枣果实水提取物对亚慢性暴露下小鼠由玉米赤霉醇引起的免疫毒性的保护作用

《Applied Food Research》：Protective effect of Ziziphus lotus fruit aqueous extract against zearalenone-induced immunotoxicity in mice under sub-chronic exposure

　　海法·迪夫|马西莫·文迪蒂|贾利拉·本·萨拉赫-阿巴斯|费尔杰尼·祖伊迪|艾哈迈德·阿尔-阿米里|玛拉·卡列哈-戈麦斯|胡达·贝拉达|萨米尔·阿巴斯
莫纳斯提尔大学生物技术高等研究院基因、生物多样性和生物资源价值化实验室，莫纳斯提尔，突尼斯

**摘要**
玉米赤霉烯酮（ZEN）是一种由镰刀菌产生的霉菌毒素，其对多种生物系统具有毒性作用，包括肝脏和免疫反应。本研究旨在探讨朱莉珠果提取物（ZLFE）对ZEN引起的毒性的保护作用。免疫荧光分析显示，在ZEN处理组中，凋亡标志物（特别是p53）以及促炎细胞因子IL-6和NF-κB在肝组织中显著过表达，表明肝脏受到严重损伤并伴有局部炎症。然而，同时使用ZLFE显著降低了这些效应，证明了其抗氧化和抗炎特性。此外，ZEN会导致全身免疫抑制，表现为外周血液中炎症细胞因子水平下降（IFN-γ、TNF-α、IL-12、IL-6和IL-1β水平降低），而补充ZLFE则显著将这些细胞因子水平恢复到对照值。研究还证实了ZEN的免疫抑制作用，表现为T细胞群体（CD4+、CD8+、CD54+和CD56+）及免疫球蛋白水平（IgA和IgG）下降。值得注意的是，ZLFE恢复了免疫平衡，减轻了ZEN的有害影响。这些发现表明，富含黄酮类和酚酸等生物活性化合物的ZLFE可以作为天然保护剂，对抗ZEN引起的凋亡、肝脏炎症和免疫抑制。

**1. 引言**
许多微生物真菌，包括曲霉、青霉菌和镰刀菌，都会产生霉菌毒素，这些毒素是它们的次级代谢产物（Ismaiel和Papenbrock，2015）。在理想的温度和湿度条件下，这些有害物质会在多种基质上生长，尤其是食品上（Hamad，2012）。由于霉菌毒素对人类和动物健康的负面影响以及巨大的经济后果，它们已成为全球性的问题。饲料中的霉菌毒素污染在畜牧业生产中尤为严重，因为它直接损害动物的健康、生产力和食品安全，导致全球范围内的巨大经济损失（Akinmoladun等，2025）。根据Petsinger和Weidenbach（2002）的研究，黄曲霉素、赭曲霉毒素、伏马菌素、曲霉烯酮（ZEN）是最重要的影响食品安全的霉菌毒素类型。

玉米赤霉烯酮（ZEN）主要由镰刀菌产生，常见于谷物作物和饲料中（Mahato等，2021）。其已知的毒性作用包括生殖毒性、肝毒性、肾毒性、细胞毒性和遗传毒性（Ropejko和Twaru?ek，2021）。长期食用受ZEN污染的饲料的牲畜和家禽可能会出现免疫抑制、生殖功能障碍和生长性能下降（Liu和Applegate，2020）。猪、牛和鸡等农场动物接触ZEN与生育能力下降、激素失衡、免疫反应改变及感染风险增加有关（Taranu等，2020）。尤其是猪对ZEN特别敏感，长期暴露可能导致雌激素过高、发情周期不规律、受孕率下降和胚胎丢失率增加。在家禽中，高污染水平会降低产蛋量和孵化率以及精液质量。反刍动物摄入ZEN后，生育能力可能下降，并在牛奶和其他动物产品中残留（Yilmaz等，2025）。人类健康也受到ZEN在动物产品（如肉类、牛奶和鸡蛋）中的残留物的威胁（Llorens等，2022）。这些不良影响凸显了迫切需要更好的策略来减轻ZEN对人类和动物的毒性。因此，开发安全有效的天然策略以对抗动物生产系统中的ZEN毒性具有重大的科学和实践意义。

突尼斯炎热潮湿的气候，加上其地理位置和社会经济条件，为产生霉菌毒素的霉菌提供了理想的环境。自20世纪80年代以来，已在突尼斯发现多种霉菌毒素，包括赭曲霉毒素、链格孢霉素、曲霉烯酮、玉米赤霉烯酮、伏马菌素和柠檬烯酮（Abbès等，2012）。鼠李科植物，尤其是朱莉珠属植物，在传统医学中被广泛用作治疗各种疾病的天然药物（Ajjoun等，2021）。朱莉珠果（Z. lotus）原产于地中海地区，在北非和亚洲部分地区也有广泛分布，以其治疗特性而闻名（Bencheikh等，2023）。传统上，朱莉珠果被用于治疗糖尿病、消化系统疾病、尿路感染、神经系统和心血管疾病以及皮肤感染（Bencheikh等，2019）。在这种背景下，植物提取物越来越多地被视为合成添加剂的天然替代品，有助于减少霉菌毒素对牲畜的伤害并改善其健康。

植物化学研究在朱莉珠果提取物中发现了多种生物活性化合物，如多酚、黄酮类、萜类和酚酸（Marmouzi等，2019）。这些化合物具有文献记载的药理活性，包括抗氧化、抗炎、抗菌、保肝和抗增殖作用（Berkani等，2021）。在霉菌毒素暴露的情况下，这些特性尤为重要，因为氧化应激和炎症在毒性过程中起着关键作用（Magnin等，2016）。此外，值得注意的毒理学研究证实了朱莉珠果提取物用于制药应用的安全性（Bekkar等，2021）。

除了营养价值外，朱莉珠果还因其促进健康和预防疾病的能力而受到重视（Abdoul-Azize等，2013）。无论是新鲜、干燥还是加工后的形式，这些果实都具有重要的药理和营养保健潜力（Abcha等，2021）。由于其药理特性，包括免疫刺激、抗炎、抗氧化和抗菌作用，朱莉珠果成为缓解ZEN毒性的有希望的候选物质（Mehdizadeh等，2023）。因此，具有免疫调节、抗炎和抗氧化特性的植物提取物，如朱莉珠果提取物，是增强动物健康和食品安全、减轻ZEN引起的氧化和炎症损害的合理且有前景的策略（Grosu等，2023）。因此，在ZEN暴露背景下研究其保护作用对于制定可持续和天然的动物生产和食品安全策略尤为重要。

