联合物理预处理与酶解对草菇水解物的影响及其在纯素蛋白棒中的应用

《Applied Food Research》：Effect of Combined Physical Pretreatments and Enzymatic Hydrolysis on Straw Mushroom Hydrolysates and Their Application in Vegan Protein Bars

　　Phornsaran Saengprachoom | Supattra Supawong
泰国塔玛萨大学科学技术学院食品科学与技术系

**摘要**
本研究评估了使用绿色技术（包括高压处理（HPP）、伽马辐照（GI）和亚临界水（SW）处理，随后进行Alcalase和Flavourzyme酶水解制备的Volvariella volvacea水解产物的组成特性和抗氧化活性的影响。在所研究的绿色技术中，HPP产生了最高的TCA可溶性肽产量（49.93 ± 0.83%），而GI实现了最高的提取物产量（57.81 ± 0.50%）和蛋白质回收率（58.21 ± 0.85%）。SW预处理在增加酚类化合物释放量（13.89 ± 0.16 mg/mL）和整体抗氧化活性方面最有效，这突显了其在释放生物活性化合物方面的效果。在SW预处理下，Flavourzyme水解产生的酚类化合物浓度和FRAP活性更高；然而，与Alcalase相比，DPPH自由基清除能力没有显著差异。相比之下，Alcalase水解产物具有更高的提取物产量和蛋白质回收率，这对工业生产效率至关重要，同时保持相当的抗氧化性能。综合考虑各项表现，选择通过SW预处理后进行Alcalase水解的方法用于纯素蛋白棒的增强。将水解产物（0 - 12% w/w）加入纯素蛋白棒中，提高了蛋白质含量、总酚类含量和抗氧化活性，且未对质地产生不利影响，证实了其功能性贡献。这些发现支持了使用集成绿色技术预处理后进行酶水解制备的V. volvacea水解产物作为可持续天然抗氧化剂在功能性食品和营养保健品应用中的潜力。

**1. 引言**
过去二十年里，由于人们逐渐认识到蘑菇对健康和功能性营养的贡献，对蘑菇的需求增长了近五倍（Fontes等人，2022年）。除了具有促进健康的特性外，蘑菇种植还支持关键的可持续发展目标（SDGs），特别是在食品安全、可持续生产和气候行动方面（Jayaraman等人，2024年）。食用蘑菇因其丰富的营养成分和作为动物源蛋白质可持续替代品的潜力而日益受到重视。它们提供了膳食纤维、B1、B2、B3和D等维生素、必需矿物质以及高质量的蛋白质，这些蛋白质含有所有九种必需氨基酸和支链氨基酸。这些营养特性使蘑菇成为素食者和纯素者饮食中特别有吸引力的成分（Pashaei等人，2024年）。在可食用蘑菇中，Volvariella volvacea（草菇）在东南亚广泛种植和消费。然而，与其他许多新鲜蘑菇类似，其子实体含有约90%的水分，导致其容易变质，采后保质期仅1-2天（Lian等人，2024年）。尽管如此，其高蛋白质含量和完整的氨基酸谱使其成为潜在的蛋白质来源（Ali等人，2024年）。因此，有效利用草菇对于最大化其价值并减少采后损失至关重要，尤其是将其这种高 perishable 原材料转化为增值成分。

蘑菇蛋白质与其他植物基蛋白质类似，通常与细胞结构中的碳水化合物、脂质、核酸和多酚等生物分子结合，这可能限制其生物利用度和功能性（Sá等人，2022年）。为了解决这些问题，采用酶水解来破坏复杂结构，从而提高蛋白质释放量并获得具有改良功能特性的蛋白质水解产物（Ketemepi等人，2024年）。常用的蛋白酶如Alcalase和Flavourzyme因其能生成具有多种生物活性潜力的肽而受到青睐。Alcalase主要作为内肽酶切断内部肽键，而Flavourzyme同时具有内肽酶和外肽酶活性，能够进一步分解为较小的肽和游离氨基酸（Hunsakul等人，2022年）。这些酶使得可以比较不同水解模式和酶对肽释放及功能性的具体影响。以往关于V. volvacea蛋白质的研究主要集中在通过酶水解生产味觉活性肽上。Jiang等人（2024年）报告称，使用Alcalase和Flavourzyme等蛋白酶制备的水解产物具有增盐效果，而Yang等人（2025年）证明酶水解产生的肽具有显著的鲜味和咸味反应。然而，关于酶类型和加工策略对水解效率及其水解产物的功能或生物活性特性的影响的信息有限。

单独使用酶水解可能不足以破坏复杂的真菌细胞壁结构。研究表明，将酶水解与物理预处理结合使用可以提高新水解效率。这种协同效应归因于蛋白质结构的破坏，提高了酶的可及性，促进了酶-底物相互作用，并促进了质量传递，从而提高了水解程度和所得水解产物的功能特性（Qian等人，2023年；Habinshuti和Zhang，2022年；Pacheco等人，2025年）。因此，探索了如伽马辐照、高压处理和亚临界水处理等物理预处理方法来改变结构障碍，提高酶的可及性，并增强后续酶水解的效率。

