通过调节与脂质代谢相关的mRNA和酶的表达，利用发酵大豆产品中的肽类物质缓解高脂血症

《Applied Food Research》：Alleviation of Hyperlipidemia by Peptides from a Fermented Soybean Product via Regulating the Expression of Lipid Metabolism-Related mRNAs and Enzymes

　　小倩胡|尹诺王|光明江|英璐|玉杰舒|硕张|玉婷朱|永祥吴|丽萍吴|建王|亚萍王|伟丽|舒丰毕
中国安徽省黄山245041，黄山大学生命与环境科学学院

摘要
高脂血症是一种以血脂水平升高为特征的代谢紊乱疾病，对全球公共卫生构成了日益严重的挑战。来自食物的肽类物质，尤其是大豆制品中的肽类，具有安全有效地调节脂质代谢的潜力。在本研究中，我们从一种具有地域特色的发酵大豆制品中鉴定出四种抗氧化肽（P1：QCESHK、P2：LAWNEGR、P3：NLQGENEWDQK和P4：FTEMWR），并评估了它们在油酸诱导的HepG2细胞中的降脂活性。通过细胞活力测定、Oil Red O染色以及细胞内甘油三酯和总胆固醇的定量分析，验证了这些肽对脂质积累的影响，结果表明这四种肽均能有效降低细胞内甘油三酯水平并展现出降胆固醇作用。此外，定量实时PCR和Western blot分析进一步证实了它们对参与脂质代谢的关键基因的调控作用。为了进一步探索其实际应用，我们制备了一种含有这些肽的柠檬基功能性饮料，该饮料保持了抗氧化活性并具有良好的感官接受度。这些发现表明，这些肽能够减少脂质积累，显示出作为生物相容性功能性成分在更广泛的食品系统中对高脂血症管理的潜在作用。本研究强调了饮食干预的治疗价值，支持开发基于食物的策略作为更安全的脂质调节方法，并鼓励针对不同地区开展饮食与健康关联的探索。

1. 引言
高脂血症的特点是极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平升高，而高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平降低，是一种主要的脂质代谢紊乱（Ezeh和Ezeudemba，2021）。它与氧化还原失衡密切相关，氧化剂和抗氧化剂之间的平衡被破坏会导致氧化应激，这是动脉粥样硬化性心血管疾病（ACVD）的主要驱动因素（Libby等人，2019）。在高脂血症中，LDL颗粒的氧化（脂质过氧化）会产生氧化型LDL（ox-LDL），其致动脉粥样硬化的能力比天然LDL更强。ox-LDL通过招募巨噬细胞和T淋巴细胞等免疫细胞来诱导血管炎症，从而促进动脉粥样硬化斑块的形成（Alloubani等人，2021；Soehnlein和Libby，2021）。

在中国，过去二十年里血脂异常的患病率急剧上升，如图1a所示。值得注意的是，工作年龄段成人（25-59岁）的患病率相当高（见补充图1a），这突显了有效治疗的迫切需求。目前最常用的药物是奥利司他（Orlistat）和他汀类药物（Statins）。奥利司他抑制脂肪消化所需的胃脂肪酶和胰脂肪酶（Katimbwa等人，2022），而他汀类药物通过抑制HMG-CoA还原酶降低LDL、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平（Morofuji等人，2022）。然而，这两种药物都存在副作用，包括胃肠道不适、肝功能障碍以及2型糖尿病风险增加（Averbukh等人，2022）。

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图1. a. 过去20年中国血脂异常患病率上升趋势 [数据来源于中国2016年成人血脂异常预防和治疗指南以及2020年、2023年和2024年健康时报集团和中国经济信息服务中心的统计报告]。
b. 食物来源肽的降脂作用机制示意图。
c. 生毛豆腐（上）和熟毛豆腐（下），后者经过煎炸后搭配葱末和辣椒酱食用。

