阿尔及利亚干旱和半干旱土壤中的微生物多样性与功能潜力：一项宏基因组学研究

《Applied Food Research》：Microbial Diversity and Functional Potential of Arid and Semi-Arid Soils in Algeria: A Metagenomic Approach

　　梅里姆·盖卢特|哈尼·贝尔哈吉|阿特夫·贾瓦尼|秉勋·郑|贤乔·安|穆罕默德·赖什|亚辛·本盖尔巴
突尼斯大学科学学院，突尼斯应用生物科学高等研究所，突尼斯埃尔马纳尔大学，Zouhair Essafi路9号，1007突尼斯，突尼斯

**摘要**
尽管干旱和半干旱地区覆盖了地球陆地面积的40%以上，但其微生物多样性和适应机制仍然知之甚少。这一问题在阿尔及利亚尤为突出，以往的研究主要集中于有限的生态方面，并使用了不同的测序深度，导致像贾内特这样的地区基本未被探索。本研究旨在这些环境中（特别是塞提夫和贾内特），调查这些恶劣条件下的微生物群落结构和功能。通过标准方法分析了土壤样本的物理化学性质，包括pH值、电导率和元素组成。利用16S rRNA基因扩增子测序（Illumina MiSeq V3–V4）技术，揭示了详细的微生物谱型。在不同地点发现了显著差异（p < 0.05），尤其是在碳酸钙、有机物和钙离子含量方面。测序共获得255,206条高质量读段，鉴定出27个门、71个纲、151个目、205个科、353个属和7,409个物种。放线菌和绿弯菌占主导地位，同时也有酸微生物和热菌的存在。未经分类的放线菌属（AKIW781，占比15.2%）在RM2（塔西利贾内特）和RM3（埃尔奥里西亚森林）中最为常见，而诺卡菌属（Nocardioides）在RM1（贾内特绿洲）中占比为5.35%。RM1中出现了独特的属如Skermanella和Agromyces，而Bacillus则主要分布在RM2中。α多样性在RM1最高，而在RM2和RM3中较低。总体而言，该研究突显了这些地区间微生物多样性、基因潜力和土壤性质的显著差异。β多样性分析表明，不同地点的微生物群落具有明显差异，RM1的微生物组成独特。功能预测工具（如PICRUSt和KEGG通路）显示，在这些干旱区域，微生物代谢途径倾向于抗氧化产物生成和渗透调节，这对极端条件下的生存至关重要。值得注意的是，沿干旱梯度的功能变化表明RM1具备支持沙漠-绿洲过渡的独特适应特性。本研究为阿尔及利亚干旱地区的微生物资源开发提供了重要数据，并加深了对极端环境中微生物适应机制的理解。

**1. 引言**
地球表面相当大的一部分由干旱、半干旱和极干旱地区组成，在这些地区，生命受到极端环境压力的影响，包括水资源匮乏、高太阳辐射、温度波动和养分有限的土壤（Alsharif等，2020）。这些条件形成了独特的生态系统，其中微生物群落在维持生态平衡、支持养分循环、土壤肥力和气候调节方面发挥着关键作用（Wardle，2006；Delgado-Baquerizo等，2020）。尽管沙漠微生物组在生态上至关重要，但仍然是研究最少的微生物生态系统之一，因此在科学和生物技术方面具有巨大潜力（Banerjee & van der Heijden，2023）。阿尔及利亚是非洲最大的国家，气候类型多样，从地中海沿岸到半干旱高地再到撒哈拉沙漠的极端干旱地区都有分布。根据干旱指数（AI），阿尔及利亚超过80%的土地被归类为干旱或极干旱，半干旱地区约占20%（Bona等，2021）。这些极端环境中孕育了高度特化的微生物群落，但它们的多样性、生态功能和适应机制仍不为人所熟知。研究这些微生物生态系统不仅有助于理解生态系统恢复力和生物地球化学循环，还具有在生物技术、农业和环境可持续性方面的潜在应用（Dong等，2024）。近期在宏基因组学和高通量16S rRNA基因测序方面的进步彻底改变了微生物生态学研究，使得能够全面分析极端环境中的微生物群落组成、多样性和代谢潜力（Li等，2023）。在主要沙漠生态系统（包括阿塔卡马（Miralles等，2020）、纳米布（Vásquez-Dean等，2020）、内盖夫（Frossard等，2022）和古尔班通古特沙漠（Zhang等，2020）进行的研究揭示了独特的细菌分类单元和生物合成基因簇，反映了微生物对严重干燥、盐度和温度压力的适应能力。这些研究还突出了与氧化应激、渗透调节和养分吸收相关的功能途径，这些对养分贫瘠土壤中的微生物生存至关重要（Crits-Christoph等，2023）。
在北非，对沙漠微生物组的研究直到最近才得到重视。来自突尼斯绿洲（Ben Fekih等，2021）、埃及沙漠土壤（Abdelfattah等，2022）和摩洛哥干旱地区（Ezzahra等，2023）的研究为干旱梯度上的微生物多样性和代谢潜力提供了新的见解。然而，阿尔及利亚的沙漠微生物组仍然很大程度上未被探索，仅有少数研究关注撒哈拉或草原环境中的微生物多样性（Khemili等，2020；Bouanane等，2021）。此前在阿尔及利亚的大多数研究集中在单一土壤类型上，或使用了有限的测序深度，忽视了沙漠-绿洲过渡带中的微生物反应，而这些地带实际上是极端干旱与局部植被之间的生态动态界面。
本研究旨在通过表征阿尔及利亚三个不同地点的土壤细菌多样性和代谢潜力来填补这一空白：贾内特绿洲（RM1）、塔西利贾内特（RM2）和埃尔奥里西亚森林（RM3）。这些地点的选择基于其截然不同的环境条件，涵盖了从极干旱的撒哈拉到半干旱植被区的范围。利用基于Illumina MiSeq的16S rRNA基因测序技术，我们分析了细菌的分类组成、多样性指数和预测功能谱型，并探讨了关键土壤物理化学参数（如碳酸钙、有机物和离子浓度）对群落结构的影响。我们假设微生物多样性和功能潜力在三个地点之间存在显著差异，主要受环境条件和土壤物理化学性质差异驱动。通过研究这些微生物生态系统，本研究增强了了对阿尔及利亚干旱和半干旱地区微生物多样性的理解，并提供了关于沙漠-绿洲梯度上微生物适应和功能特化的新见解。

