ATG16L1介导的马尼拉蛤对Vibrio parahaemolyticus感染的免疫反应中的自噬机制

《Aquacultural Engineering》：ATG16L1-mediated autophagy in the immune response of Manila clam to Vibrio parahaemolyticus infection

　　

Jie Yu|Hongtao Nie

中国大连海洋大学渔业与生命科学学院，大连 116023

摘要

马尼拉蛤（Ruditapes philippinarum）是一种具有重要商业价值的双壳类物种，但其水产养殖面临着由致病性Vibrio parahaemolyticus爆发引起的严重威胁。因此，阐明蛤对这种细菌感染的分子反应机制对于开发有效的水产养殖免疫保护策略至关重要。在本研究中，我们发现在V. parahaemolyticus感染后72小时和10小时内，与自噬相关的基因表达显著增加。通过RNA干扰（RNAi）处理，血淋巴中的ATG16L1基因表达显著降低，其下游基因（LC3、ATG3、ATG7、NBR1和ATG4）也显著下调（P < 0.05）。透射电子显微镜（TEM）观察显示，自噬过程受到抑制，干预组中的自噬体数量明显少于对照组（P < 0.05）。为了评估ATG16L1的功能作用，我们向R. philippinarum体内注射了体外转录的ATG16L1过表达载体mRNA，并在注射后24小时收集血淋巴。结果显示，自噬相关基因（ATG16L1、LC3、ATG3、ATG7）在血淋巴中的表达显著增加（P < 0.05），过表达组中的自噬体数量也明显高于空白对照组（P < 0.05）。这些结果表明，在V. parahaemolyticus的刺激下，ATG16L1基因在调节R. philippinarum的自噬过程中起关键作用。ATG16L1在HEK-293 T细胞中显示出阳性杂交信号，且在加氯喹抑制剂处理组中阳性信号的比例显著低于对照组（P < 0.05），表明自噬过程受到严重抑制。研究结果表明，自噬信号通路可以被抑制或激活，说明自噬过程受到严格控制。这些发现表明，自噬相关基因可能介导蛤对抗V. parahaemolyticus感染的能力，从而赋予其防御机制。

引言

巨自噬（以下简称“自噬”）是一种隔离和降解真核细胞质成分的机制。自噬是一个复杂的过程，通过溶酶体降解细胞内的功能障碍性成分（Shibutani等人，2015年）。面对内部压力或外部挑战（如细菌感染），细胞会激活这一基本的自我更新过程。这一机制的核心是形成一种独特的双膜囊泡，该囊泡选择性或非选择性吞噬细胞质目标（例如受损的蛋白质、功能失调的细胞器或入侵的病原体）。自噬相关基因（ATGs）在自噬过程中的作用不可忽视（Ohsumi，2014年）。对于自噬体的形成至关重要的是自噬相关基因16（ATG16），它是自噬机制中高度保守的核心组成部分（Burman和Ktistakis，2010年；Tanida，2011年）。ATG16在先天免疫（Oh和Lee，2013年）、炎症反应（Deretic等人，2013年）、抗病毒免疫反应（Kuballa等人，2012年）和抗菌免疫反应（Huang和Brumell，2014年；Jo等人，2021年）中发挥重要作用。ATG16L通过促进微管相关蛋白轻链3（LC3）的脂质修饰来介导早期自噬中的自噬体组装，并在免疫调节中具有平行功能（Skendros和Mitroulis，2012年；Xie和Zhou，2018年）。ATG5通过将ATG16L/ATG16招募到ATG12-ATG5复合体中，最终形成ATG16L复合体（Chang等人，2020年；Kuma等人，2002年；Mizushima等人，1999年）。

自噬几乎是所有真核细胞中的分解代谢过程。称为自噬体的双膜结构在细胞质中形成，可包含有损的细胞器、蛋白质和入侵的细菌。成熟的自噬体与溶酶体融合形成自溶体，其内容物被降解并转化为能量和营养物质。应激诱导的激活会促使形成双膜囊泡（自噬体），这些囊泡吞噬细胞质的随机部分，随后与溶酶体融合以降解被隔离的物质（Mizushima，2007年；Yang和Klionsky，2009年）。除了其经典的降解功能外，自噬还促进特定细胞质成分的选择性清除。主要目标包括受损的细胞器、不溶性蛋白质聚集体和细胞内病原体（Deretic等人，2013年；Komatsu和Ichimura，2010年；Ktistakis和Tooze，2016年；Paul和Münz，2016年；Sica等人，2015年）。自噬还调节多种哺乳动物的免疫过程，包括胸腺选择、抗原呈递、淋巴细胞稳态和炎症调节（Deretic等人，2015年；Frake等人，2015年；Jiang等人，2015年；Levine等人，2011年）。