与药物干预相比，天然饮食调控脂质水平具有高度的生物相容性，并作为一种更安全的替代方案而受到越来越多的关注。如图1b所示，源自植物蛋白（特别是大豆蛋白）的肽類在调节脂质代谢方面显示出显著潜力。它们具有多种有益作用，包括降低胆固醇和甘油三酯水平、抗肥胖作用、抑制脂肪酸合成酶以及抗糖尿病特性（Nagaoka等人，2021）。吴等人（2022）鉴定出一种大豆来源的五肽iglycin，它通过减轻氧化应激和增强胰岛素敏感性来缓解高脂饮食诱导的小鼠的代谢紊乱。Martinez-Villaluenga等人（2010）报道三种大豆肽（KNPQLR、EITPEKNPQLR和RKQEEDEDEEQQRE）能够抑制脂肪酸合成酶（FAS）。EITPEKNPQLR和RKQEEDEDEEQQRE的FAS硫酯酶抑制活性高于C75（一种合成FAS抑制剂），但低于奥利司他。两种大豆来源的肽（ALEPDHRVESEGGL和SLVNNDDRDSYRLQSGDAL）通过增加ATP结合盒亚家族G成员5（ABCG5）和ABCG8的表达来促进肠道胆固醇的排泄（Lee等人，2022）。此外，大豆来源肽的氨基酸数量和位置会影响其降脂活性。例如，ILL、LLL和VHHV中的Leu和Val氨基酸残基具有释放甘油的作用（Tsou等人，2013）。含有Leu和Tyr的肽ALEPDHRVESEGGL、SLVNNDDRDSYRLQSGDAL和YPFVV也能降低血清和肝脏中的TG水平（Lee等人，2022）。总之，这些大豆来源的肽通过抑制脂质合成，为大豆制品在管理高脂血症方面的应用提供了支持。

值得注意的是，不同地区的血脂异常患病率存在差异。例如，尽管某些省份（如安徽）的油脂和肉类摄入量达到或超过全国平均水平，但其血脂异常患病率仍然处于较低水平（见补充图1b）。这一对比提示需要进一步研究特定地区饮食在脂质代谢中的潜在调节作用。作为位于安徽的研究机构，该省多年来血脂异常患病率一直处于全国最低水平，我们特别关注毛豆腐（Mao Doufu），这是一种通过豆腐发酵制成的传统地方美食（见图1c）。在我们之前的研究中，从毛豆腐中鉴定出四种肽（QCESHK、LAWNEGR、NLQGENEWDQK和FTEMWR），发现它们具有显著的抗氧化活性（Wu等人，2024）。鉴于高脂血症与脂质过氧化之间的密切关联，本研究旨在评估这些肽的抗高脂血症潜力。此外，使用qPCR和Western blot方法阐明了肽介导的脂质调节机制，评估了与脂质代谢相关基因的转录和蛋白质水平变化。这些发现为进一步研究毛豆腐作为一种具有降脂潜力的功能性食品提供了科学依据。

2. 材料与方法
展示四种肽降脂效果及机制的研究工作流程如图2所示，各步骤详细说明如下：

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图2. 四种肽降脂效果及机制的研究流程

2.1. 细胞培养、活力测定及肽处理
HepG2细胞从BeNa培养 kolec tion（北京）获得，并在含有10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，培养条件为95%空气和5%二氧化碳的环境下，温度为37°C。细胞活力使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-四唑溴化物（MTT）试剂进行测定。

本研究中的肽合成遵循Wu等人（2024）描述的工作流程。毛豆腐水解物通过Sephadex G-25尺寸排阻色谱（Sephadex G-25柱，1×15厘米；Bio-Lab 30 FPLC，淮安，中国）分离得到六个主要组分（A1–A6）。其中组分A3表现出最强的抗氧化活性，进一步使用反相高效液相色谱（RP-HPLC，UltiMate 3000系统；Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）和Thermo Acclaim 120 C18柱（5微米，4.6×250毫米；Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行纯化。组分A3的子组分通过八个峰（A3-1至A3-8）分离，其中A3-3、A3-4和A3-5显示出较高的抗氧化活性和中等极性。这些子组分用二硫苏糖醇还原处理后用碘乙酰胺烷基化，随后使用Ziptip SCX吸头（Millipore，美国马萨诸塞州比勒里卡）进行脱盐。肽混合物通过LC-MS/MS串联质谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）结合Vanquish液相色谱系统（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行分析。色谱分离使用Agilent 300 SB-C8 RRHD柱（1.8微米，2.1×100毫米；Agilent Technologies，美国加州圣克拉拉）和甲酸/乙腈梯度完成。使用PEAKS Studio v10.6软件（Bioinformatics Solutions Inc., 滑铁卢，加拿大）进行从头测序，前体/片段容忍度分别为10 ppm和0.05 Da。根据测序结果，排除局部置信度得分（ALC）低于50%的肽以及保留时间与HPLC分离结果差异较大的肽。最终获得的四种肽序列（P1：QCESHK、P2：LAWNEGR、P3：NLQGENEWDQK、P4：FTEMWR）由中国南京GenScript Biotech Corporation化学合成，纯度高于95%。