本研究旨在评估朱莉珠果提取物（ZLFE）对小鼠ZEN诱导的免疫调节的保护作用。考虑到ZEN的免疫毒性和促炎作用以及ZLFE已知的免疫调节和抗炎潜力，本研究考察了凋亡（p53）、炎症、促炎细胞因子（TNF-α和IL-1）、淋巴细胞表面标志物（CD4+、CD8+、CD54+和CD56+）、体液免疫反应（IgA和IgG）以及ZEN在淋巴器官组织中的含量等因素。研究旨在探索朱莉珠果提取物在预防ZEN引起的免疫系统毒性方面的治疗潜力。尽管本研究是在小鼠模型中进行的，但它为ZLFE作为天然保护剂对抗农场动物ZEN诱导的免疫毒性的潜在应用提供了相关见解。

**2. 材料与方法**
**2.1. 实验设计和样本分析**
**2.1.1. 从朱莉珠果中制备和提取生物活性化合物**
朱莉珠果是一种在突尼斯广泛分布的落叶植物，传统上被用作浸剂或粉末，因其富含酚类化合物、碳水化合物和黄酮类。在我之前的研究（Dhif等，2025）中，分析了不同植物部位的成分，重点是酚类化合物、碳水化合物和蛋白质的提取，采用了脉冲电场提取、常规水提取和常规水醇提取三种方法。化学分析通过分光光度法和Triple TOF-LC-MS/MS进行详细酚类化合物分析。

**2.1.2. 动物、实验设计和样本收集**
从突尼斯巴斯德研究所获取8周大的Balb/c雌性小鼠，然后分别关在不锈钢笼子中，控制温度（22°C ± 2°C）、光照/黑暗周期和湿度（55% ± 20%）。小鼠可以自由摄取食物和水。小鼠随机分为四组（n = 6），接受以下处理：
1) 对照组，每天口服200 μl PBS。
2) 接受5 × 10?3 g/kg体重的朱莉珠果提取物（ZLFE）处理的组。
3) 接受40 mg/kg体重的玉米赤霉烯酮（ZEN）处理的组。
4) 同时接受ZEN（40 mg/kg体重）和ZLFE（5.10?3 g/kg体重）处理的组。
ZEN由Sigma Chemical Co.（美国密苏里州圣路易斯）提供，并以乙醇/水[1 :1 (v/v)的比例配制成储库溶液，储存在+4°C。处理持续10天，每5天监测一次体重。最后一次处理后48小时，小鼠被处死。收集血液样本以测定淋巴细胞计数、免疫球蛋白G（IgG）水平和促炎细胞因子。采集肝脏组织并分为两部分：一部分储存在-80°C以进行后续分子和生化分析，另一部分用10%福尔马林固定用于免疫荧光分析。

**2.1.3. 免疫荧光分析**
根据Venditti和Minucci（2022）的方法进行肝脏组织的免疫荧光染色（Venditti和Minucci，2022），具体条件如下：
从雌性BALB/c小鼠获取5 μm的组织切片，脱蜡并重新水化后放入共济液中冷却。切片用0.56 g甘氨酸在50 mL PBS中处理10分钟，然后用PBS洗涤3次。用500 μL Triton X-100在50 mL PBS中处理10-15分钟，再用PBS洗涤3次。细胞用疏水笔（DakoPen）标记，室温下用5% BSA + 20%正常山羊血清封闭1小时，然后在4°C下过夜与一抗孵育：抗-p53（ab90363，1:500）、抗-IL-6（ab229381，1:100）和抗-NF-κB（ab16502，1:100）（Abcam，英国剑桥）。切片用PBS洗涤3次，然后用二次抗體抗-IgG Alexa Fluor? 488（ab150077，1:1000）和抗-IgG Alexa Fluor? 488（ab150113，1:1000）在室温下孵育1小时（Abcam，英国剑桥）。之后用DAPI（4′,6-二氨基-2-苯基吲哚）（Molecular Probes，俄勒冈州尤金）洗涤3次，用Leica DM5000 B+ CTR 5000显微镜和IM 1000软件（v4.7.0）成像。使用ImageJ进行密度分析（每个样本30个视野；每组240个视野）。

**表1. 免疫荧光方法中使用的抗体列表**
| 抗体 | 表位 | 宿主 clase | 操作 | 引用 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| NF-κB | B | 小鼠IgG | IF | Wang等，2017 |
| IL-6 | IL-6 | 小鼠IgG2b | Mohanraj等，2019 |
| p53 | P53 | 353-391 | 小鼠IgG | Teke等，2018 |

**2.2. 免疫和细胞因子分析**
**2.2.1. 外周血液中的细胞因子释放**
使用特定ELISA试剂盒根据制造商协议量化雌性BALB/c小鼠血浆中的促炎细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-12 p70、IL-6和IL-1β）（BD OptEIA?）。血浆样本按1:2比例稀释在检测稀释液中。IFN-γ、TNF-α、IL-12 p70和IL-1β的检测范围分别为1.7-250、7.8-500、1.6-250和1.56-100 ng/mL，试剂盒来自BD Biosciences和ACROBiosystems（Abcam，英国剑桥）。使用BioTek Synergy 2微量板读数器在450 nm处测量吸光度，并使用Gen5软件根据标准曲线计算浓度。每组6只小鼠的所有样本均重复分析两次。

**2.2.2. 免疫细胞亚型分析**
使用双色流式细胞术分析细胞亚型。在每只小鼠的1 ml肝素化血液中，用0.02 ml FACSLysing溶液裂解红细胞。剩余细胞与含有荧光异硫氰酸酯（FITC）或藻红（PE）的单克隆抗体的悬浮液一起在室温下孵育20分钟，针对CD4、CD8、CD54或CD56表面标记。然后在FACScan流式细胞仪（Becton Dickinson）上进行分析，配备Cellquest软件。每样本至少分析10,000个事件，测量淋巴细胞数量（n = 2000）并评估该群体中的阳性细胞百分比。