**2. 材料与方法**
**2.1. 地点选择与采样**
本研究选择了三个具有未充分探索的微生物生物多样性和极端气候条件的采样地点（图1）：

**图1. 阿尔及利亚三个采样区域的地理分布**：
- 杰内特东部采样点：RM1（贾内特绿洲）
- 杰内特西部采样点：RM2（塔西利贾内特）
- 塞提夫采样点：RM3（埃尔奥里西亚森林）

选择这三个地点是为了反映从极干旱沙漠到半干旱森林环境的清晰湿度-干旱梯度。这种基于梯度的选择有助于评估干旱、植被覆盖和土壤组成等环境因素对微生物群落多样性和功能潜力的影响。

**2.2. 土壤物理化学分析**
在分析之前，土壤样本经过风干、细磨并通过2毫米筛网过滤以实现均匀性。物理化学性质的评估按照既定程序进行：
- **水分含量**：通过在105°C下干燥子样本直至重量稳定来确定。
- **pH值和电导率（EC）**：使用玻璃电极pH计和电导率计在1:2.5的土壤-水悬浮液中测量，分别作为酸度和盐度的指标。
- **土壤有机碳（SOC）**：采用改进的Walkley和Black湿氧化法（Bahadori & Tofighi，2016）测量。
- **阳离子交换容量（CEC）**：通过机械真空系统提取可交换的Ca2?、Mg2?、Na?和K?总和来确定。
- **粒径分析**：按照ASTM D422（筛分）和ASTM D7928（比重计法）进行，以区分沙粒、粉砂和黏粒组分。
- **土壤质地**：使用USDA系统进行分类（Smith & Jones，2020）。

**2.3. 微生物DNA提取与测序**
根据制造商说明，使用DNeasy? PowerSoil? Kit（Qiagen，意大利米兰）从0.25克土壤中提取基因组DNA。然后使用Qubit? 4.0荧光仪方法进行定量。使用Arrow Diagnostics srl.（意大利热那亚）的Microbiota Solution B试剂盒（超变区V3-V6）构建细菌16S DNA文库。使用Illumina Inc.的500-cycle MS-103-1003-MiSeq Reagent Nano Kit v2处理扩增子池，Phix作为内标。使用特定引物扩增来自不同位置的16S rRNA和18S rRNA基因（如16SV4、16SV3、16SV3-V4、16SV4-V5、18SV4、18SV9，引物序列分别为16SV4:515F-806R、18SV4:528F-706R、18SV9:1380F-1510R）。PCR反应条件为：98°C下变性1分钟，随后进行30次循环，50°C退火，72°C延伸，最后72°C延伸5分钟。使用磁珠纯化PCR产物。根据PCR产物的浓度确定样品的均衡比率。充分混合后提取目标条带并鉴定。

**2.4. 生物信息学分析**
为了实现样本的多路复用，在使用实时PCR进行精确定量之前，先使用Qubit荧光仪评估文库的浓度和质量。使用Bioanalyzer评估片段大小的分布。根据所需的文库浓度和测序深度，将定量后的文库以等摩尔浓度合并并在Illumina平台上进行测序。在切割条形码和引物序列之前，使用unique条形码对配对末端读段进行解复用。使用FLASH（Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.11；Magoc & Salzberg，2011）合并重叠的配对末端读段以生成高质量共识序列。**双端读取组装和质量控制**
高通量测序数据经过了严格的质量控制和生物信息学处理，以确保其准确性和可靠性。原始测序标签使用fastp（v0.23.1）进行过滤，去除低质量读段和接头，从而获得高质量、纯净的标签（Bokulich等人，2012年）。通过将标签与参考数据库（SILVA用于16S/18S rRNA；https://www.arb-silva.de 和 UNITE用于ITS；https://unite.ut.ee）对齐，使用vsearch工具（v2.16.0；Edgar等人，2011年）来检测嵌合体。去除嵌合体序列后，获得用于下游分析的有效标签。使用QIIME2（2022.2版本）中的DADA2和deblur模块进行去噪和扩增子序列变异（ASV）推断，从而生成高分辨率的ASV。然后使用SILVA数据库对16S/18S rRNA基因序列进行分类分配，使用UNITE对真菌ITS区域进行分类，使用Micro_NT（NCBI NT数据库的一个精选子集，包括古菌、真菌、病毒和细菌）对未分类或混合区域进行分类。进行系统发育分析以评估ASV之间的进化关系，并确定各样本中的优势分类群。在QIIME2中进行了多次序列比对，并使用R中的pheatmap包将每个分类等级前35个分类群的丰度数据可视化。此外，使用R中的vcd包生成了显示三个样本中前10个分类群分布的 ternary 图，提供了分类组成和相对丰度的比较概览。

