用于高通量单细胞质谱分析的模块化镧系元素条形码

《Applied Materials Today》：Modular lanthanide barcodes for high-throughput single-cell analysis by mass cytometry

　　黄培青|魏春雷|王伟|李明瑞
北京工商大学轻工业科学与工程学院化妆品系，北京100048，中国

**摘要**
在单细胞分辨率下全面识别多种细胞群体仍然是生物医学研究中的一个核心挑战。质谱流式细胞术是一种强大而敏感的技术，它使用稀土金属同位素代替荧光染料，但其多重检测能力从根本上受到可区分镧系元素数量的限制。在这里，我们提出了一种模块化的金属编码策略，通过组合镧系元素条形码技术来扩展多重检测能力。通过将镧系-DOTA螯合物作为单体构建块，我们基于15种镧系元素构建了一个理论上的C151+C152+C153+C154…条形码矩阵，能够生成多达32,767个独特的分子代码。其中一个条形码物种被连接到抗CD45抗体上，证明了其区分不同细胞群体的能力，并凸显了其在标记多种生物分子和细胞目标方面的潜力。

**引言**
高通量（HTP）组合方法对于提高各种生物测定的效率与可比性至关重要，从而减少具有大参数空间和深入分析的研究所需的时间和试剂消耗。[1]、[2]、[3] 这些方法主要依赖于基于微球的ELISA、核酸酶保护试验（RPA）、聚合酶链反应（PCR）和DNA测序，这些技术大大减少了人为干预并提高了测定通量。[4]、[5]、[6] 然而，ELISA通常每次测定只能定量一种分析物（例如一种细胞因子），这限制了其多重检测能力。同样，尽管PCR和DNA测序方法非常敏感，但它们的多重检测能力有限，且常常需要复杂的引物或文库设计，这会增加实验的复杂性和成本。[7]、[8]、[9] 此外，这些技术通常缺乏在单细胞层面同时提供高维读数的能力，进一步限制了它们在复杂生物系统中的应用。因此，测定通量、试剂消耗和信息含量之间存在一个基本的权衡。[10]、[11]、[12] 为了解决这些限制，开发了单细胞分析技术，特别是流式细胞术，以实现单个细胞内多个目标的同步定量，提供了更高的多重检测能力和生物分辨率。[13]、[14]、[15] 然而，由于荧光发射谱通常较宽，且染料的发射强度不同，这种光谱方法面临着色素之间光谱重叠的问题，这限制了可区分的目标数量。
质谱流式细胞术是流式细胞术的最新发展，它使用稀土金属同位素作为检测试剂，是一种强大而敏感的检测工具。[16]、[17]、[18]、[19] 然而，其多重检测能力受到可区分信号数量的限制，目前仅限于15种可用的镧系元素。[20]、[21]、[22]、[23] 条形码技术可以克服这一问题。[24]、[25]、[26] 我们推测，在一个分子中按顺序排列的两个或更多镧系离子可以为每种元素排列产生一个唯一的ICP-MS可读结果。特定的测定标识符被用作条形码来标记每个样本，然后将带有条形码的样本汇集在一起进行处理和测量。[26]、[27] 接着，使用这些唯一可识别的条形码来恢复各个样本以进行进一步分析。这种策略大大增加了可以用有限数量的元素生成的信号和分子代码的数量。[27]、[28]、[29]
在这里，我们提出了一种“模块化”的金属编码标签工程策略，用于构建质谱流式细胞术条形码库。预先合成的DOTA-Ln单体作为多功能构建块，通过固相合成实现了灵活且可编程的金属编码标签组装。与直接金属掺入策略相比，这种方法提高了合成效率、重复性和序列控制能力。理论上，通过结合15种镧系元素，可以轻松构建一个理想的C151+C152+C153+C154…条形码矩阵。随后，在马来酰亚胺功能化之后，具有特定代码的金属编码标签被连接到目标抗体上。这种条形码多重检测技术允许在每个汇集样本中进行多达32,767次基于抗体的单细胞水平测量。最终，通过检测与条形码相对应的元素离子，实现了细胞样本的分类，为基因表达研究、高通量筛选、医学诊断等领域广泛应用奠定了基础。

**材料**
三叔丁基1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA，137076–54–1）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，6066–82–6）、Fmoc-Lys-OH（105454–51–7）、6-马来酰亚氨基己酸（MICA，55750–53–3）、O-(6-氯苯并三唑-1-yl)-N,N,N′,N′-四甲基脲onium六氟磷酸盐（HCTU，330645–87–3）购自上海必德制药技术有限公司。六水合硝酸铽(III)（13451–19–9）、六水合硝酸镨(III)（15878–77–0）、氯化钬(III)

**DOTA-Ln金属编码标签的两步模块化合成**
在这项研究中，我们选择了1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（DOTA）作为金属螯合剂，因为它具有出色的配位和螯合能力。[30]、[31] 在构建金属编码标签的“模块化”方法中，采用了两步过程。第一步是预合成DOTA-Ln单体，主要目的是制备关键的功能化构建块DOTA-Ln，如图1A所示。该结构通过MALDI-TOF MS进行了验证。

**结论**
总之，我们提出了一种使用组合镧系-DOTA单体的模块化金属编码方法，基于15种镧系元素构建了一个理论上的C151+C152+C153+C154…条形码矩阵，能够生成多达32,767个独特的分子代码，这可能会显著提升条形码库的容量。经过马来酰亚胺功能化后，编码标签被连接到抗体上进行单细胞分析。所得到的 conjugates 允许清晰地区分不同的细胞群体。

**作者贡献声明**
黄培青：撰写——原始草稿，数据管理。
魏春雷：撰写——原始草稿，数据管理。
王伟：撰写——审阅与编辑，验证，资金获取。
李明瑞：撰写——审阅与编辑，撰写——原始草稿，可视化，验证，监督，项目管理，研究调查，资金获取，数据管理，概念化。

**利益冲突声明**
作者没有财务或个人利益会影响他们的客观性。

**致谢**
本工作得到了国家自然科学基金（项目编号22507007）、海南省自然科学基金（526QN0534）和海南大学启动研究基金（XJ2500000574）的支持。