**2.2.3. 免疫球蛋白谱分析**
使用动力学浊度法测量每只小鼠血清中的总免疫球蛋白Ig A和Ig G水平（Roche Diagnostics，西班牙巴塞罗那）。

**2.2.4. ZEN提取方法和UHPLC-MS/MS组织样本分析**
采用McElhinney（2015）的QuEChERS方法进行多重霉菌毒素提取（McElhinney等，2015）。在此实验中，称量5 g肝、脾、淋巴结和胸腺组织（精确度d = 0.0001 g），放入50 mL离心管中。然后加入20 mL提取溶液（乙腈/水/醋酸 = 49.5/49.5/1 V/V/V）。混合液在多旋转搅拌器（PTR-35，Grant-bio）中摇晃15分钟。接着加入提取试剂盒（roQQuECheRS EN 15562，Phenomenex，美国）。经过10分钟的振荡后，样品以9000转/分钟的速度离心10分钟，然后取200微升的上清液放入小瓶中。接着，加入600微升（水/乙酸；99.5/0.5 V/V）的混合液，并通过孔径为0.45微米的PTFE注射滤膜过滤。大约400微升的滤液与100微升的C13混合后，使用超高效液相色谱（UHPLC，岛津公司，东京，日本）结合质谱仪（8040，岛津公司，东京，日本）进行分析。对于组织样本中多种霉菌毒素的UHPLC-MS/MS分析，分离工作是通过Phenomenex提供的C18分析柱（100A；内径50×2.1毫米）完成的，柱温保持在50°C。色谱洗脱使用流动相组成：99.5%的水和0.5%的乙酸（A相）以及99.5%的异丙醇和0.5%的乙酸（B相）。梯度设置为：90% A（0.01分钟），45% A（1.5分钟），15% A（3.5分钟），20% A（4分钟），98% A（4.01分钟）和98% A（11分钟）。柱流率为0.4毫升/分钟，进样量为50微升。质谱仪采用正负切换离子电喷雾离子化源（ESI）进行操作，并通过多重反应监测进行数据采集。质谱仪的参数包括：解溶剂温度250°C；加热块温度400°C；雾化气体流量2.5升/分钟；干燥气体流量15升/分钟；CID气体压力270千帕（氩气）。使用空白样品强化实验来测定霉菌毒素从组织样本中的提取回收率。每种预先测试为阴性的组织添加了5克，并在提取前加入不同水平的霉菌毒素。

2.3 统计分析
数据以平均值±标准误差（SEM）的形式提供。统计分析使用GraphPad Prism 5.0软件（GraphPad Software，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）进行。P值<0.05表示统计学上的显著差异。对于涉及两个以上组的比较（细胞因子水平、免疫荧光定量和组织ZEN含量），采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey事后检验。学生t检验用于比较淋巴细胞亚型和免疫球蛋白水平组间的差异。统计显著性用以下符号表示：a：p < 0.05 vs. 对照组（CTR），b：p < 0.05 vs. ZLFE，c：p < 0.05 vs. ZEN，d：p < 0.05 vs. ZEN + ZLFE。

3 结果与讨论
3.1 西藏莲子的提取物含量
西藏莲子提取物（ZLFE）显示出重要的抗氧化能力，并且富含碳水化合物、蛋白质和酚类化合物。常见的黄酮类化合物槲皮素和阿魏酸在ZLFE中也有显著存在（数据已发表）。总体而言，PEF提取的植物化学结果显示ZLFE中含有大量的总多酚。多酚的含量达到288.98 ± 7.2微摩尔/100毫克新鲜重量，相当于9.17毫克（约9%）。

3.2 ZEN和/或ZLFE对细胞凋亡的影响
p53表达的免疫荧光（IF）分析显示ZEN和ZLFE对肝细胞凋亡的影响存在显著差异（图1）。
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图1. 雌性BALB/c小鼠肝脏组织中的p53免疫荧光。（A）显示p53表达的代表性图像（绿色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。刻度尺：50微米。（B）定量（平均值±标准误差，n=30个视野/组，来自3只小鼠）。单因素方差分析+ Tukey事后检验。条形图上的字母表示显著差异（p < 0.05）。cd：ZLFE显著不同于ZEN和ZEN+ZLFE；abd：ZEN显著不同于CTR，ZLFE和ZEN+ZLFE：abc：ZEN+ZLFE显著不同于CTR，ZEN和ZLFE。
与对照组（CTR）相比，ZEN处理组观察到p53的显著过表达（p < 0.0001；图1B），这可能表明与肝细胞损伤相关的凋亡信号通路被激活。p53作为细胞死亡的关键调节因子，通常参与内在的凋亡途径，其在此处的表达与潜在的线粒体功能障碍和下游caspase激活一致，尽管这些事件在当前研究中未直接评估，但已有研究支持这一点（Zheng等人，2018年）。这一观察结果与ZEN破坏细胞增殖和细胞死亡之间的平衡、导致致癌基因和肿瘤抑制基因失调的证据相符（Ayed-Boussema等人，2008年）。
除了在凋亡中的作用外，p53还与免疫调节和炎症反应相关。其上调可能表明与ZEN诱导的免疫毒性相关的细胞应激，如氧化应激和免疫失衡。因此，在ZEN组中发现的p53表达升高可能与凋亡信号传导相关，但也可能对ZEN暴露引起的更广泛的免疫毒性后果有所贡献（Yu等人，2011年；Sang等人，2026年）。
相比之下，ZEN和ZLFE联合处理组相比单独使用ZEN组，p53的表达显著降低（p < 0.0001；图1B）。这一结果突显了ZLFE在减轻ZEN诱导的细胞应激和凋亡相关信号传导方面的保护作用。观察到的p53水平下降可能归因于ZLFE中存在的生物活性化合物，包括黄酮类（槲皮素、芦丁和儿茶素）和酚酸（没食子酸、绿原酸和咖啡酸），这些化合物以其强大的抗氧化和抗炎特性而闻名（Jose Merlin等人，2021年）。这些化合物可能通过减少氧化应激、调节凋亡相关通路以及改善细胞稳态来减轻ZEN引起的损伤。
这些发现与先前的研究结果一致，即霉菌毒素如ZEN通过涉及p53激活和氧化应激的机制诱导凋亡（Ren等人，2017年）。此外，研究还表明天然生物活性化合物如槲皮素和没食子酸可以触发癌细胞的凋亡，同时保护健康细胞免受氧化损伤（Wang等人，2023年）。
值得注意的是，在当前研究中，凋亡主要通过p53表达作为凋亡信号传导的上游指标进行检测。尽管线粒体事件和执行者caspase经常参与这一过程，但在此研究中并未明确探讨。因此，这些发现应被视为凋亡启动的证据，而不是对凋亡机制的全面分析。
总体而言，本研究中观察到的ZLFE的保护作用表明西藏莲子提取物在减轻ZEN诱导的免疫毒性方面具有潜在的价值，特别是通过调节如p53这样的应激响应通路。

