蛋白质-皂苷之间的界面相互作用调控了负载platycodon grandiflorum皂苷的大豆蛋白纳米乳液的稳定性及其抗氧化保护作用

《Applied Food Research》：Protein–saponin interfacial interactions direct the stability and oxidative protection of Platycodon grandiflorum saponin-loaded soy protein nanoemulsions

　　王伟张 | 陈辉 | 杨静玲 | 张秀秀 | 倪志静 | 上雅芳 | 魏兆军 | 塔库尔·基兰
宁夏回族自治区北方民族大学生物科学与工程学院，特种食品营养与健康创新团队，银川750021，中国

**摘要**
本研究旨在开发一种由大豆分离蛋白（SPI）稳定的绿色纳米乳液系统，用于包封桔梗皂苷（PGS），显著提高其稳定性和生物利用度。PGS-SPI复合纳米乳液表现出了良好的理化性质、强界面相互作用以及增强的环境稳定性。在PGS负荷为60 mg/mL时，液滴的大小均匀为295.3 nm，绝对Zeta电位为58.17 mV，包封效率（EE）为83.64%，表明其具有强大的静电稳定性和高效的包封效果。该配方在中性至中性偏碱的pH范围内、NaCl浓度高达0.2 M以及温度高达70 °C的情况下仍能保持稳定。在37 °C下长期储存28天后，仍能维持64.89%的包封率并延缓脂质氧化，显示出优异的保质性能。光谱和热力学分析表明，PGS与SPI之间的氢键和疏水相互作用形成了强界面层，有效减少了液滴聚合并抑制了氧化降解。这些结果表明，由SPI稳定的纳米乳液是一种有前景的PGS递送平台，为功能性食品和营养保健品的应用提供了新的设计策略。

**1. 引言**
桔梗是一种传统药用植物，其生物活性主要归因于其富含皂苷的部分（PGS）。PGS由天然存在的三萜皂苷组成，具有抗炎、免疫调节、抗氧化和抗肿瘤活性（Shan等人，2021年）。皂苷是两亲性糖苷，含有亲水糖基团和疏水苷元，赋予其表面活性并在油水界面自组装的能力（Chen等人，2025年）。这些界面活性可以通过界面吸附和与蛋白质的相互作用促进乳液的形成和稳定（Zhu等人，2019年）。因此，由于其疏水苷元骨架和亲水糖链，PGS具有天然的乳化潜力。然而，皂苷的化学稳定性经常受到环境因素的影响，包括热、极端pH值和氧化条件，这些因素可能导致水解、降解或生物活性丧失。疏水皂苷元还可能在水环境中聚集或结晶，从而降低生物利用度（Schreiner等人，2023年）。将皂苷封装在具有强界面屏障的纳米乳液中可以保护它们免受环境干扰，从而提高稳定性和生物利用度。纳米乳液能够增强皂苷的稳定性和生物利用度（Artiga-Artigas等人，2017年），但传统的合成表面活性剂系统存在安全性问题，并且pH/离子强度的稳定性有限（Dabestani等人，2021年）。将植物来源的蛋白质与皂苷结合形成复合界面层，可以通过氢键、疏水相互作用和静电吸引增强界面膜，从而提高乳液稳定性并减少环境干扰（Zhou等人，2021年）。最近，关于大豆蛋白-皂苷稳定乳液及其环境稳定性的研究越来越全面。然而，大多数现有研究主要关注广泛使用的皂苷（如人参皂苷、茶皂苷、奎拉哈皂苷）的乳化性能，或者仅关注作为表面活性剂的单个蛋白质。像大豆分离蛋白（SPI）这样的植物蛋白由于其乳化能力、生物相容性和营养价值而成为有吸引力的稳定剂（Zhou等人，2022年）。皂苷与蛋白质之间的相互作用可以是双方面的：皂苷可能以疏水性方式结合到蛋白质表面，改变界面吸附，而糖基团可以与极性残基形成氢键（Dabestani等人，2021年；Li等人，2021年；Yan等人，2022年）。这种动态复合物可以调节流变学性质，并提高纳米乳液的长期稳定性，可能延缓皂苷的水解或氧化降解。因此，植物蛋白-皂苷纳米乳液有望实现稳定的包封和调控释放，从而提高稳定性和保持生物活性。