伽马辐照是一种快速、低成本且环保的技术，不需要化学试剂或额外设备（Xiong等人，2020年）。根据FAO、IAEA和WHO的联合专家委员会的意见，辐照剂量不超过10 kGy的食品产品不会带来毒理学风险（Bhat等人，2008年）。伽马辐照的结构效应包括蛋白质 unfold、交联和多肽链聚集（Gaber，2005年）。这些变化有助于提高蛋白质的消化率和溶解度，并减少植物源食品中的抗营养因子（Ahmed等人，2018年；Ebrahimi等人，2009年）。Xiong等人（2024年）的最新研究表明，伽马辐照提高了菜籽饼中的蛋白质回收率，进一步证明了其作为提高蛋白质提取效率的预处理方法的有效性。高压处理是一种无毒的方法，产生的热量极少，从而降低了蛋白质结构的热降解（Hewage等人，2022年）。在此过程中，共价和非共价键都会断裂，可能触发结构变化并通过增加细胞通透性促进质量传递（Khan等人，2019年）。Ahmed等人（2019年）的研究表明，高压预处理通过增加酶对切割位点的可及性提高了Alcalase水解的效率，从而提高了水解程度和抗氧化活性，并改变了大豆蛋白的二级结构。Wang等人（2022年）报告称，高压预处理改变了米糠蛋白的空间结构和一级结构，提高了水解效率和水解产物的结构及功能特性。Masamran和Supawong（2024年）发现，伽马辐照提高了提取物产量，而高压处理提高了蛋白质含量，这两种方法均保留了氨基酸并引起了与米糠蛋白水解物功能特性相关的结构变化。亚临界水技术利用100°C至374°C之间的温度和中等压力（通常为5至22 MPa）来保持水的液态（Hassas-Roudsari等人，2009年）。在高温下，水的介电常数降低，氢键减弱，导致粘度降低和扩散性提高。这些变化增强了水渗透到基质中的能力，提高了提取效率。Chaisuwan和Supawong（2022年）发现，在130°C下进行2小时的亚临界水处理后进行酶水解，提高了米糠水解物的蛋白质含量和抗氧化活性。Lazi?等人（2024年）发现，亚临界水萃取在200°C下获得了最高的Inonotus obliquus总酚含量。

随着水解技术的发展，人们对水解产物作为食品添加剂的应用兴趣也在增加。最初为运动员开发的蛋白棒因其便捷性和高蛋白质含量而受到广泛消费（Yadav，2020年）。传统配方通常依赖乳制品和大豆蛋白（Imtiaz等人，2012年）；然而，由于可持续性考虑、饮食限制以及与大豆产品相关的感官问题（Ma?ecki等人，2020年；Schyver和Smith，2005年），消费者对植物基替代品的需求正在增加。食用蘑菇是一种有前景的蛋白质来源，提供了高质量的蛋白质以及具有抗氧化和免疫调节特性的生物活性肽。与动物源生物活性肽不同，蘑菇生物活性肽在各种膳食实践中被广泛接受，特别适合素食者和纯素者使用（Ghorai等人，2009年）。将蛋白质水解物添加到这些产品中不仅可以提高蛋白质含量，还可以增强功能特性，包括抗氧化活性和生物利用度。

然而，关于物理预处理和酶类型对草菇水解产物水解效率及其功能或生物活性特性的综合影响的信息仍然有限。因此，本研究旨在探讨选定的物理预处理（包括伽马辐照、高压处理和亚临界水处理）与不同蛋白酶（Alcalase和Flavourzyme）结合使用对水解效率及所得水解产物特性的影响。研究结果为开发用于植物基食品系统的草菇增值水解产物提供了见解，支持功能性食品产品的开发。

**2. 材料与方法**
2.1. 材料
草菇（Volvariella volvacea）的子实体购自泰国Pathum Thani的Talaad Thai市场。蛋白酶Alcalase? 2.4 L（源自Bacillus licheniformis）和Flavourzyme? 500 L（源自Aspergillus oryzae）以及分析试剂2,2-二苯-1-吡啶基肼（DPPH）、没食子酸和2,4,6-三(2-吡啶基)-S-三嗪（TPTZ）均从德国Sigma-Aldrich购买。Folin–Ciocalteu酚试剂从印度Mumbai的Loba Chemie购买，Trolox则从比利时Acros Organics购买。本研究中使用的所有化学品均为分析级。

2.2. 预处理样品制备
首先将草菇清洗、切片，然后在50°C下干燥18小时。完全干燥后，将其研磨成细粉并过50目筛子。所得粉末在室温下用铝箔袋保存，待进一步使用。为了改变结构障碍并提高酶的可及性，应用了不同的物理预处理方法。

伽马辐照按照Xiong等人（2024年）的方法进行。样本在伽马辐照室（Gamma Chamber 5000，BRIT，印度）中使用钴-60辐射源以2.2 kGy/h的剂量率进行辐照。辐照后的草菇粉末标记为GM。

制备处理悬浮液时，将干燥的草菇粉末与去离子水按1:7（w/v）比例混合，形成均匀悬浮液。该悬浮液用于高压处理（HPP）和亚临界水（SW）处理。对于HPP方法，按照Masamran和Supawong（2024年）的方法，悬浮液在25°C下施加500 MPa的压力，持续20分钟，使用高压容器（HPP600 MPa，BaoTou KeFa High Pressure Technology Co.，中国）。处理后的样本标记为HPP。对于SW方法，按照Chaisuwan和Supawong（2022年）的方法，悬浮液在130°C和170 kPa下在高压灭菌器（SX-700，Tomy，日本）中处理2小时。处理后，样本冷却至室温。处理后的样本标记为SW。

2.3. 蘑菇水解物的制备
经过HPP或SW预处理的草菇悬浮液随后进行酶水解。对于对照组和GI样本，将干燥的蘑菇粉末与去离子水按1:7（w/v）比例混合，确保所有处理组的浓度一致，并使用顶部搅拌器（RW20，IKA，马来西亚）搅拌。根据最佳条件，向悬浮液中分别添加3%（v/w）的Alcalase?和Flavourzyme?：Alcalase在pH 8.0和55°C下，Flavourzyme在pH 7.0和50°C下，代表不同的催化机制。添加每种酶后，将悬浮液孵育3小时。酶水解后，混合物在90°C下加热2分钟，冷却后在4°C下以9,000 rpm离心15分钟。上清液收集并存放在琥珀色瓶中用于分析。

2.4. 水解物的分析
在不同的预处理和酶水解条件下获得的花菇水解物的物理化学和抗氧化特性分析如下：
2.4.1. 总可溶性固体
总可溶性固体（TSS）使用手持式固体折射仪HI96814（Hanna Instruments，RI，美国）测量。提取的可溶性固体越多，提取产量越高。（基于TSS的产量）%
产量 = 可溶性固体重量（g）/ 初始原材料重量（g）× 100

2.4.2. 蛋白质含量
粗蛋白含量根据AOAC（2005）使用Dumatherm燃烧氮分析仪测定。氮含量按4.38的因子转换为蛋白质。草菇的蛋白质回收率按以下公式计算：
%蛋白质回收率 = 从草菇中提取的蛋白质 / 草菇中的总蛋白质 × 100

