂酰胆碱）参与炎症反应和脂质代谢（Yamamoto等人，2021）。TG和二酰甘油（DG）作为能量储备，其水解释放多不饱和脂肪酸（PUFAs），如亚油酸（C18:2）和花生四烯酸（C20:4），这些是风味活性醛类和酮类的前体（X. Han等人，2021）。CerG3GNAc2和Hex3Cer在HG羊肉中的含量显著降低（P < 0.05），而CerP和磷脂酸（PA）含量升高（P < 0.05）（图2 D）。Hex3Cer在大脑老化过程中的积累表明其在细胞应激反应中的作用（Tsugawa等人，2024），而CerP通过Akt/mTOR信号通路调节细胞凋亡和炎症（Pokrovsky等人，2023）。HG羊肉中较高的CerP可能反映了增强的抗凋亡机制或改变的鞘脂代谢。

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图2. HG和FWG羊肉之间的脂质组谱。（a）质量控制样本和所有羊肉样本的脂质分子PCA。（b）HG和FWG羊肉样本的lipid分子OPLS-DA。（c）羊肉样本中每种脂质类别的数量和百分比。（d）HG和FWG羊肉之间脂质分子丰度的箱形图。（e）HG和FWG羊肉之间DLMs的火山图。x轴代表log2（折叠变化）值，y轴表示-log10（P值）值。下调的脂质分子用蓝色节点表示，上调的脂质分子用红色节点表示。（f）DLMs的网络图。黄色圆圈代表核心调节分子。线条的颜色表示相关性。橙色表示正相关，蓝色表示负相关。
为了进一步分析HG和FWG羊肉之间的脂质分子水平差异，我们使用VIP值≥1、P值<0.05的条件检测到了106种DLMs。我们进一步根据FC > 1.5或FC < 0.67确定了57种潜在的生物功能分子（图2 E，补充材料表S2）。为了理解DLMs之间的调节关系，相关性分析表明PC（18:2_18:2）、PE（18:0e_20:4）和PE（16:1e_18:1）起着核心调节作用（图2 F）。PC（18:2_18:2），一种富含亚油酸的磷脂，是脂氧合酶介导氧化的底物，生成与“草腥”或“腐臭”气味相关的己醛和其他挥发性化合物（Manzi等人，2023）。其在HG羊肉中的较高丰度可能有助于形成品种特有的风味谱。PE（18:0e_20:4）属于一种甘油磷脂，它可以与sn-1和sn-2位置的不同长度和饱和度的脂肪酸相连（Xiong等人，2022）。因此，脂质显著影响挥发性化合物的形成和释放，成分差异可能解释了HG和FWG羊肉之间不同的脂质谱。

3.4 HG和FWG羊肉之间潜在生物标志物化合物的筛选
ML模型已广泛用于多种食品的地理认证和掺假检测，包括鸡蛋（Li等人，2025）、牛肉（Mazola等人，2023）、羊肉（Liu等人，2024）、柑橘（Karabagias等人，2023）、橄榄油（Nanou等人，2023）、姜黄和ashwagandha（Ratnasekhar等人，2025）。最近的进展表明，将ML与多组学方法（如代谢组学、脂质组学、宏基因组学）相结合可以提高生物标志物的发现和食品真实性评估（Bai等人，2025）。为了识别能够区分HG和FWG羊肉品种的挥发性化合物和脂质代谢物，我们在预处理了挥发性和脂质组数据集后，使用机器学习（ML）模型来筛选潜在的生物标志物。评估了十种ML算法，其中七种算法——包括判别模型、套索回归、邻域方法、神经网络、PLS模型、随机森林和SVM核——在训练和验证数据集中的表现均优于其他方法（表3）。ROC分析结果显示，上述七种ML模型在挥发性化合物和脂质代谢物方面具有更好的AUC、敏感性和特异性（图3 A-B）。因此，这些模型被选为后续生物标志物识别的参考方法，以区分两种品种的羊肉。表3. 比较了十种ML模型在HG和FWG之间的预测多项指标结果。模型 数据集 敏感性 特异性 准确率 阳性预测率 阴性预测率 召回率 DLMs DVCs DLMs DVCs DLMs DVCs DLMs DVCs DLMs DVCs DLMs DVCs DLMs DVCs DLMs DVCs 适应性提升 训练集 0.83 0.75 0.71 0.75 0.77 0.75 0.71 0.75 0.83 0.75 0.77 0.75 0.55 0.5 验证集 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 判别模型 训练集 1 1 1 1 1 1 1 1 验证集 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 梯度提升 训练集 