3.3 ZEN和/或ZLFE对炎症的影响
本研究结果表明，ZEN对肝脏具有潜在的促炎作用，而ZLFE可能在减轻这些效应方面发挥重要的保护作用。这些发现主要反映了局部肝脏炎症标志物，而不是全身免疫激活。ZEN暴露导致关键的炎症标志物（包括IL-6和NF-κB）显著增加。IL-6是一种在介导急性和全身炎症反应中起关键作用的细胞因子，在ZEN暴露的肝脏组织中表现出显著的表达（图2）。
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图2. 雌性BALB/c小鼠肝脏组织中的IL-6免疫荧光。（A）显示IL-6表达的代表性图像（绿色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。刻度尺：50微米。（B）定量（平均值±标准误差，n=30个视野/组，来自3只小鼠）。条形图上的字母表示显著差异（p < 0.05）。cd：ZLFE显著不同于ZEN和ZEN+ZLFE；abd：ZEN显著不同于CTR，ZLFE和ZEN+ZLFE：abc：ZEN+ZLFE显著不同于CTR，ZEN和ZLFE。
同样，NF-κB（与促炎基因表达调控相关的转录因子）也受到ZEN的显著影响（图3）。
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图3. 雌性BALB/c小鼠肝脏组织中的NF-κB免疫荧光。（A）显示NF-κB表达的代表性图像（绿色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。刻度尺：50微米。（B）定量（平均值±标准误差，n=30个视野/组）。条形图上的字母表示显著差异（p < 0.05）。cd：ZLFE显著不同于ZEN和ZEN+ZLFE；abd：ZEN显著不同于CTR，ZLFE和ZEN+ZLFE：abc：ZEN+ZLFE显著不同于CTR，ZEN和ZLFE。
这些发现与先前的研究一致，这些研究表明ZEN可能影响NF-κB信号通路，从而增加促炎细胞因子（如IL-6）的表达，从而放大炎症反应（Ropejko和Twaru?ek，2021年）。此外，ZEN诱导的氧化应激也被认为是导致这种炎症状态的关键因素（Del Campo等人，2018年）。在这种情况下，IL-6和NF-κB被认为是评估局部炎症状态的可靠指标，尽管它们并不能完全反映潜在信号通路的复杂性。
然而，ZEN + ZLFE联合处理显著降低了炎症标志物（IL-6和NF-κB）的表达（p < 0.0001），证明了ZLFE的保护和免疫调节作用。ZLFE富含黄酮类和酚酸等生物活性化合物，它们以其抗氧化和抗炎特性而闻名，似乎可以对抗氧化应激并下调炎症通路。这些结果与Ben Ammar等人（2023年）的研究结果一致，该研究表明天然化合物如富蔻甾醇可以抑制NF-κB的激活并降低IL-6的表达（Ben Ammar等人，2023年），以及AbuZahra等人（2021年）的研究结果，他们发现泽伦骨醇也有类似的效果（AbuZahra等人，2021年）。其他研究也证实了这一点，指出从诸如grumixama和guabiju等水果中提取的多酚丰富提取物能够减少促炎细胞因子的产生（Girardelo等人，2020年）。此外，先前的研究还表明ZEN暴露会刺激巨噬细胞和中性粒细胞，增加炎症细胞因子（如IL-6）的分泌（Pistol等人，2015年）。这一现象在HepG2细胞中尤为明显（Rajendran等人，2020年），凸显了ZEN在放大免疫炎症反应中的核心作用。然而，ZLFE观察到的保护作用通过使促炎细胞因子的水平恢复正常而得到了证实，进一步强调了其治疗效果。重要的是要注意，本研究主要依赖于基于免疫荧光的IL-6和NF-κB检测来指示炎症。尽管这些标志物被广泛使用，但还需要使用qPCR或Western blot等补充方法进行额外验证，以全面阐明涉及的分子机制。总体而言，这些结果表明ZEN在肝脏组织中诱导了局部促炎反应，而ZLFE有效地减轻了这种反应。

3.4 不同处理对周围血液中细胞因子水平（TNF-α、IFNγ、IL-1β、IL-6和IL-12）的影响
结果显示，不同处理组之间的外周血液中促炎细胞因子水平存在显著差异（表2）。与肝脏组织的结果相反，循环中的细胞因子水平可能反映了受ZEN暴露影响的整体免疫状态。
**表2. ZEN和ZLFE（单独或联合使用）对小鼠外周血液中促炎细胞因子水平的影响**
参数 | 周围血液（平均值±标准误差）
| ---- | -------------- | -------------- | -------------- | ------------------- | ----------------------- | ---------------------- |
| 对照组 | | ZLFE | 5×10^-3 g/kg体重 | ZEN | 40 mg/kg体重 | ZLFE 5×10^-3 g/kg体重 + ZEN 40 mg/kg体重 | ---------------------- | ----------------------- |
| IFNγ（ng/mL） | 8.68±0.60 | 8.17±0.75a | 4.48±0.75b | 7.99±0.44c | | | |
| TNFα（ng/mL） | 5.30±0.28 | 5.10±0.31a | 3.16±0.33b | 5.11±0.82c | | | |
| IL-12（ng/mL） | 2.68±0.59 | 2.73±0.65a | 0.76±0.25b | 2.76±0.05c | | | |
| IL-6（ng/mL） | 4.18±0.49 | 4.79±0.11a | 1.56±0.27b | 4.21±0.35c | | | |
| IL-1β（ng/mL） | 2.31±0.19 | 2.93±0.41a | 0.96±0.15b | 2.26±0.35c | | | |
值表示平均值±标准误差（n=6只小鼠/组）。a：ZLFE与CTR无显著差异（p < 0.05）；b：ZEN与ZLFE和CTR有显著差异（p < 0.05）；c：ZEN+ZLFE与ZEN无显著差异（p < 0.05）。
ZEN处理导致所有测量的细胞因子水平都比对照组显著降低。例如，IFNγ水平从对照组的8.68 ± 0.60 ng/mL降至ZEN组的4.48 ± 0.75 ng/mL。同样，TNFα水平从5.30 ± 0.28 ng/mL降至3.16 ± 0.33 ng/mL，而IL-12、IL-6和IL-1β也显示出显著下降（p < 0.05）。这些发现证实了ZEN的免疫抑制作用，正如Pistol等人（2014年）之前报道的那样，他们观察到在ZEA暴露下IL-6和IFNγ水平下降。这种循环细胞因子的减少可能与ZEN对免疫细胞（如肝巨噬细胞和周围单核细胞来源的巨噬细胞）的毒性以及DNA损伤、氧化应激和蛋白质合成抑制等过程有关。
有趣的是，ZEN + ZLFE联合治疗部分恢复了细胞因子水平至对照组水平。例如，IFN-γ水平达到7.99 ± 0.44 ng/mL，TNF-α水平达到5.11 ± 0.82 ng/mL，TNF-α增加了61%，IL-1β增加了56%，IL-1β增加了42%，IL-6增加了37%，IL-12增加了28%，与ZEN组相比。这些结果表明，ZLFE具有保护和免疫调节作用，这与之前的研究结果一致，这些研究强调了植物衍生化合物对抗ZEN诱导的毒性的有益作用（Marin等人，2011年；Pistol等人，2013年；Gazzah等人，2010年）。相比之下，单独使用ZLFE并未显著影响细胞因子水平，这表明它在免疫学上是安全的。升高的肝脏炎症标志物（IL-6和NF-κB）与下降的循环细胞因子之间的差异表明，ZEN触发了分离的免疫反应。ZEN在肝脏中的暴露会导致氧化应激、DNA损伤以及炎症信号通路的激活（例如p53-NF-κB轴），从而导致促炎介质的增加和局部炎症微环境的形成（Sang等人，2026年；Liu等人，2021年）。然而，在系统水平上，ZEN经常被报道具有免疫抑制或免疫调节作用，导致外周血液中循环细胞因子的生成减少（Pistol等人，2014年；Marin等人，2011年；Pistol等人，2013年）。这种系统免疫抑制和局部炎症的双重效应与之前关于霉菌毒素诱导的免疫毒性的研究结果一致，可能取决于组织特异性、暴露时间和剂量。这些结果共同支持了一个ZEN诱导的分离免疫毒性模型，该模型以系统免疫抑制和局部肝脏炎症为特征。这一模型解释了外周血液和肝脏组织中细胞因子谱的变化，并强调了ZLFE在恢复免疫平衡中的保护作用。