在我们的先前工作中，我们使用离子液体辅助超声方法提取了PGS，并对其抗氧化和抗衰老活性进行了表征（Shang等人，2024年），在此基础上，我们探索了不同PGS负荷下的复合PGS-SPI纳米乳液。本研究旨在阐明PGS-SPI纳米乳液的界面相互作用和微观结构，以及这些特性如何影响液滴稳定性，评估PGS负荷对理化性质和包封效率的影响，评估环境和储存稳定性，特别是包封保存和抗氧化保护作用，并明确SPI-PGS界面层在功能性食品和营养保健品递送系统中的应用中的延迟降解作用。

**2. 材料与方法**
2.1. 材料与化学品
PG（二年生植物）的根材来自中国安徽的霍山。中链甘油三酯（MCT，纯度≥99%）、异丙基苯过氧化物（纯度≥80%）和食品丙二醛（MDA）测试试剂均购自中国上海的源业生物科技有限公司。尼罗红（HPLC级，纯度≥95%）购自上海的Aladdin Reagent有限公司。大豆分离蛋白（SPI，蛋白含量≥92%）购自北京Solarbio科技有限公司。Tween-80购自上海的Sangon Biotech有限公司。异辛烷、异丙醇、甲醇和1-丁醇均为分析纯试剂，购自中国上海的药华化工试剂有限公司。
2.2. PGS的提取
桔梗皂苷（PGS）的提取方法参考了先前的研究，并进行了一些调整（Shang等人，2024年）。预处理的桔梗根粉（1 g）与0.8 mol/L [C4min]Br溶液以1:40（g/mL）的比例混合，在43 °C下、585 W的功率下提取40分钟。离心后，使用D101树脂进行色谱吸附，然后将洗脱液冻干以获得纯化样品。
2.3. PGS的脂肪结合能力、泡沫能力和泡沫稳定性
根据Hu等人（2022年）的方法进行微调，将0.5 g干燥的PGS粉末（记为M0）加入10 mL MCT油中，振荡1小时后以6000 rpm离心15分钟，记录固体重量为M1。脂肪结合能力按照以下公式计算：
(1) 脂肪结合能力（%）= (W0 ? W1) / W0 × 100%
将PGS粉末（60 mg）溶解在蒸馏水中（10 mL），记录溶液体积为V0。然后使用XHF-DY高速分散器（Scientz，中国）以10,000 rpm匀质化3分钟，记录体积为Vt。在室温下放置30分钟后，记录体积为VT。泡沫能力和泡沫稳定性按照以下公式计算：
(2) 泡沫能力（%）= (Vt ? V0) / V0 × 100%
(3) 泡沫稳定性（%）= (VT ? V0) / V0 × 100%
2.4. PGS的水接触角测定
为了评估PGS的表面亲水性/疏水性，使用接触角仪（JC2000DM，中国）根据Liu等人（2023年）的方法测定样品的接触角（θ）。将PGS样品压制成直径13 mm、厚度1 mm的薄片。在样品表面滴加3 μL超纯水滴，从捕获的图像中计算接触角。测量在室温下进行，取三次测量的平均值。
2.5. PGS-SPI纳米乳液的制备
PGS-SPI（O/W）纳米乳液的制备方法参考了Hou等人（2019年）的描述，并进行了一些修改。将PGS溶解在MCT（油相）中。SPI（1% w/v）在超纯水中溶解，并用磁力搅拌2小时，然后在4 °C下过夜水化（水相）。将连续相和分散相按比例混合，然后在XHF-DY高速分散器（Scientz，中国）下以600 W的功率超声处理5分钟，再以10,000 rpm剪切3次（共3次循环），得到不同皂苷浓度的PGS-SPI纳米乳液。PGS的浓度分别为20、40、60、80和100 mg/mL。
2.6. PGS-SPI复合纳米乳液的表征
2.6.1. 粒径、多分散指数（PDI）和Zeta电位
使用Zetasizer Nano-ZSE分析仪（Malvern，英国）在25 °C下测定PGS-SPI纳米乳液的粒径、PDI和Zeta电位。测试前将样品用超纯水稀释。
2.6.2. 相分离指数（PSI）
将新鲜乳液（20 mL）在室温下储存24小时，测量乳清层高度（H1）和总乳液高度（H0）：
(4) PSI（%）= (H1 / H0) × 100%
2.6.3. 包封效率（EE）
根据Feng等人（2025年）的方法对PGS纳米乳液的包封效率（EE）进行测定。在离心前向纳米乳液中添加无水乙醇和正己烷，然后以3000 rpm离心15分钟。测量上清液中的PGS含量（Shang等人，2024年）。EE的计算公式如下：
(5) EE（%）= (M0 ? M1) / M0 × 100%
其中M0是最初加入的PGS总含量，M1是游离PGS的含量。