对于肽处理，HepG2细胞以1×10^4个细胞/孔的密度接种在96孔板中，然后用2.5 μM和10 μM浓度的肽处理24小时。随后去除培养基，每孔加入0.2 mL MTT溶液（2 mg/mL），并在程序化培养箱（Zhicheng ZXSD-R1160，上海）中37°C孵育4小时。去除溶液后，加入200 μL二甲基亚砜（DMSO），使用微孔板读数仪（Detie HBS-1090C，南京）测定570 nm处的吸光度。仅用PBS处理的细胞作为对照组。所有处理重复三次。

2.2. 油酸诱导的HepG2细胞脂肪变性
使用油酸（OA）诱导HepG2细胞的脂肪变性。首先使用上述MTT方法测定OA对HepG2细胞的毒性，设置三种浓度（0.1、0.5和1.0 mM），每个浓度重复三次。HepG2细胞以3×10^5个细胞/毫升的密度接种在6孔板中，在含有10% FBS的DMEM培养基中37°C培养24小时，然后在不含FBS的DMEM培养基中培养24小时以进行饥饿处理。之后将培养基更换为含有1% BSA、0.5 mM OA和肽（2.5或10 μM）的DMEM培养基，继续培养24小时。准备多批处理样本，一批用于Oil red O染色，两批用于测定脂质指标，另外两批用于定量实时PCR和Western blot。

2.3. Oil red O染色
Oil red O染色时，先去除培养基，然后用PBS洗细胞一次，再用4%甲醛固定10分钟，再洗两次PBS。接着用Oil Red O工作溶液染色30分钟，再洗两次PBS。最后用苏木精染色4分钟。两次PBS清洗后，在倒置显微镜（Motic BA200，北京）下拍摄细胞图片。

2.4. 细胞内甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）含量测定
处理后的细胞用胰蛋白酶消化，并在500 g下离心5分钟（Xiangyi L420，湖南）。细胞用异丙醇提取，然后用Solarbio Life Sciences Limited（北京）生产的商业试剂盒（编号BC0625用于TG含量测定，BC1985用于TC含量测定）测定TG和TC含量。

2.5. 定量实时PCR（qPCR）
使用Trizol试剂（Ambion，Thermo Scientific，美国）根据制造商的方案从细胞中提取总RNA。使用HiScript II 1st Strand cDNA合成试剂盒（Vazyme，南京）生成第一链cDNA。定量实时PCR使用QuantGene 9600 Real-Time PCR System（Bioer，杭州）进行。检测脂肪酸合成酶（FAS）、固醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）和LDL受体（LDLR）基因的转录水平。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因作为内参。引物信息见表1。相对转录水平使用2^-△△CT方法计算（Livak和Schmittgen 2001）。每个处理重复三次。

表1. 定量RT-PCR引物

基因 正向引物 反向引物
GADPH GCCTCCTGCACCACCAACTGCCATA
FAS CAAGTGTCCACCAACAAGCGGGAGCGCAGGATAGACTCACACCCCGCCAGCTTAAGGACAACATCTGTTTAGCGTGGGGATGTHMGCR
GCCTATCCAGCCAAGGTTGTGGGACCACTTGCTTCCATTASREBP1 TGGAGGCAGAGAGCAGAGATGTGGCCTAGTCACAGGTTCCLDLRGAATTTGGCCAGACACAGGTCACCGTACCCAGCTGATTTT