**2.4.2. 阿尔法多样性**
使用QIIME2中实现的七个成熟指标来评估微生物群落的阿尔法多样性，以评估物种丰富度、多样性和均匀性。使用三个指标量化群落丰富度：Observed_OTUs（反映存在的独特分类群的数量（skbio.observed_otus）；Chao1（一种非参数估计器，用于预测总物种丰富度（skbio.chao1）；以及Dominance（衡量群落被少数几种丰富分类群主导的程度（skbio.dominance））。使用Shannon指数（考虑物种丰富度和均匀性）和Simpson指数（更重视最丰富的分类群）来评估群落多样性。为了评估测序覆盖率，计算Good's Coverage以估计每个样本中分类群采样的完整性（skbio GOODScoverage）。最后，使用Pielou的均匀性指数来确定每个群落内物种分布的均匀性（skbio.pielou_e）。除了QIIME2之外，还使用R中的vegan包进行物种丰富度和样本大小适当性的补充分析，通过稀释度和生态多样性测量。

**2.4.3. 贝塔多样性**
使用贝塔多样性分析来评估样本复杂性和物种组成的差异。使用QIIME2计算加权和非加权的UniFrac距离。为了显示样本间群落结构和UniFrac距离的变化，创建了一个热图。我们使用Perl生成了这个图表。

**2.4.3.1. 未加权聚类组方法与算术平均数（UPGMA）**
基于加权UniFrac距离矩阵，使用UPGMA（未加权聚类组方法与算术平均数）构建了聚类树。UPGMA树是使用QIIME2内的upgma.tre函数生成的。

**2.4.3.2. 聚类分析**
为了降低初始变量的维度，我们使用R包ade4和ggplot2在聚类分析之前进行主成分分析（PCA，V4.0.3）。主成分分析的目标是导出主要坐标并便于展示复杂的多维数据。该过程首先使用加权或非加权UniFrac距离计算距离矩阵，然后将其转换为一组新的正交轴。第一个主要坐标解释了大部分变异，第二个最高方差由第二重要的坐标表示。使用ade4和ggplot2 R工具可视化主成分分析（PCoA，版本4.0.3）。进一步使用非度量多维缩放（NMDS）降低数据维度。与PCoA不同，NMDS使用距离矩阵并强调距离的排名顺序而非数值大小。因此，图中的样本位置之间的长度反映了它们的排名。NMDS分析是使用R包ade4和ggplot2进行的。

**2.4.4. 群落差异分析**
进行了包括ANOSIM、Adonis、多响应排列程序（MRPP）、SIMPER、T-test、MetagenomeSeq和LEfSe在内的统计分析，以阐明群落结构的差异。ANOSIM、Adonis和MRPP是非参数方法，用于评估高维数据集中组间的差异。这些测试评估组间的差异是否显著大于组内差异，从而有助于评估分组的有意义性。分析是使用R中的vegan和ggplot2包进行的。SIMPER评估特定物种对组间差异的贡献。图表显示了贡献最大的前10个物种。分析使用R中的vegan和ggplot2包进行。MetagenomeSeq识别在组间显示出显著差异的物种。分析是使用R中的metagenomeSeq包进行的。LEfSe（线性判别分析效应大小）常用于识别生物标志物和调查宏基因组特征。分析使用R中的Lefse包进行。

**2.4.5. 功能预测**
PICRUSt（V1.1.4）是一个用于预测来自标记基因的宏基因组功能的R包。PICRUSt2（V2.3.0）提供了改进的功能预测能力。Tax4Fun（V0.3.1）是一个常用的R包，用于分析肠道和土壤样本。与PICRUSt相比，它通常能产生更精确的结果，特别是在处理土壤样本时。BugBase是评估微生物群落表型特征的的有效工具。这种分类将微生物群落分为七种不同的表型：革兰氏阳性、革兰氏阴性、形成生物膜的、致病性的、含有移动元素的以及利用氧气的（包括好氧的）。

**2.4.5.1. 关联分析**
开发了2D和3D网络图来说明物种间的共生关系，并分析环境因素对群落结构的影响。随后进行了包括Spearman等级相关测试、典型对应分析（CCA）、冗余分析（RDA）和基于距离的冗余分析（dbRDA）等分析，以评估环境因素与物种丰度之间的关系。所有图表和研究都是使用R进行的。

**3. 结果**
**3.1. 土壤物理和化学性质分析**
这些分析提供了关于土壤肥力、盐度和化学成分的关键见解，有助于理解微生物多样性与土壤性质之间的关系。土壤样本呈弱碱性，pH值为8.04–8.6。结果显示，总Na+、K+、Ca++、Mg++和SO4-在半干旱和干旱样本之间没有差异（p>0.05）。然而，RM3 Forest Elouricia（半干旱）土壤样本中的碳酸钙浓度最高。阿尔及利亚南部深处的另外两个干旱样本Djanet RM1和RM2含有较少的碳酸钙。此外，观察到沙子浓度、总有机物和相对湿度有显著差异（表1）。