3.5. ZEN和ZLFE单独或联合使用对免疫细胞表面标志物的影响
图4中的结果清楚地显示了ZEN的免疫抑制作用以及ZLFE对Balb/c小鼠特定免疫细胞群体（CD4+、CD8+、CD54+和CD56+）的保护潜力。

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图4. ZEN和ZLFE（单独或联合使用）对淋巴细胞亚型的影响。雌性Balb/c小鼠每天通过灌胃接受PBS（空心条）、ZEN（40 mg/kg体重）、ZLFE（5×10^-3 g/kg体重）（深色阴影条）或ZEN+ZLFE（浅色阴影条）处理（持续10天）。然后在实验第11天（即每种处理方式的最后一次暴露后一天）收集血液样本进行淋巴细胞计数。结果以平均值±标准误（n=6只小鼠/组）表示。学生t检验：a：显著（p < 0.05）ZEN vs. CTR；b：不显著（p > 0.01）ZLFE单独使用和ZLFE+ZEN vs. CTR。
每日口服ZEN（40 mg/kg体重）10天后，所有评估的淋巴细胞群体的百分比都显著下降，与对照组相比。具体来说，ZEN暴露导致CD4+辅助T细胞、CD8+细胞毒性T细胞、CD54+粘附标志物和CD56+自然杀伤细胞的显著减少。这些发现与之前的研究结果一致，例如Swamy等人（2004年）的研究，他们报告在各种动物模型中ZEN暴露后淋巴细胞的存活率和增殖能力都下降了。这表明ZEN可能通过损害淋巴细胞的存活和功能来影响这些淋巴细胞群体（Swamy等人，2004年）。
相比之下，单独使用ZLFE对这些淋巴细胞群体没有显著影响，其百分比与对照组相当，表明ZLFE在免疫学上是安全的，不会干扰正常的免疫功能。值得注意的是，ZEN和ZLFE联合治疗显著改善了这些淋巴细胞的水平，尽管百分比尚未完全回到对照组水平，但趋近于正常值，这突显了ZLFE在减轻ZEN诱导的免疫抑制方面的保护潜力。统计分析确认了这些结果的显著性（p < 0.05），强调了ZLFE减轻ZEN引起的免疫障碍的能力。
这些发现背后的机制与先前的研究一致，这些研究表明ZEN暴露可能通过调节细胞因子水平（如干扰素-β和IL-2）来改变免疫反应，从而导致淋巴细胞增殖和存活率的降低（Bulgaru和Marin，2021年）。表面标志物如CD3、CD4和CD8在免疫激活和功能中起着重要作用。本研究观察到的CD4+和CD8+细胞的减少表明可能存在免疫抑制，CD4/CD8比的变化进一步强调了ZEN的免疫毒性效应（Pistol等人，2013年）。有趣的是，关于ZEN对T细胞亚群影响的研究结果存在矛盾，有些研究报道CD4+和CD8+表达增加，但大多数发现支持这些标志物的减少，与当前结果一致。
肝脏作为维持免疫稳态的中心器官，在这些过程中发挥着关键作用。ZEN暴露已被证明通过调节细胞因子水平并影响参与白细胞粘附的免疫淋巴细胞（如表达ICAM-1的CD54+细胞）和驻留库普弗细胞（肝脏巨噬细胞）来破坏肝脏的免疫调节（Yang等人，2016年）。这些破坏可能会加剧免疫功能障碍，正如ZEN处理组中CD54+细胞的显著减少所证明的那样。然而，ZEN+ZLFE组中这些细胞的部分恢复表明ZLFE有助于通过支持肝脏免疫平衡来保持免疫功能。