2.6.4. 浊度
使用UV-2600分光光度计（Shimadzu，日本）在600 nm波长下测定稀释后纳米乳液的浊度，以超纯水作为空白对照。A表示稀释后乳液在600 nm处的吸光度，V表示稀释次数，I表示光学范围差（取1 cm）。浊度按照以下公式计算：
(6) 浊度（cm?1）= 1.302 × A / V
2.6.5. 傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析
使用Frontier光谱仪（PerkinElmer，美国）对纳米乳液样品进行FTIR分析，扫描范围为650至4000 cm?1，分辨率4 cm?1。
2.6.6. 共聚焦激光扫描显微镜观察（CLSM）
使用TCS SP 8共聚焦激光扫描显微镜（Leica，德国）根据Xia等人（2022年）的方法观察纳米乳液的微观形态，并进行了一些修改。将10 μL尼罗红溶液（0.1% w/v）与乳液（10 mL）混合，在黑暗中孵育30分钟，然后在552 nm激发下观察。
2.6.7. 原子力显微镜观察（AFM）
使用原子力显微镜（Dimension Fastscan，Bruker，德国）根据Zou等人（2022年）的方法进一步观察乳液的表面形态，并进行了一些修改。将稀释后的乳液（20 μL，100 ×）滴在云母上，空气中干燥后使用NanoScope分析软件进行扫描。
2.6.8. 流变性质
根据Feng等人（2025年）的方法测定乳液的流变性质，并进行了一些修改。试验在25 °C下进行，使用40 mm平行板（1 mm间隙）。进行稳态剪切测试（0.01至100 s?1），以及振荡频率扫描（0.01至10 Hz），以确定储存模量（G′）和损失模量（G″）。
2.7. PGS-SPI纳米乳液的物理稳定性评估
2.7.1. pH稳定性
根据Yu等人（2023年）的方法进行修改，使用1 M HCl或NaOH将新鲜乳液的pH调整至3–11。记录乳液的外观变化，并测定乳液的粒径、PDI、Zeta电位和皂苷的包封效率。
2.7.2. NaCl稳定性
为了评估离子强度对乳液系统稳定性的影响，向新鲜乳液中加入NaCl溶液，NaCl浓度范围为0至0.5 mol/L。记录乳液外观的变化，并测定乳液的粒径、PDI、Zeta电位和皂苷的包封效率。
2.7.3. 热稳定性
为了评估热处理对乳液系统稳定性的影响，将新鲜乳液在水浴中加热至20至100 °C，保持30分钟后冷却至室温。记录乳液的外观变化，并测定乳液的粒径、PDI、Zeta电位和皂苷的包封效率。
2.7.4. 冻融稳定性
将乳液（15 mL）在–20 °C下冷冻24小时，然后在室温下解冻三次。每次循环后记录外观变化，并测定粒径、PDI、Zeta电位和包封效率。
2.8. PGS-SPI纳米乳液的储存稳定性评估
2.8.1. 储存过程中纳米乳液的理化性质变化
将乳液（15 mL）在37 °C下储存28天，每7天取样一次。测定外观、粒径、PDI、Zeta电位和包封效率。
2.8.2. 储存过程中纳米乳液的氧化稳定性变化
根据Jian等人（2023年）的方法，使用过氧化物值（POV）和硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）作为储存过程中乳液氧化稳定性的指标，并进行了一些修改。对于POV的测定，将乳液样品（0.3 mL）与异辛烷/异丙醇（1.5 mL，3:1 v/v）混合，涡旋后离心（5000 rpm，2分钟），将上清液（0.2 mL）与甲醇/丁醇（2.8 mL，2:1 v/v）、硫氰酸铵（15 μL，3.94 M）和亚铁溶液（15 μL，来自0.132 M BaCl?和0.144 M FeSO?）在黑暗中反应20分钟，然后在510 nm处测量吸光度。过氧化氢的含量是通过异丙基苯过氧化氢标准曲线（y = 0.1262x + 0.1984，R2 = 0.9946）来确定的。对于TBARS，将乳液（2毫升）与MDA溶液（10毫升）混合，然后离心（5000转/分钟，15分钟），并将上清液（1.5毫升）在90°C下与TBA工作溶液（1.5毫升）反应30分钟。在冰浴中冷却并再次离心（10,000转/分钟，15分钟）后，测量上清液在532纳米处的吸光度。马来酰醛的含量是通过1,1,3,3-四乙氧基丙烷标准曲线（y = 0.6888x + 0.0054，R2 = 0.9994）来计算的。