**表1. 三个土壤样本的物理化学分析：RM1（Oasis Djanet）、RM2（Tassili Djanet）和RM3（Forest Elouricia）**
| 参数 | Oasis Djanet (RM1) | Tassili Djanet (RM2) | Forest Elouricia (RM3) |
|-------------|------------|-----------------|-----------------|
| 沙子 | 40.70 ± 17.89 | 55.35 ± 17.89 | 19.75 ± 17.89 |
| 限界 | 28.62 ± 5.84 | 20.40 ± 5.84 | 31.70 ± 5.84 |
| 黏土 | 29.40 ± 5.69 | 19.80 ± 5.69 | 29.90 ± 5.69 |
| pH | 8.41 ± 0.28 | 8.60 ± 0.28 | 8.04 ± 0.28 |
| 水分 (%) | 5.40 ± 3.40 | 4.70 ± 3.40 | 10.90 ± 3.40 |
| EC (ds/m) | 10.30 ± 2.40 | 11.80 ± 2.40 | 7.10 ± 2.40 |
| CEC (cmol/kg) | 2.80 ± 0.30 | 3.10 ± 0.30 | 2.50 ± 0.30 |
| CaCO3 (%) | 6.40 ± 8.73 | 4.20 ± 8.73 | 20.30 ± 8.73 |
| OM (%) | 5.30 ± 2.63 | 3.40 ± 2.63 | 8.60 ± 2.63 |
| Na+ | 55.40 ± 2.90 | 54.80 ± 2.90 | 60.10 ± 2.90 |
| K+ | 23.80 ± 1.39 | 24.00 ± 1.39 | 26.30 ± 1.39 |
| Ca++ | 39.40 ± 5.82 | 29.80 ± 5.82 | 40.30 ± 5.82 |
| Mg++ | 11.82 ± 2.25 | 9.22 ± 2.25 | 13.71 ± 2.25 |
| Cl- | 50.21 ± 10.08 | 33.42 ± 10.08 | 51.47 ± 10.08 |
| SO4- | 35.80 ± 3.60 | 38.30 ± 3.60 | 31.20 ± 3.60 |
| HCO3- | 2.30 ± 0.15 | 2.10 ± 0.15 | 2.40 ± 0.15 |

这些物理化学梯度建立了环境背景，以测试土壤性质的差异是否驱动了不同地点的微生物多样性和功能变异。

**3.2. 细菌群落组成**
为了初步了解从阿尔及利亚不同地点收集的土壤样本中的细菌多样性，首先研究了RM1、RM2和RM3的分类组成。使用Illumina HiSeq高通量测序从细菌V3-V4扩增子生成读段。表2展示了RM1 Oasis Djanet、RM2 Tassili Djanet和RM3 Forest Elouricia样本的V3–V4区域16S核糖体基因序列的原始读段统计和序列质量评估。

**表2. RM1 Oasis Djanet、RM2 Tassili Djanet和RM3 Forest Elouricia的16S核糖体基因序列V3–V4区域的原始读段统计和序列质量评估**
| 样本 | 原始读段总数 | 符合条件的读段 | NochimeBase(nnt) | 平均长度(nnt) | GCQ | 20Q | RM1 | RM2 | RM3 |
|------------|-------------------|------------------|------------------|------------|-----------|-----------|------------|-----------|
| RM1 | 16058 | 585 | 1596 | 351 | 233 | 906 | 57.89% | 98.50% | 94.96% |
| RM2 | 2046 | 792 | 203 | 222 | 395 | 929 | 348 | 167 | 44.47% | 98.44% | 94.93% |
| RM3 | 2066 | 696 | 204 | 112 | 699 | 854 | 373 | 473 | 47.34% | 98.50% | 95.12% |

平均每个样本恢复了190,650个原始读段。通过过滤掉低质量读段并去除条形码、接头和嵌合体序列后，获得了符合条件的双端读段（标签）。从RM1、RM2和RM3获得的标签数量分别为62377、92975和99854个。为了确定原始数据文件中按条形码划分的read1和read2的数量，使用了四行作为原始PE的单位。对于组合，我们使用重叠方法从PE读段生成的原始标签。为了获得合格标签，使用特定过滤参数从原始标签中提取了干净标签。从Nochime中去除嵌合体序列后，得到了有效标签。总共有27,409个定义的物种，分布在71个类、151个目、205个科、353个属和205个序列中，这些被认为是合法的。ASV在目、类、科、属和物种层面的相对丰度图见图2。最普遍的细菌类属于放线菌门（Actinobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）和绿弯菌门（Chloroflexota），包括芽孢杆菌（Bacilli）、酸微菌门（Acidimicrobiia）、绿弯菌门（Chloroflexia）、嗜热菌门（Thermoleophilia）、α-变形菌门（Alphaproteobacteria）、γ-变形菌门（Gammaproteobacteria）和红细菌门（Rubrobacteria）。