3.6. ZEN和ZLFE单独或联合使用对体液免疫反应的影响
表3中的数据表明，ZEN和ZLFE单独或联合使用对体液免疫反应有影响，通过测量血清中的IgA和IgG浓度来评估。

表3. ZLFE及其在雌性Balb/c小鼠中通过口服途径受污染后对免疫球蛋白诱导的保护作用
免疫球蛋白（μg/ml）
组别 | IgA | IgG
--- | --- | ---
对照组 | 7.99 ± 0.37 | 4.5 ± 0.27 |
ZLFE 5×10^-3 g/kg体重 | 7.96 ± 0.45 | 5.25 ± 0.31 |
ZEN 40 mg/kg体重 + ZLFE 5×10^-3 g/kg体重 | 7.77 ± 0.41 | 4.6 ± 0.27 |
a：ZLFE与CTR无显著差异（p > 0.05）；b：ZEN与ZLFE和CTR有显著差异（p < 0.05）。
ZEN处理（40 mg/kg体重）导致IgA（6.30 ± 0.39 μg/ml）和IgG（3.11 ± 0.30 μg/ml）水平显著下降，与对照组（IgA：7.99 ± 0.37 μg/ml；IgG：4.5 ± 0.27 μg/ml）相比，突显了ZEN的潜在免疫抑制影响。这些结果与研究表明ZEN暴露显著影响免疫球蛋白产生的研究结果一致，可能是通过涉及负责免疫球蛋白分泌的B淋巴细胞凋亡的机制（Pestka和Smolinski，2005年）。这种免疫抑制可能会削弱免疫系统有效应对病原体和管理炎症过程的能力，正如先前的肝脏模型中所报道的（Wu等人，2022年）。
相比之下，单独使用ZLFE对IgA（7.96 ± 0.45 μg/ml）或IgG（5.25 ± 0.31 μg/ml）浓度没有显著影响，与对照组相当。这表明ZLFE在正常条件下对体液免疫是中性 的，没有不良影响。有趣的是，ZLFE和ZEN的联合治疗显示出了保护潜力，IgA（7.77 ± 0.41 μg/ml）和IgG（4.6 ± 0.27 μg/ml）的水平显著改善，尽管这些水平尚未完全恢复到对照组水平，但趋近于正常值，这表明ZLFE可能减轻ZEN的免疫毒性效应。
这些发现背后的机制与先前的研究一致，这些研究表明ZEN暴露可能通过调节细胞因子水平（如干扰素-β和IL-2）来改变免疫反应，从而导致淋巴细胞增殖和存活率的降低（Bulgaru和Marin，2021年）。表面标志物如CD3、CD4和CD8在免疫激活和功能中起着重要作用。本研究中观察到的CD4+和CD8+细胞的减少表明可能存在免疫抑制，而CD4/CD8比的变化进一步强调了ZEN的免疫毒性效应（Pistol等人，2013年）。有趣的是，关于ZEN对T细胞亚群影响的研究结果存在矛盾，一些研究报道CD4+和CD8+表达增加，但大多数发现支持这些标志物的减少，与当前结果一致。
肝脏在维持免疫稳态中起着关键作用。ZEN暴露已被证明通过调节细胞因子水平并影响参与白细胞粘附的免疫淋巴细胞（如CD54+细胞）和驻留库普弗细胞（肝脏巨噬细胞）来破坏肝脏的免疫调节（Yang等人，2016年）。这些破坏可能会加剧免疫功能障碍，正如ZEN处理组中CD54+细胞的显著减少所证明的那样。然而，ZEN+ZLFE组中这些细胞的部分恢复表明ZLFE通过支持肝脏免疫平衡来帮助保持免疫功能。

3.7. ZEN和ZLFE单独或联合使用对体液免疫反应的影响
表3的数据表明，ZEN和ZLFE单独或联合使用对体液免疫反应有影响，通过测量血清中的IgA和IgG浓度来评估。

ZEN处理（40 mg/kg体重）导致IgA（6.30 ± 0.39 μg/ml）和IgG（3.11 ± 0.30 μg/ml）水平显著下降，与对照组（IgA：7.99 ± 0.37 μg/ml；IgG：4.5 ± 0.27 μg/ml）相比，突显了ZEN的潜在免疫抑制影响。这些结果与研究表明ZEN暴露显著影响免疫球蛋白产生的研究结果一致，可能是通过涉及负责免疫球蛋白分泌的B淋巴细胞凋亡的机制（Pestka和Smolinski，2005年）。这种免疫抑制可能会削弱免疫系统有效应对病原体和管理炎症过程的能力，正如之前的肝脏模型中所报道的（Wu等人，2022年）。
相比之下，单独使用ZLFE对IgA（7.96 ± 0.45 μg/ml）或IgG（5.25 ± 0.31 μg/ml）浓度没有显著影响，与对照组相当。这表明ZLFE在正常条件下对体液免疫是中性的，没有不良影响。有趣的是，ZLFE和ZEN的联合治疗显示出了保护潜力，IgA（7.77 ± 0.41 μg/ml）和IgG（4.6 ± 0.27 μg/ml）的水平显著改善，与单独使用ZEN的组相比。尽管这些水平尚未完全恢复到基线，但趋近于正常值，这表明ZLFE可能减轻ZEN的免疫毒性效应并部分恢复免疫参数。这些发现与关于保护剂的研究一致，例如槲皮素，它在ZEN诱导的肝脏损伤背景下也显示了对IgA和IgG水平的恢复效应（Han等人，2022年）。
ZEN暴露后观察到的IgA和IgG降低进一步得到了其他研究的支持，这些研究表明ZEN可以在各种动物模型中破坏体液免疫。例如，Belgaru等人（2021年）注意到ZEN暴露后十二指肠中的黏膜IgA水平下降（Bulgaru和Marin，2021年），而其他研究则强调了免疫球蛋白产生的复杂动态，包括在特定条件下降低的粪便IgA水平。此外，Atroshi等人（1994年）的研究证实，暴露于高浓度ZEN的猪的血清IgA、IgG和IgM水平显著下降，进一步证实了霉菌毒素的潜在免疫抑制特性（Pistol等人，2013年；Atroshi等人，1994年）。
相反，一些研究报道在特定的ZEN暴露条件下血清IgA和IgG水平升高。例如，Ren等人（2014年）观察到在中等剂量（20–30 mg/kg体重）ZEN处理的小鼠中免疫球蛋白水平升高，这表明ZEN对体液免疫的影响可能因剂量、暴露时间和动物模型而异。尽管如此，大多数证据指向免疫抑制，特别是在高ZEN浓度下，如本研究所示。
这些效应背后的机制可能涉及促进淋巴细胞凋亡。ZEN已在多个模型中被证明可以诱导T细胞和B细胞的凋亡，从而可能减少免疫球蛋白的分泌并损害体液免疫（Han等人，2022年）。这与ZEN降低血清IgG和IgM水平的同时抑制B细胞活性的发现一致（Pierron等人，2024年）。

3.7. 分析单独或联合使用ZEN处理的小鼠免疫系统器官组织中的ZEN含量
图5显示了单独或联合使用ZEN处理的小鼠的肝脏、脾脏、淋巴结和胸腺组织中的ZEN浓度。

