超临界混合二氧化碳-氢气作为从葡萄籽中可持续提取酚类化合物和抗氧化剂的新方法

《Applied Food Research》：Supercritical Hybrid Carbon Dioxide-Hydrogen as a New Sustainable Extraction of Phenolics and Antioxidants from Grape Seeds

　　**摘要：**
本研究首次评估了超临界混合二氧化碳-氢气（Sp-CO?-H?）萃取技术作为从葡萄籽中回收植物化学物质的混合溶剂系统的效果，采用了响应面法（RSM）、数学建模和优化技术。在该系统中，使用了一种耐压的圆柱形容器作为超临界萃取反应器，以维持稳定的相条件。通过RSM、数学建模和优化（MMO）技术对压力（P）、温度（T）和时间（t）这三个独立变量进行了优化，以提高酚类物质（Total Phenolic Content, TPC）和抗氧化剂的萃取效率。实验中使用的二氧化碳/氢气混合物比例为96/4%（体积比，相当于24:1摩尔比），水作为极性改性剂。优化条件确定为压力60–80巴、萃取时间5–9分钟、温度30–60°C，最佳条件为压力60巴、时间5分钟、温度60°C。在此条件下，总酚类含量为124.02毫克没食子酸当量/100毫升；通过高效液相色谱（HPLC）测定的单个酚类化合物分别为儿茶素（292.38毫克/升）、表儿茶素（163.16毫克/升）和绿原酸（最低浓度）。结果表明，儿茶素是最丰富的单一酚类化合物，而绿原酸的含量最低。抗氧化活性分别达到2,2-二苯基-1-联苯基肼（DPPH）的76.66%和2,2′-偶氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）的86.74%；HPLC测得的总酚类含量为613.09毫克/升。在最佳条件下，Sp-CO?-H?方法比传统的Sp-CO?方法更有效地从Cimin葡萄籽中萃取酚类化合物和抗氧化剂，使TPC、DPPH和ABTS值分别提高了35%、2%和17%，儿茶素和表儿茶素的含量分别增加了79%和45%。研究表明，Sp-CO?-H?萃取技术是一种有价值的可持续工艺，可用于从农业食品废弃物（如葡萄废弃物）中回收生物活性化合物。