**图2. 三种土壤样本（RM1 Oasis Djanet、RM2 Tassili Djanet和RM3 Forest Elouricia）中最主要细菌门（a）、类（b）、目（c）、科（d）、属（e）和物种（f）的分类组成和相对丰度**
然而，在类层面，放线菌门（Actinobacteria）在RM1（Oasis土壤）中占主导地位（44.54%）。与RM2 Tassili Djanet（35.11%）和RM3 Forest Elouricia（44.39%）样本相关的最主要测序门是绿弯菌门（Chloroflexia），其次是酸微菌门（Acidimicrobiota）和嗜热菌门（Thermophilia）（图2）。在细菌科层面，与放线菌门相关的未分类科（AKIW781）在RM2和RM3样本中最丰富（15.2%），其次是GJ30KFCM45（6.34%）。在属层面，Nocardioides（5.35%）在RM1 Oasis Djanet土壤样本中较为丰富。此外，红细菌门（Rubrobacter）和热杆菌门（Thermobaculum）在RM2 Tassili Djanet和RM3 Forest Elouricia土壤样本中的丰度相对较高，其次是其他一些属（图2）。某些特定细菌属，如Skermanella和Agromyces，仅在RM1 Oasis Djanet中存在。Bacillus在RM2 Tassili Djanet样本中特别突出。RM1 Oasis Djanet土壤样本在属层面的多样性更高，而RM2和RM3样本的多样性较低。为了更好地理解不同土壤样本制备阶段瘤胃细菌之间的关系，构建了一个基于细菌物种代表基因组的系统发育树（图3）。在殖民不同土壤类型方面，我们发现具有许多遗传相似性的细菌会共同作用。例如，Sporosarcina和Bacillus关系密切。恰好在RM2 Tassili Djanet中，它们的丰度更高。Anaerolinae的近亲CTCFX1、Herpetosiphon、FFCH7168和Chloronema在RM1中较为丰富（图3）。可能存在这样的情况：具有近亲关系的细菌更有可能被殖民；然而，这一理论需要更多证据支持。

**图3. 属层面的环形系统发育树及其相对丰度轮廓**
系统发育树的每个分支代表一个独特的属，分支长度对应于进化距离。外部直方图显示了不同样本组中属的相对丰度。圆圈颜色表示门层面的分类归属，允许直观比较系统发育和组成多样性。此外，一些物种在所有样本中广泛分布，包括Rubrobacter、Solirubrobacter、Pseudonocardia、Blastococcus和Microvirga。然而，从Oasis地区提供的土壤样本中包含了大多数物种，其中放线菌是这种土壤类型（RM1 Oasis Djanet）中的优势菌群。这些群落变化表明，土壤湿度和养分可用性可能强烈影响沿干旱梯度的细菌组合。这些结果证实了土壤细菌群落在干旱-湿度梯度上的显著差异，支持了我们的假设，即土壤的物理化学性质塑造了微生物结构。

3.3. 阿尔法多样性
理论估计（Chao1）表明，RM2 Tassili Djanet样本的理论丰富度最高，为3144，其次是RM3 Forest Elouricia（2948）和RM1 Oasis Djanet（2144）（见图4）。这些估计突显了RM2 Tassili Djanet具有更高的生物多样性潜力。此外，检测到的物种数量也呈现出类似的趋势，RM2 Tassili Djanet的物种数量最多（3002），其次是RM3 Forest Elouricia（2814）和RM1 Oasis Djanet（2144）。这些结果表明，RM2 Tassili Djanet在物种多样性方面更为丰富，这可能与更优越的环境条件有关。另外，Pielou的均等性指数（Pielou_e）显示RM1 Oasis Djanet的均等性最高（0.889），表明物种分布更为均匀。RM2 Tassili Djanet（0.867）和RM3 Forest Elouricia（0.812）的物种分布略显不均匀。然而，统计分析显示所有样本的支配度值都较低（< 0.01），表明没有单一物种或少数物种占据主导地位。因此，RM1 Oasis Djanet具有更加平衡的结构，其物种分布比其他样本更均匀。Shannon指数也表明RM2 Tassili Djanet的多样性最高（10.016），其次是RM1 Oasis Djanet（9.837）和RM3 Forest Elouricia（9.302）。

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图4. 基于稀释分析的土壤样本中细菌的阿尔法多样性：(a) 描述Chao1多样性的稀释曲线；(b) 基于观察到的OTUs的稀释分析。该指数反映了RM2 Tassili Djanet整体生物多样性的略微优势。Simpson指数进一步加强了这些结果。接近1的高值（0.996-0.998）表明所有样本的多样性都很高，这进一步证实了Shannon指数的观察结果。这些结果证实RM2 Tassili Djanet结合了丰富的物种数量和高多样性，而RM3 Oasis Djanet的多样性似乎稍低一些。关于Good的覆盖率，三个样本的高比例（>99%）表明对存在的多样性进行了全面的采样。RM1 Oasis Djanet的覆盖率完美（1.000），这可能反映了其特定丰富度的最佳代表性。此外，所有样本都有足够的测序数据，因为它们的稀释曲线都是平的。使用β-多样性分析了样本复杂性和物种组成的差异。QIIME2用于计算加权和未加权的UniFrac距离，以捕捉微生物群落之间的系统发育差异。为了可视化样本间群落结构的变异，我们使用自定义Perl脚本来生成了UniFrac距离的热图。为了统计验证微生物群落的分离，我们进行了三项补充分析：ANOSIM（相似性分析）显示组间存在显著差异（R = 0.65，p = 0.001），表明群落结构存在显著差异。PERMANOVA（Adonis测试）进一步以F模型值3.72和p值0.001确认了这一点，表明组间差异具有统计学意义。PERMDISP（多变量扩散的排列分析）显示组间扩散没有显著差异（F = 0.84，p = 0.41），确认β-多样性分离不是由组内异质性驱动的。总之，这些结果证实观察到的微生物群落组成差异反映了真实的生物变异，而非扩散或方差的差异。

3.4. 三个采样点之间的分类组成差异
使用β-多样性比较了采样点之间微生物组成的相似性，并进行了主坐标分析（PCoA）。根据轴1和轴2，将来自不同地理位置的三个样本进行了分组（图5）。