2.4.3.TCA-可溶性肽的产量
TCA-可溶性肽的产量是根据水解后三氯乙酸（TCA）中可溶性肽的比例相对于总蛋白含量来确定的，方法遵循Hoyle和Merritt（1994）的研究。水解后，将反应混合物以1:1的比例与20%的TCA混合，并在4°C下以15,000g的离心力离心20分钟。溶解在透明液体（10% TCA）中的蛋白质被分析。TCA-可溶性肽的产量（%）使用以下公式计算：
%TCA-可溶性肽产量 = (N0Nt) × 100
其中N0和Nt分别是溶解在10% TCA水解物中的蛋白质含量和总蛋白质含量。

2.4.4. 氨基酸组成
样品的氨基酸组成通过高效液相色谱（HPLC）使用标准氨基酸进行测定。

2.4.5. 总酚含量
总酚含量（TPC）使用Folin–Ciocalteu方法（Singleton和Rossi，1965）测定。将0.5 mL样品溶液与Folin–Ciocalteu试剂和7.5%碳酸钠混合，然后孵育以产生颜色。使用UV–2401PC分光光度计（Shimadzu，日本东京）在765 nm处测量吸光度。定量基于没食子酸标准曲线，结果表示为mg没食子酸当量（GAE）/mL样品。

2.4.6. 抗氧化能力的测定
2.4.6.1. 2,2-二苯基-1-吡啶基肼（DPPH）测定
自由基清除活性使用Cheetangdee和Benjakul（2014）描述的方法的DPPH测定。每个样品水解物（0.5 mL）与2.5 mL DPPH溶液（0.1 mM乙醇）混合，并在暗处孵育30分钟。在517 nm处读取吸光度。使用Trolox作为标准品，结果表示为mg Trolox/mL样品。

2.4.6.2. 铁还原抗氧化能力（FRAP）测定
FRAP测定遵循Benzie和Strain（1996）描述的方法，并进行了些许修改。每个样品水解物（100 μL）与3 mL新鲜制备的工作FRAP试剂混合，该试剂包括300 mM醋酸盐缓冲液（pH 3.6）、10 mM TPTZ（2,4,6-三吡啶-s-三嗪）和20 mM FeCl?·4H?O。在室温下暗处孵育30分钟，并在593 nm处测量吸光度。定量基于FeSO?标准曲线，结果表示为mg FeSO?/mL样品。

2.5. 水解物在纯素蛋白棒中的应用和强化
用于产品应用的水解物是从预处理-酶组合中选出的，该组合在成分质量和抗氧化活性方面表现最佳。选定的水解物被浓缩至17°Brix（17% w/w固体）后加入纯素蛋白棒配方中。准备了三种配方（0%，6%，12%），分别调整水解物量以提供1克和2克固体当量。每种配方的成分组成（g/100g）见表1。纯素蛋白棒的生产过程改编自Spim等人（2021）。过程从称量干成分开始，包括谷蛋白分离粉、燕麦、杏仁、南瓜籽和可可粉。同时，准备粘合成分（枣糖浆、花生酱、稻草蘑菇水解蛋白和水），并充分混合形成均匀的混合物。然后将这种粘合混合物与干成分结合形成一致的面团。面团被制成尺寸为3.5×12×1.5 cm3的条形，并在160°C下烘烤20分钟。烘烤后，条形冷却并包装在不透明的塑料袋中。

表1. 添加了稻草蘑菇水解物的纯素蛋白棒配方。
成分（g/100 g）
纯素蛋白棒配方1（0%）
2（6%）
3（12%）
谷蛋白分离粉 99
稻草蘑菇水解物 6
12
燕麦 28
28
28
杏仁 18
18
18
南瓜籽 9
9
9
枣糖浆 18
18
18
可可粉 22
2
花生酱 3
3
3
水 13
7
1
总重量：100
100
100

2.6. 添加了稻草蘑菇水解物的纯素蛋白棒的分析
添加了蘑菇水解物的纯素蛋白棒的物理化学和抗氧化性质如下所述进行测定。

2.6.1. 蛋白质含量
纯素蛋白棒的粗蛋白含量使用Dumatherm燃烧氮分析仪（AOAC，2005）测定。氮含量通过6.25的系数转换为蛋白质含量。结果表示为每100克样品（干基）的蛋白质克数。

2.6.2. 水分活性（aw）
纯素蛋白棒的水分活性（aw）使用水分活性仪（Aqua Lab CX2，美国）在25°C下测定。

2.6.3. 颜色参数
纯素蛋白棒的颜色差异通过使用Hunter Lab色度计（Hunter lab CX2678，Hunter lab，美国）测量CIELAB空间参数来分析。纯素蛋白棒放置在国际玻璃池中测量反射颜色，表示为L*（亮度/暗度）、a*（红度/绿度）和b*（蓝度/黄度）值。总色差（ΔE）根据以下公式计算：
ΔE = (ΔL*)2 + (Δa*)2 + (Δb*)2

2.6.4. 流变性质
2.6.4.1. 三点弯曲测试
使用配备50N负载细胞的纹理分析仪（TA-XTPPlus，Stable Micro System，英国）和三点弯曲装置（图1）评估纯素蛋白棒的纹理。
下载：下载高分辨率图像（471KB）
下载：下载全尺寸图像
图1. 添加了稻草蘑菇水解物的纯素蛋白棒的三点弯曲测试。

2.6.4.2. 流变曲线分析
样品的流变曲线分析（TPA）使用Allai等人（2022）的方法，并进行了些许修改。TPA技术涉及两次压缩测试，模拟两次咬合。仪器配备圆柱形探头（P/36 R），预测试速度为1 mm/s，测试速度为0.50 mm/s，后测试速度为10.00 mm/s，触发力为5.0g，两次压缩之间间隔5秒。样品被压缩至原始高度的30%。结果表示硬度、弹性、咀嚼性和粘附性参数。