**1. 引言**
葡萄籽是葡萄汁和葡萄酒产业的副产品，富含酚类化合物、维生素E、原花青素和黄酮类物质（Guerra-Rivas et al., 2016; Gupta et al., 2020）。农业食品废弃物通常含有丰富的生物活性化合物，如抗氧化剂和酚类物质，因此选择合适的萃取方法对于高效回收这些化合物至关重要（Capanoglu et al., 2022; Verep et al., 2023）。萃取方法可分为传统方法（Karaogul et al., 2016）和新兴方法。常见的传统萃取方法包括溶剂萃取（水、甲醇、乙醇、己烷等）和水蒸气蒸馏（Karaogul & Alma, 2019; Soquetta et al., 2018; Torres-Valenzuela et al., 2020）。新兴技术包括超临界萃取、超声辅助萃取、加压萃取、脉冲电场萃取和酶辅助萃取（Zia et al., 2022）。为了有效回收生物活性化合物，还需要优化时间、温度、pH值、搅拌速度、压力以及溶剂与样品的比例等参数（Torres-Valenzuela et al., 2020）。新兴萃取方法被认为具有环保、高效、耗能低和毒性低的优点（Soquetta et al., 2018; Alwazeer et al., 2023）。特别是超临界二氧化碳萃取（SCE）近年来发展迅速（Alwazeer, Elnasanelkasim, Engin, et al., 2023）。值得注意的是，超临界二氧化碳是一种非极性溶剂，提取极性化合物时需要添加辅助极性溶剂（如水或乙醇）作为改性剂（Park et al., 2007; Tello et al., 2011）。最近有研究报道氢气（H?）可用于从各种农业食品废弃物、副产品和药用植物中萃取植物化学物质，例如植物叶片（Alwazeer, Elnasanelkasim, Engin, et al., 2023; Alwazeer & Engin, 2022; Ryu et al., 2019）、果皮（Alwazeer, Elnasanelkasim, ?i?dem, et al., 2023; Alwazeer & Elnasanelkasim, 2023; Ceylan et al., 2023）、茶叶废弃物（Elnasankasim et al., 2025）、蜂胶（Yurt, 2023）、薄荷（?i?dem et al., 2026）以及葡萄废弃物（Engin et al., 2025b）。然而，氢气对植物化学物质萃取的具体作用机制尚不清楚（Alwazeer, 2024; Alwazeer et al., 2023）。在之前的研究中，我们团队探讨了在超临界萃取过程中加入富氢水（HRW）作为改性剂对植物化学物质回收效果的影响（Alwazeer, Elnasanelkasim, ?i?ek, et al., 2023）。研究使用了100%的二氧化碳，并以HRW作为改性剂。许多新兴萃取方法已被提出用于从葡萄籽中回收酚类化合物（Samavardhana et al., 2015）。Chen et al.（2020）和Chimshirova et al.（2021）发现微波辅助萃取（MAE）获得的葡萄籽提取物具有更高的抗氧化能力。Li et al.（2011）使用微波辅助萃取有效提取了葡萄籽中的多酚类物质。Boussetta et al.（2013）采用脉冲电场方法萃取葡萄籽中的酚类物质。Barriga-Sánchez et al.（2022）发现，在120°C和100巴的压力下，加压乙醇萃取的酚类含量和抗氧化能力高于超临界水萃取。Da Porto和Natolino（2017）指出，超临界二氧化碳萃取的最佳条件为压力80巴、二氧化碳流速6千克/小时以及20%（重量比）的乙醇-水共溶剂。Nechita et al.（2015）证实超临界流体萃取（SFE）可用于从葡萄籽中提取多酚类物质。尽管如此，优化萃取参数仍然是提高葡萄籽提取物质量和产量的关键（De Souza et al., 2020）。基于这些研究，我们假设还原性氢气（H?）与选择性且可持续的二氧化碳（CO?）的结合可以形成一种具有还原性的混合溶剂，从而增强超临界二氧化碳萃取（SCE）方法的效率（Alwazeer et al., 2026）。本研究旨在首次利用含有氢气的二氧化碳（CO?/H?，体积比96/4%，相当于24:1摩尔比）作为选择性且可持续的溶剂，从农业食品废弃物（如葡萄籽）中提取极性植物化学物质，并期望两种气体的联合使用能产生协同效应（Alwazeer et al., 2026）。在超临界CO?-水体系中可能还会发生水解、热降解和酸催化转化等反应（Herrero et al., 2010; Pourmortazavi & Hajimirsadeghi, 2007）。H?和CO?的结合可以创造一个还原性萃取环境，从而限制酚类物质的氧化降解（Alwazeer, Elnasanelkasim, ?i?ek, et al., 2023; Alwazeer, 2024）。H?和CO?的结合有助于在萃取过程中保护敏感化合物免受氧化。通过响应面法（RSM）和数学建模及优化（MMO）确定最佳萃取参数。RSM分析中，压力（P）、时间和温度被视为独立变量，评估指标包括总酚类含量（TPC）、抗氧化活性以及DPPH和ABTS的还原能力，同时通过HPLC测定TPC、没食子酸、表儿茶素、绿原酸和儿茶素的含量。通过建模确定了最大化这些指标的最佳萃取条件：压力60巴、时间5分钟、温度60°C。

**2. 材料与方法**
**2.1 材料**
黑Cimin葡萄（Vitis vinifera L.）购自土耳其埃尔津詹的当地蔬果店。清洗后去籽并冷冻干燥（Martin Christ Alpha 1-2 LD，德国），之后在高速（24,000转/分钟，粒径0.3–0.5毫米）的草药和香料研磨机（Demsan Terazi，伊斯坦布尔，土耳其）中研磨成粉，储存于-80°C待分析。