2.8.3. 储存过程中纳米乳液颜色的变化
使用DS400分光光度计（Hzcaipu，中国）测量储存期间乳液样品的色度。仪器经过校准，并记录样品的L*（亮度）、a*（红/绿）和b*（黄/蓝）值。总色差（ΔE）根据公式（7）计算：
(7) ΔE = (L* ? L0*)2 + (a* ? a0*)2 + (b* ? b0*)2

2.9. 统计分析
所有实验数据表示为三次独立测量的平均值±标准偏差。使用SPSS 26.0进行统计分析，显著性水平为p < 0.05，并使用Origin 2022生成图表。

3. 结果与讨论
3.1. PGS的功能特性
用皂苷形成的油水乳液通常具有小的滴粒尺寸和高稳定性。PGS的脂肪结合能力为1.54克油/克样品，优于SDS（1.38克油/克样品），而SDBS的脂肪结合能力最高，为1.74克油/克样品，这可能归因于其长链疏水结构，使其更有效地接触和结合油分子（表1）。虽然PGS的脂肪结合能力和泡沫能力（41.2%）优于SDS，但略逊于SDBS，其泡沫稳定性（30.1%）低于SDBS。PGS在泡沫生成方面具有一定优势，但其稳定性略低于SDBS（35.2%），而SDS的泡沫能力和稳定性（30.8%）较低，主要是由于其疏水性较差，因此SDS形成的泡沫结构容易迅速破裂（McClements & Gumus, 2016）。PGS的两亲性使其能够有效地乳化脂肪，支持其作为天然乳化剂的潜力（Zhu等人，2019）。
表1. PGS和对照样品的脂肪结合能力、泡沫能力和泡沫稳定性
样品 脂肪结合能力（克油/克样品） 泡沫能力（%） 泡沫稳定性（%） 水接触角（°） 水接触角照片
PGS 1.54 ± 0.03b 41.2 30.1 25.42 ± 2.52c
SDBS 1.74 ± 0.04a 52.5 35.2
SDS 1.38 ± 0.06c 30.8 29.42 ± 2.52b
注：每行中显著差异由不同的字母表示（p < 0.05）。

3.2. 水接触角分析
PGS在所测试的乳化剂中表现出最亲水的表面（θ = 25.42°），显著低于SDS（29.42°）和SDBS（34.58°），这归因于极性糖基团与水形成氢键（Fan等人，2018）。如图1所示，PGS（20–100）-SPI纳米乳液在24小时后呈现乳白色并发生相分离（图1A），并显示单峰尺寸分布（图1B），其微观结构如图2所示。

3.3. PGS-SPI纳米乳液的表征
将PGS浓度从20毫克/毫升增加到60毫克/毫升时，粒径从712.4纳米减小到295.3纳米，PDI降低到0.315，绝对Zeta电位增加到-58.17毫伏，PSI降低到2.75%，表明稳定性增强。进一步将PGS浓度增加到100毫克/毫升时，粒径增加到531.2纳米且PDI增加，表明发生聚集（图1B）（Long等人，2020）。所有纳米乳液的绝对Zeta电位均小于-30毫伏，表明具有强的静电稳定性（图1C（Wu等人，2025））。PSI与稳定性呈负相关（较高值表示更容易分层/絮凝）（Taha等人，2019），其变化趋势与粒径趋势一致。PGS（20）-SPI的PSI显著高于其他配方（p < 0.05），而增加PGS浓度后PSI降至2.75 ± 0.04%，表明稳定性增强（图1D）。浊度反映了粒径和分布，PGS（60）-SPI的浊度最低（68.71 ± 1.08厘米^-1），优于PGS（40）-SPI（72.07 ± 1.08厘米^-1）和PGS（80）-SPI（73.93 ± 1.88厘米^-1），后者之间无显著差异（p > 0.05）（图1E）。这些数据表明，最佳的PGS浓度可以增强纳米乳液的均匀性。所有PGS（20–100）-SPI纳米乳液的包封保留率均超过60%，其中PGS（60）-SPI的包封保留率最高，达到83.64 ± 1.42%，比PGS（20）-SPI（60.85 ± 1.11%）高20%以上，这与Chen等人（2020）的研究结果一致。这些发现共同表明，纳米乳液的性能不仅仅取决于皂苷浓度的增加，还取决于达到最佳的SPI–PGS界面组装状态，这种状态平衡了分子相互作用强度、界面饱和度和胶体稳定性。然而，当PGS浓度超过最佳阈值（80–100毫克/毫升）时，过量的皂苷分子可能会超出SPI的界面吸附能力，导致分子自聚集或竞争性界面吸附。这种过量可能会破坏SPI–PGS复合物在界面的有序排列，从而导致液滴聚集、粒径分布变宽和包封性能下降。因此，PGS（60）-SPI纳米乳液的优异性能可能反映了足够的界面覆盖和结构稳定性之间的最佳平衡。