2.6.5. 样品制备和酚类及抗氧化分析的提取
提取程序改编自AlJaloudi等人（2024）。为了测定总酚含量、DPPH自由基清除能力和FRAP测定，制备了10%（w/v）乙醇提取物。简而言之，10克磨碎的蛋白棒样品在50 mL无水乙醇中浸泡2小时。过滤后，将滤液调整至最终体积100 mL。所得的乙醇提取物用于总酚含量和抗氧化分析。

2.6.6. 总酚含量
蛋白棒提取物的总酚含量使用Folin–Ciocalteu方法（Singleton和Rossi，1965）测定，如2.4.5节所述。结果表示为mg GAE/100g样品。

2.6.7. 抗氧化能力的测定
蛋白棒提取物的DPPH自由基清除能力和FRAP测定如2.4.6.1和2.4.6.2节所述进行。结果分别表示为mg Trolox/100g样品和mg FeSO?/100g样品。

2.7. 统计分析
统计分析使用IBM SPSS Statistics进行。水解物处理采用因子完全随机设计（Factorial CRD）且重复三次，而纯素蛋白棒实验采用完全随机设计（CRD）。方差分析（ANOVA）用于评估数据的方差，Duncan的新多重范围测试用于在95%置信水平下比较显著差异。

3. 结果与讨论
3.1. 物理预处理和酶类型对水解物产量的影响
3.1.1. 总可溶性固体
根据表2中呈现的总可溶性固体和提取产率（%）的分析，发现蘑菇水解物的总可溶性固体含量存在显著差异（p < 0.05），范围从9.93到10.90°Brix。蛋白酶将植物和蘑菇底物水解为较小的分子，如肽、氨基酸和氨，从而增加了可溶性固体含量，尤其是当水不溶性有机物减少时（Banjongsinsiri等人，2016）。尽管Flavourzyme产生的总可溶性固体较高，但其上清液回收率较低，导致总体提取产率低于Alcalase。此外，伽马辐射预处理显著（p < 0.05）提高了提取产率，优于对照组和其他预处理方法。这一结果与Kim、Yook和Byun（2000）的报告一致，他们指出10 kGy的伽马辐射可使某些草本植物的总可提取产率增加5-30%。同样，Huang和Mau（2006）发现10和15 kGy辐照的Agaricus blazei Murrill的甲醇提取产率高于其他处理组。Abd-El等人（2020）也证明伽马辐射（≤10 kGy）显著（p ≤ 0.05）提高了石榴皮和绿茶叶中生物活性化合物的提取率。产量增加的原因是伽马辐射期间大而不溶性分子分解为较小的可溶性分子。

表2. 使用不同物理预处理和酶水解的稻草蘑菇水解物的物理化学性质。
样品
总可溶性固体（°Brix）
提取产率（%）
蛋白质含量（%）
蛋白质回收率（%）
TCA-可溶性肽产量（%）
酶
预处理
Alcalase
对照组 10.08
de ± 0.1
25.70
a ± 0.68
25.54
b ± 0.19
57.58
ab ± 0.44
48.72
b ± 0.48
GI 10.12
cd ± 0.10
57.81
a ± 0.50
25.77
b ± 0.38
58.21
a ± 0.85
47.29
c ± 0.83
SW 10.55
b ± 0.12
53.42
c ± 0.88
25.89
b ± 0.62
54.04
c ± 1.29
45.68
d ± 0.58
HPP 9.93
e ± 0.09
55.97
b ± 1.00
26.81
a ± 0.39
58.64
a ± 0.85
49.08
ab ± 0.58
Flavourzyme
对照组 10.22
cd ± 0.03
53.45
c ± 0.64
25.80
b ± 0.24
53.89
c ± 0.49
48.72
b ± 0.78
GI 10.68
b ± 0.10
56.30
b ± 0.60
25.83
b ± 0.69
56.81
b ± 1.53
48.93
b ± 1.17
SW 10.90
a ± 0.11
50.49
e ± 0.61
26.57
a ± 0.37
52.41
d ± 0.73
47.78
c ± 0.38
HPP 10.23
c ± 0.23
51.53
d ± 1.09
25.71
b ± 0.32
51.75
d ± 0.65
49.93
a ± 0.83
同一列上的大写字母表示稻草蘑菇水解物之间的显著差异（p < 0.05）。
GI，伽马辐射；HPP，高压处理；SW，亚临界水。
*提取产率、蛋白质含量和蛋白质回收率以干重为基础（%）