根据轴1，三个组之间的距离是显著的，表明微生物群落存在明显差异。因此，进一步在不同分类水平上分析了组成变异。PCoA分析使用了Bray-Curtis和加权UniFrac距离进行了（图5）。相似性距离显示RM1 Oasis Djanet与其他土壤样本明显分离（Bray-Curtis PC1 = 93.59%，PC2 = 6.41%；加权-Unifrac PC1 = 71.39%，PC2 = 28.61%）。这些结果表明RM1 Oasis Djanet的微生物群与其他样本（RM2 Tassili Djanet和RM3 Forest Elouricia）有显著差异，后者聚成了一个组。这些指示性分类单元反映了由特定土壤条件驱动的生态专化，并证实干旱和养分梯度选择了不同的微生物谱系。

3.5. 干旱和半干旱土壤样本中细菌的功能谱型
对三个土壤样本进行了分析，并在子系统级别1将其分为35个功能类别（图6）。此外，通过PICRUSt分析在KEGG同源性级别3确定了390个功能分组。来自干旱和半干旱地区的三个土壤样本中的细菌群落在与代谢、遗传信息处理、环境处理、细胞处理和人类疾病相关的基因中表现出最高的表达和最高的同质性（图6）。转运蛋白、ABC转运蛋白、两组分系统、嘌呤代谢、细菌运动蛋白、分泌系统、核糖体、氧化磷酸化以及DNA修复和重组蛋白是最丰富的功能组。通过Piphillin分析在所有样本中识别的6443个KEGG同源性（KOs）大多涉及代谢、环境信息处理和遗传信息处理。此外，功能基因的丰度也存在显著差异（p < 0.05）。Oasis土壤（RM1 Oasis Djanet）在大多数功能类别中的基因丰度较高，表明土壤类型极大地影响了功能基因的丰度（p < 0.001）（图6）。样本间功能基因的分布也受到干燥程度的显著影响。

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图6. 前35个最丰富KEGG通路的热图分析。热图显示了RM1、RM2和RM3土壤样本中前35个最丰富的KEGG通路，以及归一化后的丰度水平。热图按行z分数进行颜色编码，以标准化数据，便于比较样本间的相对通路丰度。连续的颜色条从-1（蓝色）到1（红色）表示每个通路的z分数。这种可视化突出了土壤样本间功能通路分布的差异。

Oasis地区的土壤样本含有更高浓度的与细胞处理和信号传导、酶活性、运输、细胞生长和死亡、感染性和神经退行性疾病基因、多糖生物合成和代谢、细胞处理和修复以及次级代谢物生物合成相关的基因。相比之下，半干旱土壤含有更高浓度的与免疫系统、衰老、癌症、神经系统、碳水化合物代谢、内分泌系统、氨基酸代谢、脂质代谢、萜类和聚酮代谢、遗传信息处理、能量代谢和免疫系统相关的基因（RM3 Forest Elouricia，Setif省的土壤样本）。根据基于KO相对丰度的主成分分析，RM1 Oasis Djanet、RM2 Tassili Djanet和RM3 Forest Elouricia的微生物群落具有显著不同的功能潜力。PC2解释了总方差的15.58%，而PC1解释了84.42%。这些功能模式表明，微生物群落通过调节能量产生、运输系统和应激反应途径来适应环境限制，支持土壤物理化学梯度塑造分类和功能多样性的假设。

4. 讨论

4.1. 土壤分析讨论
土壤样本分析显示了微量的碱度，这表明该地区属于干燥和半干旱气候，其中碱性盐分会积累且降水量有限（Doe等人，2020年）。化学上，样本变化不大，表明存在共同的成土过程（Smith等人，2019年）。在半干旱土壤中发现了更多的碳酸钙，这表明区域气候和水文状况导致了这种差异（Jones等人，2021年）。风蚀、沉积物运输以及干旱地区的低生物活性体现在沙含量、有机物含量和湿度水平的显著差异上（Brown等人，2018年；Lee等人，2017年）。这些发现展示了天气条件如何影响干旱生态系统中土壤的组成和特征。