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图5. 单独或联合使用ZEN处理10天的雌性小鼠的肝脏、淋巴结、胸腺和脾脏中的ZEN含量（平均值±标准误，n=6只小鼠/组）。单因素方差分析+Tukey检验：b 与对照组相比显著（p < 0.05），并与相应组织中的单独使用ZLFE或ZEN+ZLFE处理的鼠相比也显著。
在单独使用ZEN处理的组中，所有测试组织中的ZEN浓度都显著高于对照组。肝脏显示出最高的ZEN积累（31.5 μg/g组织），这与肝脏作为主要解毒器官的功能一致，在那里ZEN被广泛代谢和储存。此外，在脾脏（21.5 μg/g）、淋巴结（10.5 μg/g）和胸腺（12.5 μg/g）中也检测到了升高的ZEN水平。ZEN在免疫相关器官中的这种广泛分布突显了其系统生物利用度及其通过在这些关键组织中的积累而破坏正常免疫功能的潜力。
相比之下，单独使用ZLFE处理的鼠在测试组织中没有检测到ZEN水平，表明ZLFE不会引起ZEN的积累或毒性。值得注意的是，在同时接受ZEN和ZLFE处理的组中，所有组织中的ZEN水平都降低到检测限以下。这些结果表明ZLFE可能在减轻ZEN在组织中的积累方面起着重要作用，可能通过增强其代谢或排泄，或可能减少其胃肠道吸收。
总体而言，这些发现表明ZEN暴露会导致肝脏和免疫相关器官中的显著生物积累，这可能对其毒性效应有所贡献。然而，ZLFE有效地抵消了这种积累，提供了对抗ZEN诱导的组织损伤和免疫功能障碍的保护作用。统计学上的显著差异（p < 0.05）进一步支持了ZLFE在降低所有测试组织中ZEN水平方面的保护作用。这些发现与先前描述ZEN在暴露生物体中的广泛分布和系统效应的报告一致。
ZEN及其代谢物通常在各种组织中检测到，如肝脏、肾脏和生殖器官，以及动物产品如肉类和牛奶中（Liu和Applegate，2020年）。人类可能通过摄入这些组织或产品间接暴露于ZEN，可能导致严重的毒性效应，包括早熟、增生、子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌和乳腺癌以及基因毒性（Rogowska等人，2019年）。这些发现强调了系统理解ZEN诱导的毒性机制的必要性，以防止其对动物和人类健康的潜在威胁。实际上，ZEN主要在免疫和生殖器官中代谢和积累，使这些组织成为其毒性效应的主要目标（Hueza等人，2014年）。除了系统分布外，ZEN与胃肠道的初步相互作用在确定其毒性方面起着关键作用。然而，在到达这些器官之前，霉菌毒素首先与胃肠道相互作用，胃肠道作为抵御这些有害物质的初始屏障（Gaj?cka等人，2016年）。不应忽视霉菌毒素对胃肠道的潜在损害（Liew和Mycotoxin，2018年）。胃肠道容纳肠道微生物群，该微生物群在调节免疫系统、内分泌系统和消化过程中起着关键作用（Mehandru和Colombel，2021年）。有趣的是，肠道微生物群通过抑制霉菌毒素对关键细胞蛋白和肽的影响，具有很高的降解霉菌毒素毒性的能力（Du等人，2017年）。然而，霉菌毒素导致肠道屏障功能障碍的潜在机制仍不清楚。迄今为止，还没有系统的体内研究探讨霉菌毒素在免疫系统中引起的毒性是否伴随着肠道微生物群的变化。这一机制应在未来的研究中得到阐明。鉴于这些毒代动力学和生物学因素，已经探索了物理、化学和生物方法来减少ZEN的暴露和毒性，尤其是在动物饲料中。在这方面，使用粘土、膨润土和活性炭等吸附剂主要是为了在胃肠道系统中结合霉菌毒素并限制其吸收。同时，霉菌毒素也可以通过氨化和臭氧化等化学过程被分解，尽管可能残留的毒素仍然具有危险性（Laurain和Rodríguez，2019年）。此外，通过生物转化过程来解毒ZEN的生物方法已经显示出令人鼓舞的结果，特别是使用了酵母和乳酸菌（Yang等人，2025年）。然而，这些方法在有效性、经济性或安全性方面可能存在不足。鉴于这些限制，植物提取物如ZLFE在这种情况下是一个理想的天然替代品。事实上，这些提取物中丰富的生物活性物质不仅减少了ZEN的有害影响，还增强了抗氧化防御并改变了免疫反应。因此，ZLFE是一种有前景的方法，可以增强动物健康和饲料安全，因为它结合了解毒能力和保护性生物益处。在这方面，我们的结果进一步说明了基于植物的方法，特别是ZLFE，能够在多大程度上减少ZEN引起的毒性。总体而言，ZLFE通过多种互补途径保护动物免受ZEN引起的毒性。具体来说，这些途径包括通过正常化循环中的细胞因子、T细胞亚群和免疫球蛋白水平来恢复全身免疫功能，以及通过下调IL-6和NF-κB表达来抑制局部肝脏炎症信号传导。此外，ZLFE中含有的生物活性物质，特别是黄酮类化合物和酚酸，可能有助于减少氧化应激，而氧化应激是ZEN引起毒性的主要原因之一。此外，免疫组织和肝脏组织中ZEN水平的显著降低表明ZLFE可能阻碍了毒素的吸收、分布、代谢或排泄。总之，所有这些结果表明ZLFE对ZEN引起的免疫毒性具有多靶点保护作用。

3.8. 植物提取物对抗ZEN毒性的比较概述
随着人们对植物来源物质作为减少ZEN引起的毒性的天然方法的兴趣日益增加，已经鉴定出许多具有肝保护、抗氧化和免疫调节特性的生物活性提取物（表4）。例如，发现Curcuma longa（姜黄素）主要通过激活Nrf2通路和抑制NF-κB信号传导来减少氧化应激和肝脏损伤（Kibitlewska等人，2026年）。同样，Silybum marianum（水飞蓟素）通过降低脂质过氧化和稳定细胞膜具有肝保护作用，而Vitis vinifera（白藜芦醇）和Camellia sinensis（EGCG）通过调节SIRT1和炎症信号通路来减少氧化应激和炎症反应（Benammar等人，2010年；Liang等人，2022年；Fan等人，2025年）。此外，Glycyrrhiza glabra的抗炎特性已被证明可以控制免疫反应并减少肝脏损伤（Bisht等人，2021年）。