0.88 0.88 0.75 0.88 0.81 0.88 0.78 0.88 0.86 0.88 0.82 0.88 0.63 0.75 验证集 1 1 1 1 1 1 1 1 套索回归 训练集 1 1 1 1 1 1 1 1 验证集 1 1 1 1 1 1 1 1 逻辑模型 训练集 0.38 0.50 0.63 0.63 0.50 0.50 0.57 0.50 0.56 0.43 0.53 0.13 验证集 0.50 0.51 0.50 0.75 0.50 0.50 0.67 0.50 0.50 0.50 邻域方法 训练集 1 1 1 1 1 1 1 验证集 1 1 1 1 1 1 1 神经网络 训练集 1 1 1 1 1 1 1 验证集 1 1 1 1 1 1 1 PLS模型 训练集 1 1 1 1 1 1 1 验证集 1 1 1 1 1 1 1 随机森林 训练集 1 1 1 1 1 1 1 验证集 1 1 1 1 1 1 1 SVM核 训练集 1 1 1 1 1 1 1 验证集 1 1 1 1 1 1 1 1 下载：下载高分辨率图片（903KB） 下载：下载全尺寸图片 图3. 基于ML的HG和FWG羊肉之间潜在生物标志物化合物的筛选。(a-b) 挥发性化合物(a)和脂质分子(b)的ML模型ROC分析。(c-d) 根据七种ML模型，通过维恩图显示检测到的挥发性化合物(c)和脂质分子(d)的潜在生物标志物化合物数量。(e-f) HG和FWG羊肉之间挥发性化合物(e)和脂质分子(f)生物标志物丰度的箱形图。为了进一步评估每个输入特征在模型中的重要性，我们进行了SHAP分析并确定了挥发性化合物和脂质代谢物中的前20个生物标志物。为了提高可靠性并减少假阳性，我们采用了共识方法，提取了跨模型识别的特征的交集。该策略揭示了七个关键的脂质代谢物（CL(18:2_18:1_18:1_18:2)、PC(16:0_20:3)、PC(18:2_18:2)、PE(14:1e_22:0)、PE(16:1e_20:3)、PE(18:1e_20:2)、PE(20:3e_17:1）以及六种挥发性风味化合物（4-cholesten-3-one、pelargonic acid、valine、isoleucine、2-amino-2-norbornanecarboxylic acid 2、zymosterol 1）（图3 C-D）。使用箱形图可视化了所识别挥发性化合物和脂质代谢物的标准化表达水平，揭示了不同羊肉来源之间十三个筛选标志物的显著差异（P < 0.05）（图3 E-F）。值得注意的是，valine、isoleucine、2-amino-2-norbornanecarboxylic acid 2和zymosterol 1在FWG中的表达显著较高，而其余生物标志物在HG中更丰富。这些发现表明这些代谢物可能作为区分羊肉品种来源的潜在生物标志物。3.5. 特征肉质性状、风味化合物和脂质代谢物的相关性分析相关性分析是识别肉质性状、挥发性化合物和脂质代谢物之间显著关联的强大工具，特别是在阐明塑造羊肉风味特征的脂质衍生物前体方面（Li等人，2023）。为了研究脂质代谢物对HG和FWG羊肉中挥发性风味化合物形成的影响，我们分析了VIP得分最高的20个DLMs和DVCs。脂质代谢物和肉质性状的相关性分析表明，CerP (m45:7)、PC (16:0_18:1)、PE (16:1e_18:1)、PE (18:1e_18:1) 和 TG (16:1_14:0_18:1) 与IMF和剪切力呈显著正相关（P < 0.05）（图4 A）。这些发现表明这些脂质可能通过其在膜流动性及能量储存中的作用，影响鸡肉的嫩度和脂肪沉积（Wang等人，2025）。相反，Hex1Cer (t18:0_18:1)、PC (18:1e_18:2)、PC (16:0e_18:2)、PC (16:0_18:2) 和 PS (20:0e_18:2) 与pH、IMF和剪切力呈负相关（P < 0.05），表明它们可能参与死后的糖酵解和蛋白水解，从而影响肉质和保水能力（Johnson LG等人，2023）。挥发性化合物和肉质性状的相关性分析显示，myo-inositol和gluconic lactone 2与pH、IMF和剪切力呈强负相关（P < 0.05）（图4 B）。相比之下，palmitoleic acid、pelargonic acid、N-formyl-L-methionine 2与这些性状呈正相关（P < 0.05）。