3.4. 傅里叶变换红外光谱分析
PGS–SPI纳米乳液显示出表明界面相互作用的光谱位移（图1F）。SPI的酰胺I和II带分别出现在1635和1531厘米^-1，这与C = O伸缩和N–H/C–N振动一致（Liu等人，2015）。在PGS–SPI体系中，酰胺I带从1635厘米^-1移动到1640厘米^-1，主要是由于肽主链的C = O伸缩振动。尽管酰胺I带本身不是“氢键形成区”，但C = O基团是氢键（C = O···HN）形成的关键参与者。氢键的形成和强度直接影响C = O键的力常数。红移（波数减小）表明氢键更强或增加，而峰形的变化反映了蛋白质二级结构的变化。关于疏水相互作用，它们不直接产生红外吸收，但通过驱动蛋白质的构象变化间接影响酰胺I峰，从而改变局部氢键网络。这间接表明氢键和疏水相互作用会导致构象变化（Kaspchak等人，2020）。在3294厘米^-1附近的新峰以及C–H和糖苷键区域的变化表明皂苷糖基团的分子间氢键形成。PGS（60）-SPI复合物显示出关键的光谱变化：3293.6厘米^-1的峰（N–H/O–H伸缩）表明氢键存在；C–H伸缩从2970.2厘米^-1移动到2923.5厘米^-1（SPI）和2972–2901厘米^-1（PGS）到2988.6厘米^-1和2901.8厘米^-1，反映了疏水相互作用的增强（Shi等人，2022）。1394.15厘米^-1处的强度增加表明蛋白质酰胺基团和皂苷羟基/糖基团之间形成了新的氢键。糖苷键相关的变化从1241.6厘米^-1到1250.3厘米^-1和1070–1037.8厘米^-1到1066.3厘米^-1（Feng等人，2015）证实了皂苷糖基团参与了复合物的形成。

3.5. 微观结构观察
CLSM成像（图2A1-E1）显示，在中等PGS浓度（60毫克/毫升）下，液滴呈球形且分散均匀；而在较高浓度下形成不规则的聚集体。AFM（图2A2-E3）显示，44.95–173.20纳米的粒子在60–80毫克/毫升的PGS下变得更加规则且分散均匀。在100毫克/毫升时，聚集和表面粗糙度的增加降低了稳定性。皂苷浓度显著影响纳米乳液的微观结构和稳定性。在60–80毫克/毫升的PGS下，AFM显示更规则的椭圆形粒子且分散均匀，表明蛋白质-皂苷的共组装和稳定的纳米复合物形成（Zou等人，2022）。在100毫克/毫升时，粒子聚集和表面粗糙度的增加降低了分散性和稳定性，显示出浓度依赖性效应。

3.6. 流变性质
乳液表现出剪切稀化行为，粘度随PGS浓度的增加而增加，在60毫克/毫升时达到峰值（图3A）。如图3A所示，这一趋势反映了在中等PGS负荷下液滴间的相互作用增强和更紧密的网络结构，这体现在储存和储能模量数据中（Wang等人，2023）。高频扫描显示G′ > G″，表明在低频下网络结构以弹性为主，而在高频下G″接近G′，表明在应力下表现为流体样行为（图3B）。PGS浓度调节了弹性和网络连通性，中等负荷（60毫克/毫升）为稳定的纳米乳液提供了最佳的流变性质。Huang等人（2025）的研究结果与本研究一致，即所有纳米乳液的G'和G''值在中等频率附近交叉，其流变行为从G' > G''变为G'' > G'。PGS表现出天然的乳化剂特性，可以稳定乳液，但其固有的流动性导致在高浓度（60–100毫克/毫升）下G'' > G'的行为，表明浓度对纳米乳液的弹性和网络结构有依赖性。