2.6. Western Blot分析
使用含8 M尿素（含有1% SDS、40 mM DTT和1 mM PMSF）的研磨液通过GeneReady生物样本快速制备系统（Life Real，杭州）提取总蛋白1分钟。在12,000 g下离心10分钟后（Hitachi CT15RE，日本），使用BCA蛋白质测定试剂（Beyotime，上海）测定蛋白质浓度。然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）分离总蛋白，并将其转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。使用含5%牛奶的TBST缓冲液封闭膜片，并在4°C下与一抗孵育过夜（Kylin-Bell TS-1000，海门，中国），包括针对FAS、磷酸化ACC（pACC）和SREBP1的抗体，而GAPDH用作加载对照。然后用TBST缓冲液清洗膜片（5次，每次15分钟）。在室温下与二抗溶液孵育2小时后（Kylin-Bell TS-1000，海门，中国），再次用TBST缓冲液清洗膜片五次。使用ECL高灵敏度显色液，通过化学发光成像系统捕获信号（BIO-OI，广州，中国）。

2.7. 制备富含毛豆腐衍生物肽的功能性饮料
柠檬手工去皮后，放入沸水中焯水5分钟以灭活内源性酶，从而防止酶促褐变和果胶水解。去除种子后榨汁，所得汁液通过无菌纱布过滤后储存以备后续使用。通过将白砂糖溶解在热水中制备蔗糖溶液，然后通过纱布过滤去除杂质。卡拉胶（0.025克）和赤藓糖醇（0.5克）各溶解在100毫升热水中。将适当体积的这些溶液加入柠檬汁中。使用柠檬酸和碳酸钠将混合液的pH值调整至2.80。然后，将毛豆腐衍生的肽提取物（1.720±0.071毫克/毫升）以不同的体积比例（0%至9%）加入基于柠檬的混合物中，以配制富含生物活性肽的功能性饮料。该饮料在65°C下巴氏杀菌20分钟，这种方法被证明是最佳的抗病毒方法，相比使用400瓦微波处理1分钟（Galanz P70D20N1P，中国）和在105°C下高压蒸汽处理15分钟（华泰YX280，合肥，中国）效果更好。
通过测量其DPPH自由基清除活性（FRSA）来评估所得配方的体外抗氧化活性（Guan等人，2024年）。同时，根据Sánchez-Quezada等人（2024年）提出的方法论，应用表2中概述的感官评价标准来定量评估饮料的质量。共有10名随机选定的评估人员根据定义的标准在100分制上给出评分。

2.8 统计分析
本研究中的所有数据均以平均值±标准误差（SE）的形式呈现。除了涉及10名评估人员对10个样品进行感官评价和抗氧化活性评估外，所有其他实验的报告标准误差都是基于每个条件下的三个独立生物学重复次数组计得出的。多组之间的统计比较使用单因素方差分析（ANOVA）进行，随后进行Duncan多重范围测试进行后续分析。选择Duncan测试是因为其在检测组间差异方面具有更高的敏感性。p值小于0.05被视为具有统计学意义。所有分析均使用SPSS Statistics软件进行。

3. 结果
3.1 肽和油酸对HepG2细胞存活率的影响
在研究肽的降脂效果之前，必须确保肽和油酸（OA）不对HepG2细胞表现出细胞毒性。如图3a所示，2.5和10微摩尔的肽处理并未显著影响细胞存活率。同样，如图3b所示，0.5毫摩尔的OA处理在6小时和24小时时略微增加了细胞存活率，表明这是诱导脂肪肝而不引起细胞毒性的最佳浓度。基于这些发现，后续实验中使用2.5和10微摩尔的肽浓度以及0.5毫摩尔的OA浓度处理24小时，以尽量减少细胞活力受损的潜在干扰。