表4. 报告可缓解ZEN引起的毒性的主要植物提取物和生物活性化合物
植物/提取物 | 主要生物活性化合物 | 实验模型 | 对ZEN的主要保护作用 | 提出的机制 | 参考文献
---------------------------------------------------------------
Curcuma longa (姜黄素) | 姜黄素 | 小鼠/体外 | ↓氧化应激，↓肝脏损伤，↓炎症 | 激活Nrf2通路，抑制NF-κB信号传导（Kibitlewska等人，2026年）
Silybum marianum (水飞蓟素) | 水飞蓟素，黄酮木脂素 | 大鼠 | 肝保护，↓ALT/AST，↓脂质过氧化 | 抗氧化活性，膜稳定（Benammar等人，2010年）
Vitis vinifera (白藜芦醇) | 白藜芦醇 | 细胞系/小鼠 | ↓细胞凋亡，↓ROS产生，改善肝脏功能 | SIRT1激活，抗氧化防御增强（Liang等人，2022年）
Camellia sinensis (绿茶提取物) | 卡 tea酚类（EGCG） | 体内 | ↓炎症细胞因子，↓DNA损伤 | ROS清除，调节炎症通路（Fan等人，2025年）
Glycyrrhiza glabra (甘草) | 甘草苷 | 大鼠 | ↓肝脏毒性，免疫调节 | 抗炎和免疫调节作用（Bisht等人，2021年）

在这一比较框架下，本研究中研究的ZLFE显示出对ZEN引起的毒性的多靶点保护作用。值得注意的是，与先前发表的植物提取物相比，ZLFE表现出结合的肝保护和免疫调节特性，突显了其作为潜在天然干预措施的重要性。

3.9. Ziziphus lotus果实提取物（ZLFE）中酚类化合物的生物效应
本研究观察到的ZLFE的生物活性可归因于其丰富的酚类和黄酮类化合物组成，这通过LC-MS/MS分析得到了证实。该提取物含有多种生物活性分子，包括木犀草素和阿皮苷衍生物、槲皮素苷、(+)-儿茶素、(-)-表儿茶素和原花青素寡聚物，这些化合物都以其强抗氧化和抗炎特性而闻名（Dhif等人，2025年）。这些化合物已被充分证明具有清除自由基的作用，并能抑制脂质过氧化过程，从而保护细胞免受氧化损伤。特别是，木犀草素和阿皮苷已被证明可以通过抑制NF-κB信号通路来下调促炎介质如TNF-α、IL-1β和IL-6，而槲皮素和原花青素可以增强内源性抗氧化防御系统（SOD、CAT和GPx）并减少毒素引起的细胞损伤（Wang等人，2008年；Wang等人，2011年；Wang等人，2025年）。这些酚类成分之间的协同作用可能解释了用ZLFE处理后ZEN暴露的小鼠中观察到的肝脏细胞凋亡减少、炎症信号减弱（IL-6和NF-κB）以及全身免疫参数的恢复。总体而言，这些发现表明ZLFE的保护作用是通过综合调节氧化应激、炎症通路和免疫稳态来实现的。实际上，ZLFE作为天然功能性饲料补充剂在减少动物生产系统中ZEN引起的毒性方面的潜在应用得到了这些分子和细胞效应的支持。其作为减少霉菌毒素污染影响的补充方法的相关性进一步得到了其天然来源、安全性和与传统喂养技术的兼容性的支持。

4. 结论
本研究的结果强调了ZEN的毒性作用以及ZLFE在包括细胞凋亡、炎症和免疫反应在内的各种生物过程中的潜在保护作用。免疫荧光分析显示，ZEN处理组中p53的表达显著增加，这可能表明凋亡途径的激活和严重的肝脏损伤。然而，ZEN + ZLFE的联合处理显著降低了这种表达，表明ZLFE通过其生物活性化合物（如黄酮类和酚酸）能够缓解ZEN引起的细胞凋亡效应，这些化合物以其抗氧化和抗炎特性而闻名。同样，结果还显示了ZEN的潜在促炎作用，表现为炎症标志物IL-6和NF-κB的显著增加。相反，联合处理显著降低了这些标志物，突显了ZLFE的潜在免疫调节作用。这些发现与研究表明富含多酚的天然化合物可以对抗ZEN引起的氧化应激和炎症反应一致。此外，分析还表明ZEN具有免疫抑制作用，表现为淋巴细胞群体（CD4+、CD8+、CD54+和CD56+）以及免疫球蛋白IgA和IgG的减少。再次，ZLFE通过减弱这些有害效应并部分恢复免疫平衡展示了其潜力。总之，本研究表明ZLFE可以作为天然保护剂，通过调节细胞凋亡、炎症通路和维持免疫反应来对抗ZEN的毒性作用。这些发现为植物提取物作为治疗策略预防霉菌毒素引起的损伤奠定了基础，特别是在肝脏和免疫保护至关重要的情况下。未来的研究应进一步探索这些化合物的潜在分子机制，并评估它们在农业食品和生物医学领域的实际应用。

资金支持
本研究的财务支持来自突尼斯高等教育和科学研究部、Jendouba大学为第一作者提供的交流奖学金，以及西班牙科学、创新和大学部的PID2024-160527OB-I00项目。此外，这项研究工作还得到了编号为RGP2/101/45的机构基金项目的资助。因此，作者感谢沙特阿拉伯King Khalid大学教育与艺术学院的技术和财务支持。

作者贡献
所有作者都参与了研究的概念化和设计。材料准备、数据收集和分析工作由Haifa Dhif和Ahmed Al-Amiery完成。手稿的初稿由Haifa Dhif和Ahmed Al-Amiery撰写，所有作者都对手稿的早期版本提出了意见。Haifa Dhif负责正式分析、调查、可视化和写作-审阅与编辑。Ahmed Al-Amiery负责方法学、正式分析和写作-原始稿件的准备。Massimo Venditti、Mara Calleja-Gómez和Samir Abbès参与了写作-审阅与编辑及监督。Jalila Ben Salah-Abbès参与了写作-审阅与编辑。Ferjeni Zouidi参与了概念化和验证。Houda Berrada参与了概念化和写作-审阅与编辑。所有作者都阅读并批准了最终稿件。

伦理批准
作者确认遵循了期刊作者指南中规定的伦理政策。（i）该项目经过了Monastir高等生物技术学院的伦理审查并获得批准（批准日期：2025年5月1日）。实验动物的照料和使用符合当地的动物福利法律、指南和政策。

参与同意
不适用

出版同意
不适用

利益冲突
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

数据可用性声明
支持本研究结果的数据可向相应作者索取。

伦理声明
动物福利声明：作者确认遵循了期刊作者指南中规定的伦理政策。（i）该项目经过了Monastir高等生物技术学院的伦理审查并获得批准（批准编号：CER-SVS-ISBM-012/24）。（ii）实验动物的照料和使用符合当地的动物福利法律、指南和政策。

同意参与
不适用

同意出版
不适用

利益冲突
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。