3.7. PGS-SPI纳米乳液的物理稳定性分析
3.7.1. pH稳定性
PGS-SPI纳米乳液（60毫克/毫升）在pH 3–5和9–11时发生相分离，但在pH 6–8时保持稳定（图4A1）。在pH 4.0时，粒径和PDI显著增加至1052.6纳米和0.675（p < 0.05），接近SPI的等电点（3.5–4.5），此时静电排斥力减弱，导致聚集（Zhou等人，2020）。最小液滴尺寸（390.9纳米）和PDI（0.395）出现在pH 7.0。绝对Zeta电位在pH 7.0时达到峰值48.23毫伏，并在pH 6–9时保持在40毫伏以上，证实了在中性环境下的良好稳定性。包封保留率在pH 7.0时最高（75.27%），并在pH 6–9时保持在60%以上，但在pH 11时由于结构损伤而降至39.16%。纳米乳液在中性至微酸性条件下最为稳定。

3.7.2. NaCl稳定性
将NaCl浓度从0增加到0.5 M时，粒径从241.5纳米增加到1024.3纳米，PDI从0.359降低到0.641，绝对Zeta电位从50.80降低到33.37毫伏，包封保留率从77.90降低到50.12%（图4B2-C2）。在0–0.2 M NaCl时，变化最小，保持了纳米乳液的质量。在0.5 M NaCl时，由于静电屏蔽作用，发生了显著的层离和絮凝（Qin等人，2021）。在0.5 M NaCl下，PGS-SPI纳米乳液的稳定性明显下降，出现液滴聚集和絮凝（图4A2），并且大于1微米的粒子的绝对Zeta电位降低到33.37 ± 0.87毫伏。与Xu等人（2019年）的研究结果一致，他们报告称在0–0.2 M NaCl条件下HRG-Quillaja皂苷乳液是稳定的。低离子强度（<0.2 M）对于PGS-SPI纳米乳液的稳定性至关重要。图4A3-C3展示了PGS-SPI纳米乳液在不同温度环境中的稳定性。PGS（60）-SPI纳米乳液在低温（30–50°C）下呈现出稳定且均匀的外观，没有明显的分层现象（图4A3）。当温度升高到100°C时，乳液的稳定性逐渐下降，出现更明显的分层或浑浊。如图4B3所示，经过30分钟处理在30–50°C下的PGS（60）-SPI纳米乳液的粒径和PDI没有显著变化（p > 0.05），滴粒大小在38 nm范围内，PDI保持在0.4以下。随着温度的升高，滴粒大小和PDI逐渐增加；特别是在100°C时，滴粒大小高达1.56 μm，PDI为0.827。纳米乳液的热稳定性随温度的升高而逐渐降低。值得注意的是，经过70分钟在70°C下处理后，粒径仅为489.93 nm，Zeta电位的绝对值为48.07 ± 1.86 mV， envelopment efficiency（EE）为67.40 ± 1.63%（图4C3）。这表明滴粒之间仍然存在强烈的静电排斥作用，乳液系统的结构保持完整，从而避免了滴粒的聚集和絮凝（Yang等人，2021年）。当乳液在90至100°C的高温下处理时，会析出水性沉淀物，其Zeta电位的绝对值均<40 mV（分别为-31.83 ± 1.40 mV和-28.47 ± 1.98 mV），EE急剧下降至36.57 ± 2.06%。图5A显示，在初始状态下，乳液呈乳白色，相对稳定且均匀。经过一次冻融循环后出现分层；经过两次循环后发生絮凝和沉淀；经过三次循环后，乳液变得越来越浑浊。这可能是由于水冻结导致油滴被迫靠近，从而屏蔽了滴粒之间的静电排斥作用，导致滴粒聚集和水油分离（Wang等人，2022年）。下载：下载高分辨率图像（796KB）下载：下载全尺寸图像。图5. 冻融循环对PGS-SPI纳米乳液稳定性的影响：(A) 外观，(B) 粒径，(C) PDI，(D) Zeta电位，(E) 微囊化保持率。如图5B所示，所有三组纳米乳液在经过一次冻融循环后粒径略有增加，这归因于冻融过程中发生的水油分离。随着冻融循环次数的增加，滴粒大小逐渐增大，三组乳液之间的稳定性差距扩大，特别是在二次冻融循环后，PGS（40 mg/mL）-SPI乳液的粒径显著增加到1.44 μm，PDI从0.416增加到0.752（图5C）。