**2.2 化学试剂**
所有试剂均购自Sigma（美国圣路易斯）和Merck（德国达姆施塔特），包括ABTS（2,2′-偶氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）、DPPH（2,2-二苯基-1-联苯基肼）、抗坏血酸、没食子酸、槲皮素、绿原酸、 Trolox、3,4,5-三羟基苯甲酸、Folin-Ciocalteu试剂、苯腈、乙醇、硫酸、磷酸、盐酸、碳酸钠、过硫酸钾和乙酸钠。

**2.3 方法**
**2.3.1 超临界二氧化碳-氢气混合萃取（Sp-CO?-H?）**
按照Alwazeer等人（2023）的方法对葡萄籽粉进行超临界CO?萃取。为优化P-t-T参数（压力60–80巴、时间5–9分钟、温度30–60°C），进行了实验（?i?dem et al., 2026）。每次萃取实验中，将0.5克葡萄籽粉与10毫升纯水（Direct-Q?8 UV系统，Millipore，美国）混合作为改性剂。来自高压气瓶（气体纯度99.99%，安卡拉Gaz公司，安卡拉，土耳其）的预混CO?/H?气体混合物（体积比96/4%，相当于24:1摩尔比）被引入超临界流体萃取系统（F-500，Qualitec Super Critical CO?，土耳其）。这种混合溶剂系统基于氢气的安全参数设计。氢气在空气中的浓度为4–75%时具有可燃性，爆炸限为18.3–59%；当氧浓度低于爆炸限或不存在氧气时，即使在压力下也不会发生爆炸。在4%的低浓度下，氢气可在实验室和工业环境中安全使用，尤其是与氮气稀释后（?i?dem et al., 2026）。气体流量和压力由系统泵根据制造商的操作条件自动调节。图S1展示了SFE萃取器的详细结构。

**2.3.2 总酚类含量（TPC）的测定**
葡萄籽提取物的总酚类含量采用Engin等人（2025a）描述的Folin-Ciocalteu方法测定。将1毫升提取物溶液与2.3毫升超纯水和1毫升Folin-Ciocalteu试剂混合，并进行30秒的涡旋搅拌，随后在暗处25°C下孵育5分钟，再加入2毫升7%（重量比）的Na?CO?，继续在暗处孵育30分钟，最后使用分光光度计（Aquamate UV-Vis，中国）在765纳米处测定吸光度。以没食子酸为标准，计算每100毫升提取物的总酚类含量（GAE）。

**2.3.3 DPPH自由基清除活性测定**
葡萄籽提取物的DPPH自由基清除活性按照Engin等人（2025a）的方法测定。将0.5毫升提取物溶液加入2.5毫升DPPH溶液（浓度6×10^-5摩尔/升）中，在室温下孵育90分钟，然后测量515纳米处的吸光度，计算抗氧化能力（以Trolox当量表示）。

**2.3.4 ABTS自由基清除活性测定**
葡萄籽提取物的ABTS自由基清除活性按照Engin等人（2025a）的方法测定。制备含有2.45毫摩尔/升过硫酸钾（K?S?O?）的ABTS溶液，置于室温下避光孵育12–16小时，然后用0.1 N HCl调节pH值为4.5，再将ABTS溶液稀释至20毫摩尔/升，使吸光度达到0.700 ± 0.01。将100微升提取物溶液与1900微升ABTS溶液混合孵育5分钟后，测量734纳米处的吸光度，以Trolox当量表示抗氧化活性。