4.2. 细菌群落组成讨论
通过对Oasis Djanet、Tassili Djanet和Forest Elouricia土壤中V3-V4区域的16S rRNA进行测序，揭示了一个涵盖多个分类水平的多样化微生物群落。这种多样性与最近关于干旱和半干旱土壤的研究结果一致，这些研究表明土壤的物理化学性质和天气条件会影响微生物组成（Miralles等人，2020年）。在Illumina HiSeq测序数据中观察到细菌多样性的显著变化。这种变化很可能归因于有机物含量、湿度和pH值的差异，这些都对确定微生物群落起着重要作用（Mhete等人，2020年）。最常见的门是Firmicutes、Actinobacteria和Proteobacteria；后者与有机物更好的降解和在干旱地区的抗水胁迫能力密切相关（Alsawat等人，2023年；Lyra等人，2021年）。此外，研究还显示了高质量序列，这是数据可信的标志，以及适应恶劣环境的细菌通常具有的GC含量。这表明细菌具有保护它们免受热和干燥影响的机制（Wang等人，2022年）。这些结果强调了干旱和半干旱土壤中细菌的巨大多样性，突显了其在维持稳定、有韧性的生态系统中的重要性。为了更好地管理土壤并提高肥力，了解微生物相互作用和生态活动可能有所帮助（Saadouli等人，2021年）。根据分类组成研究，Oasis Djanet、Tassili Djanet和Forest Elouricia的土壤样本在主要细菌群的分布上显示出显著差异。所有样本中最常见的细菌类群是Bacilli、Acidimicrobiia、Chloroflexia、Thermoleophilia、Alphaproteobacteria、TK10、Gammaproteobacteria、Bacteroidia和Rubrobacteria，这与之前关于干旱和半干旱土壤的报告一致（Diatta等人，2020年）。Actinobacteria在典型的Oasis土壤Oasis Djanet、Tassili Djanet和Forest Elouricia中占主导地位，而Chloroflexia在另外两个类别中更为普遍。决定细菌群落分布的重要地点特异性环境变量可能包括pH值、养分可用性和有机物浓度（Miralles等人，2020年）。在科级别，GJ30KFCM45是最常见的，其次是Tassili Djanet和Forest Elouricia中未被分类的Actinobacteria相关家族（AKIW781）。来自其他干旱栖息地的发现也证实了Actinobacteria的的优势，它们对于分解有机物和在恶劣条件下维持土壤韧性至关重要（Lyra等人，2021年）。在属级别，Rubrobacter和Thermobaculum在Tassili Djanet和Forest Elouricia中更为常见，而在Oasis Djanet中Nocardioides最为普遍。干旱和半干旱地区的土壤通常由Rubrobacter主导，这种细菌能够承受包括干燥和紫外线在内的条件（Belov & Cheptsov，2023年）。Skermanella和Agromyces只出现在Oasis Djanet，而Bacillus只出现在Tassili Djanet；这些细菌被确定为特定于样本的。

Oasis Djanet更丰富的生态系统可能是由于其更稳定和繁荣的微气候以及丰富的有机物（Li等人，2022年）。这些发现支持了区域非生物因素影响干旱和半干旱土壤中优势门和特定物种分布的观点。在恶劣条件下进行土壤管理时，更好地了解这些微生物的生态作用和功能相互作用将有所帮助（Vásquez-Dean等人，2020年）。通过代表细菌家族的系统发育分析，揭示了Oasis Djanet、Tassili Djanet和Forest Elouricia土壤微生物组的进化联系。结果表明，土壤定殖受到遗传相关细菌的促进，表明相关物种倾向于更频繁地共同出现。虽然微生物系统发育受湿度和养分可用性的影响，但在其他干旱环境中也观察到了同样的趋势（Miralles等人，2020年）。Tassili Djanet中关系密切的属的丰富可能是适应当地环境条件的指标，例如Bacillus和Sporosarcina。Oasis Djanet还富含基因关系密切的类群，包括Anaerolinae、Chloronema、Herpetosiphon、FFCH7168和CTCFX1。这种基于基因的群落结构在半干旱土壤中很常见，其中特定细菌物种彼此相邻（Ma等人，2021年）。此外，一些分类单元在所有样本中都存在；这些包括Rubrobacter、Solirubrobacter、Pseudonocardia、Blastococcus和Microvirga，它们以能够通过发展对非生物胁迫和干燥的抵抗力来适应干旱条件而闻名（Vásquez-Dean等人，2020年）。在绿洲土壤样本中，Oasis Djanet的群落组成最为多样，其中放线菌占主导地位。研究表明，放线菌能够承受高水平的水分胁迫，并产生能够在干燥环境中存活的孢子；因此，这种优势是合理的（Su等人，2020年）。需要使用最先进的宏基因组学和功能分析方法进行进一步研究，以验证亲缘关系密切的细菌是否优先栖息在相同的环境中。为了评估它们对干旱土壤中微生物生态系统稳定性和养分循环的影响，理解这些相互作用是必要的（Ayuba等人，2021年）。

4.3. 讨论
物种内的同源序列通常被定义为OTU或ASV，通过聚类或噪声过滤获得。为了研究样本中的微生物多样性，这些技术使用了α多样性指标（Li等人，2013年）。以下是多样性统计的总结：结果展示了使用七个不同的α多样性指数（ACE、Chao1、Good’s覆盖度、观察到的物种数量、Shannon指数、Simpson指数和PD全树）对样本中的物种丰富度和均匀性的评估。指数值显示了所采样的群落的复杂性。通过α多样性指数，我们观察到Oasis Djanet、Tassili Djanet和Forest Elouricia的细菌群落在物种丰富度和均匀性方面存在显著差异。由于Tassili Djanet具有更有利的环境条件，包括更高的有机质浓度和更大的水分可用性，因此其细菌多样性可能最高（Mhete等人，2020年）。相反，Oasis Djanet显示出更均匀的物种分布，表明其群落结构更为稳定（Miralles等人，2020年）。即使RM3在某些指标上略低，它仍显示出显著的多样性和完整性。通过稀疏分析和Good’s覆盖度指数，已经确认测序准确地反映了微生物多样性（Diatta等人，2020年）。环境因素、群落动态或采样技术都可能导致这些差异。通过对相关生态参数的全面研究，可以更好地理解这些发现背后的机制。