3.2 肽对HepG2细胞TG和TC含量的影响
为了直接观察OA对脂质积累的影响，图4a和4b中的Oil Red O染色比较显示，在OA处理后HepG2细胞中形成了明显的脂滴，表明成功建立了高脂血症模型。同时，将四种毛豆腐衍生的肽加入OA处理的HepG2细胞后，脂滴积累显著减少，如图4c至4f所示，分别对应于肽P1至P4。图4g中对红色染色的脂滴进行定量分析，结果显示肽处理将细胞内脂质水平降低到OA处理组的大约10-30%，这一效果可与0.1毫克/毫升阿托伐他汀（ATV）的效果相媲美（ATV是一种广泛使用的降脂药物，详见补充图2-4中的ATV使用量迅速增加、ATV处理的OA诱导的高脂血症细胞的Oil Red O染色结果以及ATV处理后的蛋白质表达谱）。

3.3 肽对HepG2细胞mRNA水平的影响
为了进一步研究四种肽调节脂质水平的潜在机制，我们将分析扩展到基因表达水平。具体来说，通过qPCR评估了FAS、HMGCR、ACC和SREBP1的转录水平，结果分别显示在图5c至5f中，对应于肽P1至P4。每次测量都重复三次以确保准确性和可重复性。与对照组相比，OA处理后HMGCR、ACC和LDLR的mRNA水平显著增加。此外，OA处理后FAS和SREBP1的平均转录水平也有所增加。然而，这些差异不具有统计学意义（p>0.05），这可能是由于OA处理组内的标准偏差较大。对于肽处理，所有四种肽的处理都显著降低了ACC的水平。同时，HMGCR的水平也降低，其中10微摩尔P2、2.5微摩尔P4处理的HepG2细胞中的变化具有统计学意义。此外，LDLR水平也显示出类似的降低趋势，而在10微摩尔P3以及2.5微摩尔和10微摩尔P4处理的HepG2细胞中观察到统计显著性。进一步比较OA处理组和肽处理组的转录水平，发现10微摩尔P1和P3处理的细胞中FAS表达呈现下降趋势，但这种变化不具有统计学意义。同样，SREBP1的表达在所有肽处理组中都呈现一致下降趋势，但未达到统计显著性。

3.4 HepG2细胞中SREBP1、FAS和pACC的蛋白质表达
为了进一步研究潜在机制，我们进行了Western blot分析以评估FAS、pACC和SREBP1的表达水平。如图6所示（原始图像见补充图5-8，实验重复三次见补充图9-24以确认观察到的趋势），Western blot分析显示，磷酸化ACC（pACC）似乎是肽处理后主要受影响的蛋白质。在OA处理组中，pACC的水平显著降低。然而，2.5-10微摩尔P1、P2、P3和P4的处理有效地恢复了pACC的表达至基线水平。这些结果与qPCR发现一致，显示所有肽处理组的ACC mRNA转录水平均显著降低。

3.5 肽在食品系统中的应用
为了促进这四种脂质调节肽的功能转化，并扩大区域特定食品在现代饮食系统中的影响，我们探索了将它们加入基于柠檬汁的功能性饮料中。图7a展示了一种配方饮料的代表性样本。作为确保人体兼容性的抗病毒处理方法，巴氏杀菌被确定为最合适的方法（图7b），其效果优于微波和高压处理，能更好地保持肽的活性并获得最高的感官评价分数。

4. 讨论
4.1 四种肽的脂质下调机制
血脂异常可导致TG和TC水平升高，最终可能引发非酒精性脂肪肝病（NAFLD）。NAFLD的临床诊断标准是肝细胞中脂肪含量超过5%（Li等人，2024年）。NAFLD发病机制的普遍理论基于“双击”假说（Basaranoglu等人，2013年）。“第一次打击”是由于甘油和游离脂肪酸（FFA）的酯化导致肝脏中TG过度积累（Fabbrini等人，2010年）。一旦进入肝细胞，FFA会通过酰基-CoA合成酶活性形成脂肪酰基-CoA，这些酰基-CoA进入酯化或β-氧化途径（Watkins和Ellis 2012年）。因此，NAFLD的“第二次打击”特征是氧化应激的发展和氧化还原平衡的变化（Zhong等人，2020年）。研究表明，HepG2细胞在暴露于OA时会积累脂质，并发生形态和生化变化（Thounaojam等人，2012年）。这种现象与人类脂肪肝的发展相似（Pouwels等人，2022年），这使得HepG2细胞中由OA引起的脂肪变性成为研究和量化NAFLD的理想模型。四种肽的降脂作用似乎是多因素的，涉及转录调控、翻译后修饰和肽序列特征。首先，这些肽之前已被证明具有很强的抗氧化活性（Wu等人，2024年）。疏水性氨基酸如Ala（A）、Trp（W）、Leu（L）和Phe（F）可以增强肽的溶解度，从而促进与脂溶性自由基的相互作用，进而抑制脂质氧化（Qing等人，2022年；Agrawal等人，2016年）。鉴于氧化应激和高脂血症之间的-established联系（Masenga等人，2023年），P1–P4的这些抗氧化特性使它们成为膳食干预高脂血症的更强候选者。同样，我们含肽饮料中保留的抗氧化活性表明该配方具有良好的降脂潜力，需要进一步研究。