**2.3.5 HPLC分析**
葡萄籽提取物的酚类成分通过HPLC仪器和UV/DAD检测器（Agilent 1260 Infinity）进行测定，方法参照Engin等人（2025a）。将20微升提取物样品注入C18 ACE Generix柱（250×4.6毫米，粒径5微米），温度设定为25°C，使用两种流动相（溶剂A和B）：溶剂A（0.1%磷酸水溶液）和溶剂B（苯腈）。在移动相中，使用了83%的A和17%的B，流速为0.8 mL/min，注射体积为20 μL。总运行时间为40分钟。梯度程序从83%的A开始，在30分钟时转变为60%的A，在35分钟时返回到83%的A。使用DAD在350 nm和200 nm波长处检测到了酚类化合物（表S1.2.3.6）。应用了响应面方法（RSM）来优化超临界二氧化碳-氢气（Sp-CO2-H2）提取葡萄种子的工艺参数。该过程使用了Design-Expert 7.0软件（Stat-EASE Inc., Minneapolis, MN）进行。自变量包括压力（P: 60-80 bar）、时间（t: 5-9 min）和温度（T: 30-60°C）。因变量包括总酚含量（TPC）、使用DPPH和ABTS的自由基清除活性（RSA）以及基于Trolox标准的自由基清除浓度（SFRC）（Engin et al., 2025b）。确实，研究表明，在传统的浸出方法中加入氢气（H2）到各种溶剂（水、甲醇、乙醇和己烷）中，可以将从农产品废弃物中提取抗氧化剂和酚类化合物的效率提高约22-50%，相比传统方法（Alwazeer, Elnasanelkasim, ?i?ek等人，2023年）、粗橄榄果渣油（Ceylan等人，2023年）、柠檬皮（Alwazeer, Elnasanelkasim, ?i?dem等人，2023年）、药用花卉（Engin，2025a）和蜂胶（Yurt，2023年）都有显著效果。此外，Engin等人（2026年）最近发表了一项研究，应用亚临界/超临界二氧化碳萃取技术从Cimin葡萄籽中回收植物化学成分（本研究使用的是同一品种）。在那项研究中，没有使用氢气的条件下，最佳萃取条件为80巴压力、60°C温度和5分钟时间。在这些条件下，提取物的总酚含量（TPC）为91.86毫克GAE/100毫升提取物，抗氧化活性（DPPH）为13,100.3微摩尔TE/100毫升提取物，抗氧化活性（ABTS）为2,004.93微摩尔TE/100毫升提取物。而在本研究中，当二氧化碳与氢气结合使用（Sp-CO2-H2）（24:1摩尔比）时，在最佳萃取条件（60巴压力、5分钟时间和60°C温度）下，所有萃取指标都有所提高。例如，TPC为124.02毫克GAE/100毫升提取物，DPPH为13,320.4微摩尔TE/100毫升提取物，ABTS为2,408.56微摩尔TE/100毫升提取物。表2展示了Sp-CO2-H2模型的系数和方差分析（MCA）结果。通过方差分析（ANOVA）确定了自变量——压力、时间和温度的统计显著性，P值表示它们对因变量的影响程度，显著性水平从P<0.05到P<0.01不等。对于TPC、RSA-DPPH、RSA-ABTS、SFRC-DPPH和SFRC-ABTS而言，温度的影响最为显著（P<0.01）。时间对没食子酸（P<0.01）和绿原酸（P<0.05）也有显著影响。而压力仅在TPC-by-HPLC中显著（P<0.05）。此外，还探讨了交互作用和第二阶独立参数的重要性。

尽管文献中尚无关于超临界氢气掺入二氧化碳（Sp-CO2-H2）萃取过程的研究，但某些还原剂（如H2、SO2）已在多种萃取研究中得到应用。例如，Nogueira等人（2023年）使用20毫克/升的SO2从红葡萄酒葡萄中回收花青素；Cacace和Mazza（2003年）使用传统的水-乙醇萃取方法从黑醋栗葡萄中回收酚类化合物。类似地，Engin等人（2025a）报告称，富含氢气的溶剂方法提高了从报春花（Primula veris L.）中提取某些酚类化合物（如儿茶素、表儿茶素和槲皮素）的效果。这可能是由于氢气（H2）与二氧化碳（CO2）的选择性及可持续结合增强了植物化学成分的萃取效率。这些发现表明，在混合CO2-H2超临界萃取系统中，氢气对于提取生物活性化合物（如酚类）具有重要的作用。

图2展示了Sp-CO2-H2的模型系数和方差分析（MCA）结果。压力、时间和温度这些自变量的统计显著性通过方差分析（ANOVA）确定，P值反映了它们对因变量的影响程度。关于显著的独立性，温度对TPC、RSA-DPPH、RSA-ABTS、SFRC-DPPH和SFRC-ABTS的影响最为显著（P<0.01）。时间对没食子酸（P<0.01）和绿原酸（P<0.05）有影响。压力仅在TPC-by-HPLC中显著（P<0.05）。此外，还研究了不同因素间的交互作用和第二阶独立参数的重要性。