3.1.2. 蛋白质含量
蛋白质含量分析的结果（表2）表明，HPP预处理结合Alcalase产生的蛋白质含量最高（26.81%），这具有统计学意义（p < 0.05）。与我们的发现类似，Zhao等人（2017）报道，在400 MPa下处理蘑菇10分钟后的蛋白酶辅助提取获得了最高的蛋白质含量。这种效应可以解释为HPP能够破坏蛋白质结构中的氢键、非共价相互作用和二硫键，从而展开蛋白质并增强酶的访问性（Wang等人，2008；Yang等人，2001；Zhou等人，2016）。此处观察到的水解效率提高也与HPP预处理下获得的较高TCA-可溶性肽产量（%）一致（表2）。同时，Flavourzyme与亚临界水预处理的组合在Flavourzyme组中产生了最高的蛋白质含量（26.57%），这也具有统计学意义（p < 0.05）。亚临界水已被证明能有效破坏细胞壁并改善细胞内成分的溶解。亚临界水技术之前已被用于海藻中的碳水化合物提取，并发现能有效破坏细胞壁。O’Connor等人（2020）证明这种技术提高了Palmaria palmata中的蛋白质提取率，其回收率高于HPP预处理。这些发现表明亚临界水预处理在释放结合蛋白和酚类化合物方面特别有效。酶解是破坏细胞结构的生物化学方法之一。酶的类型也影响蛋白质含量。如Alcalase和Flavourzyme这样的蛋白酶可以通过降解膜结合蛋白来破坏膜完整性，从而促进细胞壁的破坏并增强细胞内生物活性化合物（如蛋白质和肽的释放（D’Hondt等人，2017）。Thamnarathip等人（2016）发现Alcalase和Neutrase是内肽酶，可以在多肽链内切割肽键。Flavourzyme则具有内肽酶和外肽酶活性，可以在链的内部和末端切割肽键。这些特性使Flavourzyme在水解中更有效，通常导致更高的蛋白质含量。这与本研究的发现一致，即用Flavourzyme处理的样品通常显示出比用Alcalase处理的样品更高的蛋白质含量。
蛋白质回收率（%）是另一种用于评估水解过程效率的参数（Girgih等人，2011）。伽马辐射预处理与其他方法相比显著提高了蛋白质回收率（p < 0.05）（表2）。在油菜籽粉中也观察到了类似的趋势，7 kGy的辐射将蛋白质回收率从32.23%提高到39.15%。这种增加归因于伽马辐射显著降低了粗纤维含量，从而促进了植物组织中的蛋白质释放（Xiong等人，2024）。然而，先用高压处理再用Alcalase处理的样品显示出的蛋白质回收率也接近伽马辐射组，尽管差异没有统计学意义（p < 0.05），这反映了高压预处理的潜力。尽管高压技术效率很高，但所需的设备成本昂贵，这限制了其在小规模应用中的使用，相比之下，高压技术不如高压灭菌或亚临界水处理方法（O’Connor等人，2020年）。3.1.3. TCA可溶性肽的产量 TCA可溶性肽的产量是指在三氯乙酸（TCA）中可溶解的肽与总蛋白质含量之比，本研究使用这一指标来评估酶水解的效果。如表2所示，经过HPP预处理的样品其TCA可溶性肽的产量显著高于其他预处理方法。酶的类型也有显著影响（p < 0.05），Flavourzyme始终比Alcalase产生更高的值。这一观察结果与Tran等人（2021年）的研究一致，他们发现Flavourzyme在Lemna minor蛋白水解物中的水解效果优于Alcalase。Flavourzyme的优异表现可以归因于它的双重活性：它既可作为内肽酶也可作为外肽酶，能够切割多肽链内的肽键以及链末端（dos Santos Aguilar等人，2020年）。特别是Flavourzyme的外肽酶活性，在从肽链的N端或C端切割氨基酸方面起着关键作用，从而促进肽的分解和游离氨基酸的释放（Fu等人，2018年）。除了酶的特异性外，这里观察到的水解模式还表明其他反应参数也起作用。因此，蛋白质的水解不仅仅取决于所使用的酶，还受到酶与底物比例、时间、温度和pH值等因素的影响（Mahmoud，1994年）。与此一致的是，在更强烈的水解条件下，包括使用连续酶消化或高酶与底物比例以及延长水解时间的情况下，TCA可溶性肽的产量有所增加（Montoya-Rodríguez等人，2025年；Rosida等人，2026年）。3.1.4. 氨基酸谱蛋白质水解物通常包含不同长度的肽和游离氨基酸的混合物。在潜在的蛋白质来源中，蘑菇被认为是一种营养价值高且可持续的蛋白质来源，因为它们含有全部九种必需氨基酸，包括高水平的分支链氨基酸（BCAA），使其特别适合素食者和纯素食者（Pashaei等人，2024年）。如表3所示，使用亚临界水处理并用Flavourzyme水解的样品具有最高的BCAA含量（571.91 mg/100 mL），而使用HPP处理并用Flavourzyme水解的样品则具有最低的BCAA含量（418.29 mg/100 mL）。O’Connor等人（2020年）也报告了类似的趋势，表明在从藻类中提取蛋白质时，亚临界水处理比HPP处理能够释放更多的氨基酸。这些结果表明，亚临界水有助于破坏细胞壁和部分蛋白质的展开，从而增强酶对切割位点的接触。在亚临界水处理后的样品中，Flavourzyme的水解作用产生的总氨基酸含量显著高于Alcalase。这一结果可能是由于Flavourzyme的内肽酶和外肽酶双重活性共同作用的结果，促进了更广泛的肽切割。相比之下，Alcalase主要作为内肽酶发挥作用，仅能切割肽链内部的肽键，导致释放的氨基酸较少。表3. 使用不同物理预处理和酶水解方法处理后的草菇水解物的氨基酸谱（mg/100 mL）。样品 氨基酸 Alcalase Flavourzyme 对照 GISWHPP 对照 GISWHPP 非必需氨基酸 天冬氨酸 293.50a ± 8.70 273.79b ± 7.42 259.63cd ± 1.00 265.97bc ± 5.83 249.68d ± 6.49 269.82bc ± 6.21 276.76b ± 12.60 264.47bc ± 4.32 精氨酸 185.90a ± 5.45 176.37bc ± 1.28 163.97f ± 3.07 171.67cd ± 1.35 164.60ef ± 1.41 169.52de ± 4.54 180.70b ± 1.84 169.62de ± 1.73 谷氨酸 871.43bc ± 18.54 780.16d ± 18.51 842.12c ± 1.52 794.41d ± 15.12 883.25b ± 21.88 887.28b ± 13.62 958.21a ± 31.22 894.32b ± 12.74 甘氨酸 