此外，肽的降脂效果很大程度上受其特定氨基酸序列的影响。亲水性氨基酸如Arg（R）、Glu（E）、Lys（K）和Asp（D）已被报道可以增强肽的降脂效果（Lammi等人，2019年）。特别是，肽的N端存在Leu（L）、Ile（I）和/或Tyr（Y）与HMG-CoA还原酶（HMGCR）抑制活性的提高有关（Wei等人，2024年）。在本研究中，所有四种肽P1（QCESHK）、P2（LAWNEGR）、P3（NLQGENEWDQK）和P4（FTEMWR）中都发现了亲水性残基，而Leu位于P2的N端。亲水性和疏水性氨基酸残基的存在，加上已证明的抗氧化活性，可能共同促进了这四种肽的降脂潜力。这一效应通过多种评估得到了验证，包括使用Oil Red O对脂滴的染色、测量TG和TC水平。

为了阐明肽的调节机制，我们检查了参与脂质代谢的关键基因的转录反应。Hong等人（2020年）表明，SREBPs下游调控的基因主要包括与胆固醇合成相关的酶，如FAS、HMGCR、ACC和LDLR。FAS利用acetyl-CoA和malonyl-CoA形成棕榈酸，而ACC通过将acetyl-CoA转化为malonyl-CoA在脂质代谢中起关键作用，后者是脂肪酸生物合成的关键中间体。因此，所有四种肽对ACC的下调是降低脂质作用的一个关键机制。值得注意的是，由于ACC的磷酸化会抑制脂肪酸合成（Li等人，2008年），Western Blot分析中观察到的pACC上调表明，肽可能通过激活ACC信号通路来发挥降脂作用，从而抑制脂肪酸合成。除了ACC之外，这些肽还通过下调HMGCR的表达来抑制内源性胆固醇合成并增加胆固醇的排泄，HMGCR是由反馈调控控制的胆固醇代谢的限速酶（He等人，2018年）。同时，LDLR作为LDL的受体，参与将胆固醇从血浆运输到细胞质（Feng等人，2022年），它也是一种膜结合糖蛋白，在结合和内化含有胆固醇的脂蛋白颗粒方面起重要作用（Ndoj等人，2025年）。本研究中观察到的LDLR水平下调及随之而来的脂质积累减少与Marques等人（2018年）的报告结果一致，进一步证明了肽在降脂作用中的贡献。

4.2 统计策略
对于上述统计分析，我们选择了Duncan的多范围检验，主要有两个原因。首先，Duncan检验是一种成对比较方法，在样本量相对较小的研究中能够更敏感地检测组间差异。其次，基于对肽降脂效果的定性评估，所有四种肽都展示了强大且一致的效果，因此犯第二类错误的风险被认为较高。Duncan检验更为宽松，能更好地防止这种类型的错误。同时，为了降低与此方法相关的第一类错误风险，我们避免了传统的基于字母的显著性注释，而是提供了精确p值的伪彩色可视化。这种方法避免了“显著”与“不显著”结果的 rigid 分类解释，同时仍然提供p值作为信息参考，使得对数据的理解更加细致，特别是对于接近0.05阈值的值。