Vibrio parahaemolyticus是一种嗜盐革兰氏阴性细菌，广泛存在于全球的海洋和河口环境中，是引起胃肠感染的原因（Wang等人，2017年）。致病细菌的爆发会对贝类养殖造成巨大危害，导致生产效率和经济价值的显著损失（Ji等人，2013年；Jia和Nie，2025年；Paillard等人，2004年；Passalacqua等人，2016年）。双壳类动物是滤食性生物，生活在富含潜在致病微生物的河口中，在进食过程中会浓缩这些微生物（He等人，2015年）。双壳类动物缺乏适应性免疫，依赖先天免疫系统进行防御（Jang等人，2018年）。因此，解析双壳类动物中由先天免疫介导的病原体清除机制，为理解无脊椎动物宿主防御策略的进化提供了关键框架。与无脊椎动物一样，双壳类动物完全依靠先天免疫来抵御病原体。自噬是一种进化上保守的细胞过程，通过降解细胞内入侵者和受损的细胞器来参与先天免疫反应。在马尼拉蛤（Ruditapes philippinarum中，血淋巴作为主要的免疫细胞，执行吞噬作用、包裹以及产生抗微生物肽和溶菌酶等体液因子。新兴证据表明，在细菌或病毒刺激下，血淋巴中的自噬会迅速被诱导，作为抵御感染的早期屏障（Fabrello等人，2021年；Li等人，2024年）。

本研究通过生物信息学方法鉴定了R. philippinarum中ATG16L1的氨基酸序列、结构和进化情况。进行了急性及慢性挑战实验，以检测V. parahaemolyticus感染下马尼拉蛤中自噬相关基因的表达情况。通过检测ATG16L1基因干扰或过表达mRNA或加氯喹后血淋巴中自噬相关基因的表达水平，分析了ATG16L1在R. philippinarum免疫系统中的作用。这项研究有助于进一步了解ATG16L1在R. philippinarum中的功能和免疫机制，并为揭示贝类自噬的分子机制提供参考。

部分摘录

实验动物

实验前，R. philippinarum在中国大连的受控实验室条件下，在富含氧气的海水中饲养，盐度维持在30 PSU，温度控制在21±0.4°C，每天更换水并补充Chlorella。选择壳长29±3.0 mm的R. philippinarum进行实验，实验前已提前复苏并扩增V. parahaemolyticus>

实验感染使用

ATG16L1的序列特征和物种进化分析

ATG16L1的CDS序列（xfSc0000114.28）包含1596个核苷酸和531个氨基酸（图1A）。BLASTp多重比较和氨基酸序列的系统发育分析显示，所有测试物种之间的ATG16L1序列具有高度同源性（图1B）。使用SWISS-MODEL软件，我们仔细比较了R. philippinarum和M. arenaria的ATG16L1蛋白的预测三级结构，发现两种物种的三级结构存在

讨论

ATG16L（一种ATG16同源物）包含一个AFIM结构域、一个卷曲螺旋（CC）结构域和七个WD40重复序列。它的AFIM/CC结构域与ATG12-ATG5复合体结合形成ATG16L复合体，而WD40结构域则介导复合体向自噬膜的招募（Schmid和Münz，2007年）。在C. elegans（ATG16.1/16.2）和哺乳动物（ATG16L1/L2）中存在两种ATG16同源物（Xiong等人，2019年）。这两种异构体在线虫自噬中发挥作用，但在哺乳动物中表现出功能差异（Ishibashi等人，

CRediT作者贡献声明

Jie Yu：撰写 – 审阅与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法学、研究设计、数据管理、概念构建。Hongtao Nie：撰写 – 审阅与编辑、监督、资源提供、项目管理、研究实施、资金获取、概念构建。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了辽宁振兴人才计划（XLYC2403165）、辽宁科技计划联合项目（自然科学基础项目）（2025-MSLH-121）、辽宁省教育厅科研项目（LJ212410158027）以及辽宁省本科生科研项目（2024JBZDZ003）的支持。本项目还得到了大连杰出青年科技人才基金（2024RJ014）的资助。