这可能是因为在低皂苷浓度下，结合在滴粒表面的蛋白质层较薄，油滴在冷冻和解冻过程中容易沉淀和聚集。所有三组乳液的Zeta电位的绝对值都呈下降趋势（图5D），冻融循环可能导致蛋白质分子变性以及表面电荷的变化，从而增强了电荷屏蔽效应，导致Zeta电位的绝对值下降（Zang等人，2019年）。皂苷浓度为60 mg/mL的乳液具有最佳的冻融稳定性，Zeta电位的绝对值下降了约11 mV，而其他两组的下降幅度接近20 mV。图5E显示，PGS（60）-SPI纳米乳液的envelopment efficiency（EE）在冻融循环后仍然较高（52.21 ± 1.30%），而其他两组乳液的EE分别从72.58 ± 1.11%和74.32 ± 0.88%下降到28.75 ± 1.57%和34.0 ± 1.75%。图3.7.4 PGS-SPI纳米乳液的储存稳定性分析。图6A显示，在37°C下储存四周后，乳液的颜色和状态发生了显著变化。所有三组乳液都出现了不同程度的相分离，脂肪层的颜色逐渐变黄，且在28天时有少量白色絮状物附着在玻璃瓶的内壁上。下载：下载高分辨率图像（846KB）下载：下载全尺寸图像。图6. 储存过程中PGS-SPI乳液的外观（A）、粒径（B）、PDI（C）、Zeta电位（D）、微囊化保持率（E）、POV（F）和TBARS（G）的变化（28天）。如图6B所示，所有三组乳液的粒径随储存时间的增加而显著增大（p < 0.05）。到第7天时，所有乳液都得到了良好的稳定，平均粒径<525 nm，PDI<0.4（图6C），其中PGS（60）-SPI的PDI最小（0.325）。到第21天时，PGS（40）-SPI和PGS（80）-SPI纳米乳液的稳定性显著降低，粒径分别达到1066.1 ± 31.85 nm和1238.1 ± 39.2 nm，PDI分别为0.693和0.714。据认为，纳米乳液平均粒径的增大可以由Ostwald熟化现象解释（Zhou等人，2020年）。此外，Chen等人（2019年）的研究表明，长期储存过程中系统的pH值可能会发生变化，导致滴粒尺寸增大。然而，PGS（60）-SPI乳液的粒径仍保持在纳米级（344.5 ± 19.5至892.9 ± 13.0 nm），与其他两组乳液有显著差异（p < 0.05），这一点通过Zeta电位的测量结果得到证实（图6D）。在28天的储存期间，绝对电位持续下降，但PGS（60）-SPI和PGS（80）-SPI乳液的绝对电位均在40 mV左右。到第28天时，PGS（40）-SPI和PGS（80）-SPI乳液的绝对电位没有显著差异，分别为33.2 ± 1.53 mV和32.77 ± 0.96 mV。图6E显示，与储存首日相比，不同皂苷浓度的PGS-SPI纳米乳液的微囊化保持率均显著下降。28天后，PGS（60）-SPI纳米乳液中的活性成分含量仍保持在64.89%，仅比初始值低16.75%。PGS（80）-SPI纳米乳液的微囊化保持率变化更为明显，从75.35 ± 1.57%（第0天）下降到40.33 ± 1.88%（第28天），表明皂苷浓度对纳米乳液的储存稳定性有较大影响。值得注意的是，PGS（80）-SPI的微囊化保持率（58.15 ± 2.83%）在第14天时就低于PGS（40）-SPI（EE = 64.31 ± 1.24%），并且在第21天时两者之间没有显著差异（p > 0.05）。图3.8.2 乳液的氧化稳定性变化。如图6F-G所示，所有三组乳液的POV和TBARS含量随储存时间的增加而持续增加，PGS（60）-SPI的初级和次级氧化产物的形成速率较低，其氧化稳定性优于PGS（80）-SPI和PGS（40）-SPI。这可能是因为PGS本身具有优异的抗氧化性能（Shang等人，2024年），可以清除油水界面或油相中产生的自由基。如图6F所示，三组乳液之间的POV含量最大差异在第0天时仅为0.12 mmol/kg。