脂质代谢物和风味化合物的相关性分析显示，五种PE（如PE (18:2e_18:1)、PE (18:0p_18:2)、PE (34:0e)、PE (39:3e) 和 PE (14:0e_23:0）与arachidonic acid和valine呈强正相关，而这些与benzoic acid呈强负相关（P < 0.05）（图4 C）。这些结果与之前的研究一致，表明含有PE的不饱和脂肪酸（UFA）会发生多不饱和链的氧化降解（Zhao等人，2021）。此外，N-Methyl-DL-alanine与两种PE（PE (16:1e_18:1) 和 PE (18:1e_18:1)、两种PC（PC (16:0_18:1) 和 PC (16:1e_18:1)）、CerP (m45:7) 和 TG (16:1_14:0_18:1）呈负相关，而palmitoleic acid与这些脂质代谢物呈正相关。这些结果共同证明了不同羊肉品种中挥发性化合物、脂质代谢物和肉质性状之间的显著关联。尽管这项研究提供了关于HG和FWG羊肉之间挥发性和脂质组差异的宝贵见解，但其发现受样本量有限和静态肉质评估的限制，可能忽略了风味发展的动态变化。尽管基于共识的ML方法旨在减少偏差，但外部验证仍然是必要的。挥发性化合物和脂质组成之间观察到的相关性缺乏因果确认，这突显了进行机制研究的必要性。未来的研究应优先考虑多品种验证、综合组学分析和感官测试，以推进羊肉真实性框架的发展。下载：下载高分辨率图片（691KB） 下载：下载全尺寸图片 图4. 羊肉中肉质性状、挥发性化合物和脂质代谢物之间的相关性分析。(a) 肉质性状与挥发性化合物的相关性分析。(b) 肉质性状与脂质代谢物之间的相关性分析。(c) 挥发性化合物与脂质代谢物之间的相关性分析。颜色渐变对应于相关系数，其中红色表示正相关，蓝色表示负相关。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。4. 结论本研究进行了全面的挥发性和非靶向脂质组分析，比较了HG和FWG羊肉的挥发性化合物谱型和脂质组成。HG羊肉表现出显著较高的剪切力和IMF含量，而FWG羊肉的死后pH值较低。结合ML模型，确定了六个关键的挥发性风味化合物和七个脂质代谢物生物标志物，以区分羊肉的品种来源。这些结果突显了特定脂质（如CerP、TG、PC和PE）在风味和肉质性质形成中的关键作用。这项工作有助于表征HG和FWG中的挥发性风味化合物，为羊肉真实性验证提供了基础。未来利用新兴技术并涵盖更广泛的品种多样性的研究无疑将增强对羊肉来源验证和掺假筛查的知识基础。伦理声明 - 人类和动物的研究所有动物程序均按照中国政府农业部门规定的动物保护和福利指南进行。实验设计和程序得到了河南农业大学动物科学研究所动物伦理委员会的批准，批准号为HNND2024031204。CRediT作者贡献声明Mengjie Yang：撰写——原始草稿、撰写——审阅与编辑、正式分析。Yi Li：调查、方法学、正式分析。Chuanyou Su：调查、方法学。Kaizhen Liu：方法学、数据管理。Yanhao Gao：调查、方法学。Wentao Li：调查、方法学。Huifen Xu：调查、方法学。Tengyun Gao：监督、调查、概念化。Tong Fu：监督、调查、概念化。Sen Ma：资金获取、资源、方法学。Yu Sun：资源、监督、正式分析。Tianliu Zhang：监督、撰写——审阅与编辑、项目管理、资金获取。利益冲突声明作者声明没有竞争性财务利益。数据可用性数据将应要求提供。伦理声明伦理批准和参与同意所有动物程序均按照中国政府农业部门规定的动物保护和福利指南进行。实验设计和程序得到了河南农业大学动物科学研究所动物伦理委员会的批准，批准号为HNND2024031204。未引用的参考文献Li等人，2023CRediT作者贡献声明Mengjie Yang：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、正式分析。Yi Li：方法学、调查、正式分析。Chuanyou Su：方法学、调查。Kaizhen Liu：方法学、数据管理。Yanhao Gao：方法学、调查。Wentao Li：方法学、调查。Huifen Xu：方法学、调查。Tengyun Gao：监督、调查、概念化。Tong Fu：监督、调查、概念化。Sen Ma：资源、方法学、资金获取。Yu Sun：资源、监督、正式分析。Tianliu Zhang：监督、撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、监督、资金获取。