158.45c ± 2.17 150.25d ± 2.33 141.38e ± 1.99 157.02c ± 2.11 151.61d ± 1.72 159.29c ± 3.00 163.02b ± 1.14 168.06a ± 1.77 精氨酸 108.58b ± 4.04 109.17b ± 1.67 64.59e ± 1.54 123.16a ± 3.53 93.42c ± 2.22 91.53c ± 6.37 76.77d ± 4.22 122.21a ± 5.13 丙氨酸 277.71c ± 2.47 277.00c ± 3.71 273.14c ± 1.24 274.07c ± 1.30 266.80d ± 4.71 291.16b ± 3.40 306.56a ± 5.92 294.30b ± 2.55 脯氨酸 147.62b ± 0.81 142.85c ± 0.78 139.22d ± 0.58 143.87c ± 1.02 135.43e ± 1.31 148.46b ± 1.28 157.99a ± 3.42 148.70b ± 0.79 酪氨酸 98.36a ± 1.56 87.94c ± 1.73 83.37d ± 1.01 92.09b ± 2.15 66.80g ± 4.63 73.02f ± 0.58 84.45cd ± 1.74 79.00e ± 0.34 必需氨基酸 组氨酸 66.81a ± 1.39 62.22b ± 0.92 48.68d ± 1.14 64.20ab ± 1.71 61.90b ± 0.49 62.29b ± 2.80 54.95c ± 1.62 64.03ab ± 1.67 苏氨酸 185.89a ± 5.17 178.52bc ± 0.54 162.13e ± 2.98 181.43abc ± 3.36 168.23d ± 1.57 176.30c ± 4.29 183.60ab ± 2.37 182.51ab ± 1.31 缬氨酸 208.26a ± 0.59 196.73c ± 0.62 177.58e ± 1.31 203.86b ± 2.01 185.46d ± 2.27 194.92c ± 1.28 208.12a ± 4.27 202.92b ± 0.13 赖氨酸 210.37a ± 7.96 200.44ab ± 7.76 168.94d ± 2.30 183.90bcd ± 5.59 188.33bc ± 12.80 192.84bc ± 9.44 179.95cd ± 14.10 192.75bc ± 5.90 异亮氨酸 163.44a ± 1.38 155.49bc ± 1.03 134.26e ± 0.81 159.50ab ± 1.79 144.25d ± 2.90 151.91c ± 3.40 160.15a ± 4.90 153.66c ± 0.75 亮氨酸 192.16b ± 1.73 196.21b ± 1.21 186.27c ± 0.66 131.46e ± 1.43 175.31d ± 3.44 181.58c ± 4.07 203.64a ± 6.17 61.71f ± 0.50 苯丙氨酸 102.65a ± 1.42 94.75b ± 0.88 86.10c ± 2.54 66.95e ± 1.37 72.15d ± 1.92 89.17c ± 3.60 48.05f ± 0.69 BCAA（分支链氨基酸） 563.86a ± 3.69 548.43b ± 2.71 498.11d ± 2.70 494.82d ± 5.02 505.03d ± 8.51 528.41c ± 8.71 571.91a ± 15.17 418.29e ± 1.32 EAA（总必需氨基酸） 1,129.57a ± 6.63 1,084.35b ± 6.26 963.97f ± 9.32 1,011.62d ± 5.51 990.44e ± 11.71 1,031.99c ± 12.96 1,079.58b ± 9.83 905.63g ± 6.65 HAA（疏水性氨基酸） 181.97b ± 0.66 177.17c ± 0.85 166.10e ± 0.34 166.67e ± 1.17 162.37f ± 2.19 173.36d ± 1.35 187.60a ± 2.84 151.56g ± 0.20 总氨基酸 3,271.12a ± 31.73 3,081.87bc ± 37.33 2,931.40e ± 14.03 3,033,89cd ± 14.42 3,002.03d ± 52.31 3,122.06b ± 28.61 3,284.04a ± 38.86 3,046.31cd ± 33.80 同一列中的上标表示草菇水解物之间存在显著差异（p < 0.05）。BCAA代表分支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）。TEAA和TAA分别代表总必需氨基酸和总氨基酸。HAA代表疏水性氨基酸（丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸）。GI表示伽马辐射；HPP表示高压处理；SW表示亚临界水。谷氨酸在所有处理方法中的含量最高，范围为794.41至958.21 mg/100 mL。这种氨基酸以其赋予的鲜味而闻名，并且一直被认为是草菇中的主要成分。草菇中高水平的谷氨酸和天冬氨酸对其美味和浓郁的风味有重要贡献，这使它们成为味精和谷氨酸钠的天然替代品。在必需氨基酸中，缬氨酸（177.58–208.26 mg/100 mL）和赖氨酸（168.94–210.37 mg/100 mL）最为丰富，这与先前的研究报告一致，这些报告指出V. volvacea是缬氨酸、亮氨酸和色氨酸的丰富来源。这些结果强调了蘑菇水解物作为替代动物源性蛋白质的有希望的选择。3.1.5. 总酚含量已知蘑菇含有酚类化合物，这些化合物是一类含有一个或多个酚环的次级代谢产物，具有多种生物活性，特别是抗氧化特性（Ketemepi等人，2024年）。如图2A所示，亚临界水处理后进行酶水解显著提高了总酚含量。Flavourzyme处理过的样品含量最高（13.89 mg GAE/mL），其次是Alcalase处理过的样品（13.10 mg GAE/mL），而对照组、伽马辐射处理组和HPP处理组的含量较低但接近（10.81–11.48 mg GAE/mL）。Lazi?