储存28天后，PGS（40）-SPI的POV含量（3.00 ± 0.12 mmol/kg）显著高于PGS（60）-SPI（2.05 ± 0.09 mmol/kg）和PGS（80）-SPI（2.64 ± 0.05 mmol/kg）（p < 0.05）。TBARS含量的变化与POV含量类似。储存期结束后，乳液中的TBARS含量显著增加，分别为1.89 ± 0.02 μmol/kg、1.52 ± 0.02 μmol/kg和1.04 ± 0.06 μmol/kg。这可能是由于PGS（60）-SPI的滴粒尺寸较小，其界面层较密集，起到了抑制脂质氧化的作用（Jian等人，2023年）。图3.8.3 乳液颜色的变化。在37°C下储存28天后，PGS-SPI纳米乳液的颜色发生了显著变化（图7），这与乳液外观的变化基本一致（图6A）。如图7A所示，所有三组乳液样本的L*值呈下降趋势，表明乳液的颜色逐渐变深。如图7B所示，所有三组乳液的a*值先下降后上升。如图7C所示，b*值随储存时间的增加而逐渐增加，特别是在皂苷浓度为80 mg/mL的溶液样本中，b*值从2.55 ± 0.10增加到4.94 ± 0.09（p < 0.05），表明乳液的黄褐色加深。从图7D可以看出，所有三组乳液的ΔE值均呈线性增加，ΔE主要受L*和b*值的影响。在37°C下储存28天后，所有三组乳液的ΔE值变化超过3个单位，表明颜色发生了明显变化，其中皂苷浓度为60 mg/mL的乳液ΔE值增加了6.52个单位（p < 0.05）。这些颜色变化反映了氧化、成分降解或微生物活动的影响。下载：下载高分辨率图像（670KB）下载：下载全尺寸图像。图7. PGS-SPI纳米乳液在储存过程中的颜色变化：(A) 亮度（L*）；(B) 红/绿值（a*）；(C) 黄/蓝值（b*）；(D) 总颜色差异（ΔE）。4. 结论本研究证明，Platycodon grandiflorum皂苷和大豆蛋白分离物（PGS–SPI）的纳米乳液是一种稳定的天然乳液系统，PGS增强了SPI形成的界面膜。PGS的天然乳化能力通过其两亲结构得到了证明，表现为强界面活性和良好的起泡性能。PGS–SPI配方通过氢键和疏水相互作用形成了紧密的SPI–PGS界面层，形成了密集、相互连接的网络，并具有有利于最终产品质地发展的流变性能。该系统在中性至温和碱性条件下具有优异的稳定性，在低离子强度和适度加工温度下表现稳定；极端条件会导致聚集或相分离，界定了配方的操作限制。储存研究表明，微囊化保持率和脂质氧化延迟，表明其具有增强的抗氧化保护作用，这与致密的界面膜有关。其与传统单元操作（高压均质化、巴氏杀菌）的兼容性、适合质地设计的流变性能以及明确的操作边界为食品工程师提供了实用的配方指南。使用成本效益高、可持续来源的原材料符合行业向清洁标签和环保生产的转变。未来的工作应重点关注放大验证、在实际食品基质中的整合以及全面的成本效益分析，以促进工业化应用。虽然本研究展示了PGS–SPI纳米乳液作为绿色乳化系统的潜力，但仍需认识到一些限制。首先，稳定性评估主要在体外条件下进行，PGS–SPI纳米乳液在实际食品基质和体内胃肠道环境中的表现仍有待验证。其次，SPI–PGS界面相互作用的分子机制是基于FTIR光谱间接推断的。未来的研究应利用先进的界面表征技术阐明SPI–PGS复合物的竞争性吸附动力学和界面流变行为，并通过体外消化模型和动物研究评估微囊化生物活性物质的生物可访问性和生物利用度。伦理声明本研究未涉及人类和动物的实验。作者贡献声明：Wang-Wei Zhang：撰写–原始草稿、软件使用、方法论、数据管理。Hui Chen：方法论、研究实施、数据分析。Jing-Ling Yang：数据分析。Xiu-Xiu Zhang：数据分析。Zhi-Jing Ni：资源获取、资金筹集。Ya-Fang Shang：项目管理、资金筹集、概念构思。魏兆军：写作——审稿与编辑、监督、资源调配、项目管理、概念构思。
基兰·塔库尔：写作——审稿与编辑、验证、形式分析。