在文献中，尚未有关于超临界氢气掺入二氧化碳（Sp-CO2-H2）萃取过程的研究。然而，一些还原剂（如H2、SO2）已在多种萃取研究中得到应用。例如，Nogueira等人（2023年）使用20毫克/升的SO2从红葡萄酒葡萄中回收花青素；Cacace和Mazza（2003年）使用传统的水-乙醇萃取方法从黑醋栗葡萄中回收酚类化合物。类似地，Engin等人（2025a）报告称，富含氢气的溶剂方法提高了从报春花（Primula veris L.）中提取某些酚类化合物（如儿茶素、表儿茶素、槲皮素和槲皮素）的效果。这可能是由于氢气保护酚类化合物免受氧化反应的影响，并改变植物材料的表面性质和形态，以及其他可能的机制（Alwazeer，2024年）。从不同样品中回收酚类化合物的效率受溶剂极性和各组分在这些溶剂中的溶解度显著影响。通常情况下，溶剂极性越高，多酚产量越大，提取物的抗氧化活性也越高（Engin等人，2025年）。对于从植物中提取黄酮类化合物，会选择合适的溶剂。在这方面，溶剂的极性非常重要。因为极性较低的黄酮类化合物可以使用氯仿、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯等溶剂提取，而极性较高的苷元则 menggunakan酒精或酒精-水混合物提取（Anderson & Markham，2005年）。研究表明，溶剂极性和类型会影响氢原子和电子传递，这对抗氧化能力的测量很重要（Finotti等人，2003年）。在Sp-CO2-H2样品中观察到的较高酚类化合物提取量可能与氢气对提取过程中易氧化的抗氧化剂的保护作用有关（Alwazeer等人，2023年）。

本研究发现，所有自变量在超临界流体萃取（SFE）过程中显著影响了各种生物活性化合物的提取效果。从显著性水平来看，压力、时间和温度这三个自变量分别影响了1个、2个和5个因变量。这些研究表明，模型和参数对于生物活性化合物的富集和提取至关重要。

在PCA分析（图1a）中，观察到了不同的聚类模式，形成了五个主要区域。所有生物活性成分都集中在一个中心簇中。萃取条件定义为压力（P，巴）、时间（t，分钟）和温度（T，°C）。在这个簇中，预测的最佳萃取方法（Pred_60-5-60）以及60-9-60和80-5-60条件显示出密切相关性。尽管生物活性成分进一步分为两个子区域，但预测方法并未与任何一个子区域完全吻合，这可能反映了为了平衡多种生物活性成分的亲和力而优化的中间位置。这一点在PCA图中清晰可见。具体而言，TPC和抗氧化活性（RSA-DPPH和RSA-ABTS）与60-7-60条件聚类在一起。同时，GA、Ctc、TPC-by-HPLC和Ep-Ctc与60-9-60、80-5-60、60-5-30和60-7-45条件相关联。特别是Ep-Ctc更接近80-5-60条件，而GA更接近60-7-45条件。这些发现表明，当目标是选择性富集特定生物活性化合物时，在PCA空间中位于同一多变量域内的萃取参数可以提高纯度和针对性分离。此外，图2中的聚类模式提供了一个预测框架，允许调整（调节）压力、时间和温度，以基于它们在多变量模型中的空间关联来选择性地提取特定酚类化合物。结果表明，适当优化的超临界CO?萃取不仅可以作为全局萃取过程，还可以作为针对性生物活性化合物的选择性预分离技术。相反，位于PCA左下象限的萃取条件（第四和第五簇）与任何生物活性成分无关。这一观察揭示了一个关键点：如果超临界萃取中的实验参数未达到阈值条件，萃取过程将无效。然而，当这些阈值被满足时，每个目标生物活性化合物的具体临界参数就会显现出来，突显了超临界萃取系统中精确优化的必要性。