等人（2024年）使用亚临界水、微波和超声波辅助提取等多种提取技术研究了Inonotus obliquus（Chaga蘑菇），他们的研究表明，在较高温度（例如200°C）下，亚临界水提取方法获得了最高的总酚含量。这种改善归因于亚临界条件下水的物理化学性质变化，如粘度降低和氢键减弱，这些变化增强了溶剂对酚类化合物的渗透和溶解能力（Zhang等人，2020年）。当前的研究结果证实，亚临界水处理，特别是与Flavourzyme水解结合使用，是提高草菇中酚类化合物回收效率的有效策略。下载：下载高分辨率图片（444KB）下载：下载全尺寸图片图2. 使用不同物理预处理和酶水解方法处理的草菇水解物的总酚含量（A）、DPPH测定（B）和FRAP测定（C）。注：不同字母（a–e）表示具有显著差异（p < 0.05）。GI表示伽马辐射；HPP表示高压处理；SW表示亚临界水。3.1.6. 2,2-二苯基-1-皮克里尔肼（DPPH）抗氧化活性通过DPPH测定法进行评估，该方法基于电子转移（ET）或氢原子转移（HAT）原理。如图2B所示，酶的类型具有统计学上的显著影响，而预处理方法和预处理与酶类型的相互作用则没有显著影响。所有样品的抗氧化活性范围为0.20–0.22 mg Trolox/mL。Flavourzyme处理后进行酶水解的样品抗氧化活性最高（0.22 mg Trolox/mL），表明Flavourzyme在水解过程中比Alcalase具有更强的自由基清除能力。Tran等人（2021年）也报告了类似的结果，Flavourzyme处理过的样品表现出比Alcalase处理过的样品更强的抗氧化活性。Flavourzyme的更强性能可能与肽的组成有关。Michalak等人（2023年）对Trametes versicolor（鸡尾菇）提取物的研究显示，肽的组成与抗氧化活性密切相关。特别是组氨酸含有带正电荷的咪唑基团，可以作为质子捐赠者通过还原作用中和自由基如DPPH。将组氨酸含量与DPPH自由基清除活性进行比较时，发现经过HPP处理后再用Flavourzyme水解的样品具有最高的组氨酸含量（64.03 mg/100 mL），同时也表现出最高的DPPH清除活性。相比之下，经过亚临界水处理后再用Alcalase处理的样品具有最低的组氨酸含量和最低的抗氧化活性。这些发现表明，抗氧化潜力不仅受酶类型的影响，还受所得水解物中氨基酸组成的影响。尽管已有研究表明HPP处理本身可以增强其他蘑菇提取物的抗氧化性能（Tepsongkroh等人，2023年），但在本研究中，其效果次于酶的特异性。总体而言，结果强调了将HPP处理与Flavourzyme水解结合使用以最大化草菇水解物的抗氧化活性的重要性。3.1.7. 铁还原抗氧化能力（FRAP）铁还原需要进一步的技术经济评估来评估其工业可行性。3.2. 添加了草蘑菇水解物的纯素蛋白棒的特性表征 选择用于产品开发的水解物不仅仅基于抗氧化能力，还基于对配方和加工相关多个因素的全面评估。尽管Flavourzyme通常具有略高的抗氧化活性，但差异并不显著，而且其较高的成本限制了其实际应用，相比之下Alcalase更加实用（He等人，2020年）。此外，Alcalase因其在多种蛋白质来源中的多功能性、成本效益和催化性能而得到了广泛认可（Fekete等人，2015年）。在本研究中，Alcalase水解物表现出更高的提取率和蛋白质回收率，这对生产效率至关重要。因此，考虑到总体性能，包括生产效率、抗氧化活性和成本效益，选择了经过亚临界水预处理后进行Alcalase水解的水解物作为开发纯素蛋白棒的最合适候选者。为了研究其功能贡献，将蘑菇水解物以三种不同比例（0%、6%和12%的总配方）加入其中（图3）。下载：下载高分辨率图片（580KB）下载：下载全尺寸图片图3. 添加了草蘑菇水解物的纯素蛋白棒。3.2.1. 蛋白质含量 添加了不同比例草蘑菇水解物的纯素蛋白棒的蛋白质含量如表4所示。正如预期的那样，随着水解物的添加，蛋白质含量增加。不含水解物的对照配方含有22.10%的蛋白质，这显著低于含6%和12%水解物的配方（p < 0.05）。然而，含有6%（22.56%）和12%（22.83%）水解物的蛋白棒之间没有显著差异，表明在较高添加量时，额外的水解物贡献达到了一个平台期。尽管6%和12%水解物之间的总蛋白质含量增加不大，但较高的添加量可能通过含有生物活性肽和相关抗氧化化合物来提高营养价值。因此，除了增加蛋白质外，添加草蘑菇水解物还有潜力提升产品的生物价值。表4. 添加了草蘑菇水解物的纯素蛋白棒的理化特性。参数分析 添加了草蘑菇水解物的纯素蛋白棒（%w/w）0% 6% 12% 蛋白质含量（%）22.10b ± 0.21 22.56a ± 0.21 22.83a ± 0.14 水分活度（aw）0.71a ± 0.00 0.68b ± 0.00 0.68b ± 0.00 颜色 亮度（L*）12.93a ± 0.42 12.47ab ± 0.21 11.97b ± 0.25 红度（a*）4.23b ± 0.09 4.35ab ± 0.07 4.56a ± 0.14 黄度（b*）5.94b ± 0.24 6.51ab ± 0.31 6.34b ± 0.18 总色差（ΔE*）-0.78 ± 0.22 1.06 ± 0.29 同一行中的上标表示添加了草蘑菇水解物的纯素蛋白棒之间存在显著差异（p < 0.05）。3.2.2. 水分活度 水分活度（aw）反映了可用于微生物和酶活性的自由水含量。如表4所示，不含水解物的对照配方具有最高的aw值（0.71），这显著高于含6%和12%水解物的配方（0.68，p < 0.05）。随着水解物的添加，aw值降低可能是由于固体和蛋白质-水相互作用增加，减少了基质中的自由水比例。所开发蛋白棒的aw值在0.68到0.71之间，低于通常与快速微生物繁殖相关的阈值。一般来说，aw值高于0.80有利于细菌、酵母和霉菌的生长，某些产生霉菌毒素的真菌在aw值低至0.78时也能生长（Tapia, Alzamora, & Chirife, 2020）。因此，将aw值保持在这一水平以下对于延长保质期和确保产品安全非常重要，而无需过度依赖防腐剂。3.2.3. 颜色 纯素蛋白棒的仪器测量颜色值如表4所示。随着草蘑菇水解物添加量的增加，亮度（L*）逐渐降低，12%的配方显示出最低的值（11.97）。相比之下，红色（a*）和黄色（b*）随着水解物的添加而增加，12%的蛋白棒显示出显著更高的a*（4.56）和b*（6.34）值。这些趋势表明，较高的水解物添加量使得蛋白棒颜色更深，红色和黄色调更强。这些变化可能是由于烘焙过程中的美拉德反应（也称为非酶促褐变），这种反应在蛋白质含量较高时更为明显，导致a*和b*值增加。