4.3 意义和展望
值得注意的是，这些肽最初是从毛豆腐中提取的，毛豆腐是一种在中国某些地区传统上食用的发酵大豆制品。毛豆腐独特的发酵过程涉及天然存在的霉菌，不仅丰富了其风味，还促进了具有潜在健康益处的生物活性肽的生成。这种传统食品反映了当地的饮食习惯和微生物生态系统，可能有助于形成独特生物活性肽的特征。因此，本研究中观察到的降脂效果部分归因于毛豆腐特有的发酵环境和微生物组成。这些发现强调了探索特定地区或特定生产方法的食物（如通过发酵生产的食物）作为预防和管理代谢性疾病（包括高脂血症）的功能肽的重要资源。除了NAFLD之外，失调的脂质水平也是心血管疾病（包括动脉粥样硬化和冠心病）的主要风险因素，因此强调了日常生活中膳食干预的重要性。展望未来，需要使用体内模型和人体临床试验来进一步研究我们的发现，以提高这些发现的转化潜力，不仅用于开发富含肽的功能性食品，还用于直接临床应用，最终实现其治疗潜力。

5. 结论
总之，这项研究表明，从一种具有地区特色的发酵大豆制品毛豆腐中提取的四种抗氧化肽在橄榄油诱导的HepG2细胞中表现出显著的降脂活性。这些肽有效地降低了细胞内甘油三酯和总胆固醇水平，抑制了脂滴的积累，并调节了关键脂质代谢相关目标（包括ACC、HMGCR和LDLR）的转录和表达。此外，这些发现突显了传统发酵过程的健康促进潜力，它们不仅增强了风味，还促进了具有可测量生理益处的生物活性肽的形成。为了将这些肽进一步应用于实际饮食中，我们开发了一种含有毛豆腐肽的功能性柠檬饮料。该饮料保持了抗氧化活性，并获得了较高的感官接受度，其中6%的肽添加量被认为是最佳配方。总的来说，我们的发现为使用毛豆腐和其他地区特色发酵食品作为预防和管理高脂血症的新方法提供了机制和应用方面的支持。

作者贡献
概念构思：X.H.、Y-N. W.；
数据管理：X.H.、Y-N. W.、Y.L.、Y.S.、S.Z.、Y.Z.；
正式分析：X.H.、Y-N. W.；
资金获取：X.H.；
研究：X.H.、Y-N. W.、Y.L.、Y.S.、S.Z.、Y.Z.；
方法学：X.H.、Y-N. W.、G.J.、Y-X. W.、L.W.；
项目管理：X.H.、Y-X. W.、L.W.、J.W.、Y-P. W.、W.L.、S.B.；
资源：G.J.、X.H.；
软件：Y-N.W.；
监督与验证：Y-N.W.；
撰写——初稿：所有作者；
撰写——审阅和编辑：所有作者。

（Y-N. W.：Yinuo Wang；Y-X. W.：Yongxiang Wu；Y-P. W.：Yaping Wang）

伦理声明 - 人类和动物研究
感官评估由10名未经培训的品尝员进行。根据2023年国家卫生健康委员会、教育部、科技部和国家中医药管理局发布的《涉及人类受试者的生命科学和医学研究伦理审查措施》第3章第32条，该级别的感官研究免除了正式伦理批准。在参与之前，所有参与者都获得了口头和书面知情同意。所有参与者的权利、隐私和保密性得到了严格保护，所有参与者都充分了解了研究目的、程序和潜在风险。未经同意，任何个人数据均不会被披露，参与是自愿的，并且可以随时自由退出，没有任何处罚。本研究未涉及未成年人。

未引用的参考文献
Park等人，2018

CRediT作者贡献声明
Xiaoqian Hu：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、监督、项目管理、方法学、研究、资金获取、概念构思；
Yinuo Wang：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、软件、方法学、正式分析、概念构思；
Guangming Jiang：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、验证、资源、概念构思；
Ying Lu：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、研究；
Yujie Shu：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、研究；
Shuo Zhang：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、研究；
Yuting Zhu：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、研究；
Yongxiang Wu：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、项目管理、方法学；
Liping Wu：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、项目管理、方法学；
Jian Wang：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、项目管理、方法学；
Yaping Wang：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、项目管理、方法学；
Wei Li：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、项目管理、方法学、概念构思；
Shufeng Bi：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、项目管理、方法学。