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图1. 葡萄籽提取物中酚类含量和抗氧化特性的层次热图、聚类和皮尔逊相关性分析，(a) 自变量 P-t-T（压力、时间和温度），(b,c) 相关的自变量，(d) 自变量-因变量的标准化热图相关性，(e) 因变量-因变量的热图相关性，(f) 自变量-自变量的热图相关性。
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图2. SFC-Cimin葡萄籽提取物的目标性和因变量响应面图以及相关自变量，(a) 压力-时间的目标性，(b) 温度-时间的目标性，(c) 压力-温度的目标性，(d) TPC-时间-压力，(e) TPC-温度-压力，(f) TPC-温度-时间，(g) RSA%-DPPH-时间-温度 (h) RSA%-DPPH-温度-压力，(?) RSA%-DPPH-压力-时间，(i) RSA%-ABTS-压力-时间，(j) RSA%-ABTS-温度-压力，(k) RSA%-ABTS-温度-时间。
层次聚类分析进一步 confirm 了这些发现（图1b和图1c）。自变量按照它们的PCA距离分组，值得注意的是，预测条件（Pred_60-5-60）与60-9-60条件最为接近，再次证明了其作为最佳条件的作用。在因变量中，TPC-by-HPLC是最综合的标志物，与Ctc、Ep-Ctc、GA和抗氧化活性（RSA-DPPH和RSA-ABTS）紧密相关，与TPC本身的相关性较低。
热图分析（图1d）进一步验证了这些发现。最佳预测方法（Pred_60-5-60）与几乎所有生物活性成分都表现出强烈的正相关性，只是与Ep-Ctc略有偏差。这种广泛的关联反映了通过RSM建模进行的数学优化的高精度和可靠性。这些热图模式与PCA聚类结果一致，加强了潜在关系的证据。
在皮尔逊相关性热图（图1e）中，观察到了TPC和抗氧化参数（RSA-DPPH和RSA-ABTS）之间的最强相关性，表明TPC是抗氧化能力的可靠预测指标。此外，Ctc和Ep-Ctc与TPC-by-HPLC也表现出最强的相关性，表明它们在提取行为上有结构或组成上的相似性。
最后，独立变量之间的Kendall相关性热图（图1f）显示了参数之间的强相互关系。最佳预测条件（Pred_60-5-60）与60-5-30和60-7-45条件都表现出强相关性。除了预测最佳条件之外的其他相关性，层次聚类和相关性矩阵分析（皮尔逊和Kendall）也揭示了实验参数集之间的额外相似性分组。这些一致的多变量分析表明，压力、温度和时间通过控制CO?-H2密度、溶剂扩散性和溶质溶解度等相互关联的机制影响萃取效果。提高温度可以增强溶质的蒸气压和质量传输，而压力主要影响溶剂密度和溶解度。萃取时间调节扩散程度和基质耗尽情况。这些参数的平衡不仅决定了总提取效率，还决定了特定酚类化合物的选择性。根据这些发现，使用中等压力、较高温度和较短萃取时间可以最佳地选择性富集儿茶素类化合物。相反，较高压力和较长萃取时间可能有利于其他酚类成分的回收。因此，微调超临界参数可以实现靶向萃取，而不仅仅是最大化总体产量。

在本研究中，首次使用含有氢气的二氧化碳（Sp-CO2-H2）作为环保的还原性CO?溶剂，从葡萄籽中回收酚类化合物（如没食子酸、表儿茶素、绿原酸、槲皮素）和抗氧化剂。结果表明，使用Sp-CO2-H2萃取方法可以有效回收葡萄籽中的总酚含量（TPC）、抗氧化能力和某些酚类化合物。最佳参数为60巴压力、5分钟时间和60°C温度。这种新方法通过将超临界氢气掺入二氧化碳中，可以增强从各种农业、食品和动物材料中提取植物化学成分及其他氧化敏感生物活性化合物的效果。研究表明，在适当优化条件下，该方法不仅提高了效率，还可以在达到关键阈值时实现对目标生物活性化合物的预分离。此外，从葡萄副产品中获得的提取物可用于开发功能性食品或生物活性增强产品，从而支持废物利用并促进可持续性。