较深的颜色以及增加的红色和黄色调也可能源于蘑菇水解物的天然棕黄色，这与含有水解物的样品的整体较暗外观相匹配（见图3）。总色差（ΔE）值进一步支持了这些观察结果。与对照组相比，含有6%和12%蘑菇水解物的蛋白棒显示出较低的ΔE值（分别为0.78和1.06）。值得注意的是，ΔE值大于1通常被认为是视觉上可察觉的，这表明12%配方中的颜色差异在直接比较时可能是可以察觉的，但总体上仍然较为微妙（Altmann等人，2022年）。表5. 添加了草蘑菇水解物的纯素蛋白棒的质地特性。参数分析 添加了草蘑菇水解物的纯素蛋白棒（%w/w）0% 6% 12% 质地分析（TPA）硬度（N）ns 138.21 ± 3.74 139.03 ± 5.50 141.60 ± 3.93 弹性（mm）0.28b ± 0.03 0.35a ± 0.03 0.37a ± 0.03 黏附性 ns -3.08 ± 0.52 -2.96 ± 0.69 -3.06 ± 0.73 内聚性（N）0.35b ± 0.05 0.39ab ± 0.03 0.41a ± 0.02 咀嚼性（Nmm） ns 18.64 ± 1.04 19.15 ± 1.82 19.88 ± 0.65 断裂力（N）ns 11.59 ± 1.09 11.28 ± 1.19 11.88 ± 0.42 同一行中的上标表示添加了草蘑菇水解物的纯素蛋白棒之间存在显著差异（p < 0.05）。3.2.4. 质地特性 使用质地分析（TPA）评估了纯素蛋白棒的质地特性。硬度 and 断裂力值在不同配方之间没有显著差异，表明添加高达12%的水解物并未改变产品的硬度或脆性。相反，弹性 and 内聚性随着水解物含量的增加而提高，12%的配方显示出显著高于对照组的值（p < 0.05）。这种趋势可能是由于肽-淀粉相互作用提高了结构柔韧性和网络凝聚力，这在前面的蛋白质水解物强化营养棒研究中也有观察到（Asharaf等人，2025年）。至于咀嚼性，它反映了咀嚼产品直至可以吞咽所需的能量和时间（Cho等人，2023年），不同配方之间没有发现显著差异（p > 0.05）。所有样品的黏附性值略为负值，且没有显著差异（p > 0.05）。尽管蛋白棒中含有天然粘性的枣糖浆，但它并未导致蛋白棒过于黏附。三点弯曲试验进一步证实了脆性未受影响，因为所有配方的断裂力相当（11.28–11.88 N）。这些发现表明，添加高达12%的草蘑菇水解物不会影响蛋白棒的硬度或断裂性能。储存过程中质地硬化通常被认为是蛋白质棒配方中的一个主要挑战，通常与糖结晶、蛋白质聚集和美拉德反应有关（Jiang, Wang, & Zhao, 2021）。先前的研究表明，用蛋白质水解物替代蛋白质分离物可以通过减少蛋白质-蛋白质相互作用来减轻储存相关的硬化（McMahon, Adams, & McManus, 2009）。然而，在本研究中没有观察到硬度的降低，这可能是因为所测试的添加量相对较低。相比之下，Khodaei, Noci, 和 Ryan（2025）使用了更高的水解物含量（高达50%）结合乳清蛋白分离物，并能够显著减少储存过程中的质地硬化。3.2.5. 总多酚含量 除了蛋白质摄入外，多酚是另一个关键的饮食成分，因为许多研究强调了它们对健康和抗衰老的有益作用（Yessenkyzy等人，2020）。如图4A所示，添加草蘑菇水解物后，纯素蛋白棒的总多酚含量显著增加（p < 0.05）。不含水解物的对照配方（0%）的值为495.93 mg GAE/100 g。相比之下，含有6%和12%水解物的配方的值分别为694.44 mg GAE/100 g 和1,037.88 mg GAE/100 g。这些结果表明，草蘑菇水解物在增加产品中的生物活性化合物数量方面起着重要作用，特别是具有潜在健康益处的多酚化合物。下载：下载高分辨率图片（572KB）下载：下载全尺寸图片图4. 添加了草蘑菇水解物的纯素蛋白棒的总多酚含量（A），DPPH测定（B），FRAP测定（C）。脚注：不同字母（a–c）的蛋白棒表示存在显著差异（p < 0.05）。3.2.6. 抗氧化活性 如图4B和4C所示，添加蘑菇水解物后，纯素蛋白棒的抗氧化活性显著增加（p < 0.05）。DPPH测定显示出适度的但显著的自由基清除能力提高，而FRAP测定显示出明显的增强，12%的配方（1,779.86 mg FeSO?/100 g）的还原能力是对照组的两倍多。含有水解物的蛋白棒中的多酚化合物通过产生具有电子丰富基团的较小片段来增强蛋白质的抗氧化潜力（Phongthai等人，2017）。蘑菇水解物和多酚之间的这种协同效应有助于改善纯素蛋白棒和其他植物基功能性食品的功能特性。在本研究中，考虑了蘑菇水解物的抗氧化特性和在食品系统中的潜在功能作用。水解过程中产生的低分子量肽和自由氨基可能会提高分子的流动性，并促进与还原糖的反应。因此，有报道称蛋白质水解物会加速褐变反应并在储存过程中增加必需氨基酸的损失，从而可能降低营养价值和生物功能性（Rao等人，2016）。因此，水解物中的抗氧化化合物可能有助于减轻这些氧化和化学变化，从而提高产品质量。4. 结论 本研究调查了不同预处理和酶对草蘑菇水解物提取和功能特性的影响。亚临界水预处理产生了最高的总多酚含量和抗氧化活性，而高压处理产生了最高的TCA可溶性肽产量。伽马辐照产生了最高的提取率和蛋白质回收率。在各种酶中，Flavourzyme比Alcalase释放出更多的肽。总体而言，这些发现表明，可持续预处理与合适蛋白水解酶的结合在优化水解性能和增强功能特性方面起着关键作用。对于产品应用，基于其功能特性和生产效率，选择了经过亚临界水预处理后进行Alcalase水解得到的水解物。这些水解物成功应用于纯素蛋白棒配方中，突显了它们作为植物基食品功能性成分的潜力。CRediT作者贡献声明Phornsaran Saengprachoom：研究、方法论、数据管理、软件开发、数据分析、可视化、初稿撰写。Supawong Chaisuwan：概念化、监督、资金获取、审稿与编辑。利益声明-无本研究中未涉及任何人体或动物实验。参考文献未列出Abd-El和Sallam, 2020, Cheetangdee和Benjakul, 2015, Habinshuti等人, 2020, Hoyle和Merrltt, 1994, Nakalembe和Kabasa, 2013CRediT作者贡献声明Phornsaran Saengprachoom：初稿撰写、可视化、软件开发、方法论、数据分析、数据管理。Supattra Supawong：审稿与编辑、验证、监督、资金获取、概念化。