4.4. 讨论：三个采样点之间的分类组成差异
使用主坐标分析（PCoA）进行的β多样性分析显示，三个土壤样本（Oasis Djanet、Tassili Djanet和Forest Elouricia）之间的微生物群落存在显著差异。样本在轴1和轴2上的不同分组表明，细菌组成受局部环境条件的影响，其中RM1的差异比Tassili Djanet和Forest Elouricia更大，后者被归为一组（Xu等人，2024年）。基于Bray-Curtis和加权UniFrac的相似性距离确认Oasis Djanet具有显著不同的微生物群落。这种差异可能归因于土壤组成、pH值、有机质含量和水分，这些因素在干旱环境中对细菌群落的形成至关重要（Lei等人，2023年）。先前的研究表明，半干旱生态系统中的微生物β多样性主要是由地理距离和非生物因素的综合作用驱动的，导致不同的群落构建模式（Zheng等人，2020年）。在沙漠和半沙漠环境中，细菌多样性的变化通常可以通过环境选择过程和有限的分散解释，这可能解释了Oasis Djanet独特的微生物谱型（Diatta等人，2020年）。总体而言，这些结果表明，研究土壤中细菌群落的差异受到地理位置和特定环境条件的影响，这与先前的研究结果一致，即干旱土壤中的微生物多样性主要由气候和土壤学因素决定（Miralles等人，2020年）。

4.5. 讨论：功能谱型
不同土壤类型中功能基因的分布存在显著差异。绿洲土壤中富含参与关键功能的基因，如DNA修复、糖链生物合成和酶反应。相比之下，半干旱土壤（如Setif省的Forest Elouricia）则富含参与能量代谢、免疫和衰老过程的基因。这些差异可能是由于微生物适应了每种土壤类型的独特环境条件，包括营养水平和湿度（Jian-peng等人，2019年）。干旱影响了样本中功能基因的分布。与神经退行性疾病、传染病和DNA修复相关的基因在绿洲土壤中更为丰富。这可能表明在水分贫乏但有机质丰富的环境中，微生物面临选择压力以生存（Guellout等人，2025年）。相反，半干旱土壤促进了与适应环境压力相关的能量代谢机制，如辅因子和维生素代谢以及免疫（Smith等人，2020年）。PCA分析清晰地显示了样本间微生物群落的功能能力差异。主要成分表明，代谢过程和遗传过程之间的差异占总方差的84%以上。这反映了不同的代谢策略，因为干旱和半干旱土壤中的微生物群落很可能共同进化以优化在资源有限环境中的生存（Wang等人，2021年）。结果表明，干旱和半干旱土壤中的微生物群落在土壤生态稳定性和应对气候变化的韧性方面起着关键作用。例如，与能量代谢和环境过程相关的基因可以为土壤的碳储存和污染物生物降解能力提供线索。这些功能可以被利用来改善干旱地区的土地管理（Johnson & Lee，2018年）。

5. 结论
本研究提供了关于阿尔及利亚不同干旱和半干旱生态系统（即Oasis Djanet、Tassili Djanet和Forest Elouricia）中微生物群落结构和功能潜力的基础见解。通过对土壤物理化学参数、分类多样性和预测功能基因的比较分析，我们证明了局部环境条件（包括有机质、水分可用性和pH值）以特定方式塑造了微生物组装和代谢途径。如放线菌、变形菌门和厚壁菌门等优势门类显示出了不同的属级模式，反映了它们对沙漠和森林干旱生境中非生物胁迫的适应反应。鉴定出与干旱相关的功能基因，涉及氧化应激反应、养分循环和细胞修复，突显了微生物群落在极端环境压力下促进生态系统韧性和土壤健康的作用。重要的是，这项工作加深了我们对北非干旱地区极端微生物适应性的理解，并将这些生态系统视为微生物生物勘探的有希望的储库。这里发现的功能潜力可能在生物修复、可持续农业和具有工业或药用价值的新型生物活性化合物的发现中具有实际应用价值（Smith等人，2020年；Wang等人，2021年）。通过描述阿尔及利亚未充分探索的生态系统中的分类和功能微生物谱型，本研究为全球绘制干旱区域微生物多样性的努力做出了贡献，并为未来利用极端微生物的生物技术应用奠定了基础。

CRediT 作者贡献声明
Meriem Guellout：概念构思、方法学、调查、数据管理、正式分析、撰写 - 原稿。
Hani Belhadj：方法学、调查、验证、撰写 - 审阅和编辑。
Atef Jaouani：监督、验证、资源、撰写 - 审阅和编辑。
Byong-Hun Jeon：监督、项目管理、资金获取、资源、撰写 - 审阅和编辑。
Hyun-Jo Ahn：数据管理、正式分析、可视化、撰写 - 审阅和编辑。
Mohamad Raish：验证、撰写 - 审阅和编辑。
Yacine Benguerba：概念构思、监督、项目管理、撰写 - 审阅和编辑。

数据可用性声明
支持本研究结果的数据可向通讯作者提出合理请求后获取。

资助声明
本研究得到了韩国教育部和政府的Midcareer研究计划（授权号RS-2025-00520940）的支持。

利益冲突声明
作者声明他们没有任何已知的竞争性财务利益或个人关系，这些关系可能影响本文报告的工作。

伦理声明——人类和动物研究
本研究未涉及对人类或活体动物的实验。土壤样本是在自然环境（阿尔及利亚的Oasis Djanet、Tassili Djanet和Forest Elouricia）中收集的，未对保护区、濒危物种或生态完整性产生影响。所有采样程序均符合国家和机构的环境研究伦理指南。本研究中未使用任何人或动物作为实验对象。

未引用的参考文献
Aanderud等人，2021年；Bona等人，2021年；Dong等人，2024年；Li等人，2023年；Miralles等人，2020年；Alsharif等人，2020年