钩形结构的发育作为雄性Procambarus clarkii性成熟的非侵入性指标：内分泌学和分子层面的研究进展

《Aquacultural Engineering》：Hook development as a non-invasive indicator of sexual maturity in male Procambarus clarkii: Endocrine and molecular insights

　　

黑春宇|陶阳|胡瑞雪|陈楠|王江华|顾泽茂

华中农业大学水产学院/双水双录研究所，武汉430070，中国

摘要

准确识别Procambarus clarkii的性成熟度对于优化亲本选择和种子生产至关重要。然而，目前仍缺乏可靠的雄性成熟度外部指标。在这项研究中，我们通过形态学、组织学和分子分析，描述了第三和第四对胸足上钩子的发育过程，并探讨了它们与睾丸成熟度的关联。钩子的形成分为四个阶段：光滑期、凹陷期、点状期和钩状期。在光滑期，胸足表面光滑，睾丸中主要含有精原细胞。在凹陷期，内缘出现浅沟，同时初级精细胞数量增加。在点状期，沟缘上形成小锯齿状突起，睾丸中以次级精细胞和早期精母细胞为主。在钩状期，突起延伸并向基部弯曲，形成典型的钩子。此时睾丸充满成熟的精子，并首次观察到交配行为。基于四个阶段基因表达和激素水平建立的无向加权相关网络显示，IGFBP、IAG、CHH、Dmrt和Fem-1是与钩子发育相关的眼柄-雄激素腺-睾丸（EAT）轴的关键因子。CHH和IAG在光滑期和钩状期高表达，而Dmrt、Fem-1和IGFBP在点状期达到峰值，表明它们在钩子形成和睾丸成熟过程中具有协调的调节作用。总体而言，我们证明第三和第四对胸足上的钩子是P. clarkii雄性性成熟度的视觉和准确生物标志物。这一发现为非侵入性亲本选择提供了实践基础，并为十足目甲壳类的生殖调节提供了新的见解。

引言

红沼螯虾（Procambarus clarkii）原产于美国南部和墨西哥北部，由于其生长迅速、适应性强和繁殖力高，已成为最重要的淡水水产养殖物种之一（Liao等人，2024年）。2022年，全球产量达到约300万吨（《2024年世界渔业和水产养殖状况》，2024年），其中中国仅贡献了约280万吨，位居世界第一（Yue等人，2025年）。随着产业的不断扩张，对高质量苗种的需求也在增加。在中国，P. clarkii的苗种生产主要依赖于稻田和池塘中的自然繁殖。然而，这种做法常常导致亲本来源不稳定，个体间的生殖腺发育差异显著。这些差异导致产卵和孵化时间不同，最终导致苗种大小不一。这使得难以形成稳定且集中的高质量苗种供应，从而限制了产业的可持续发展。选择已经达到性成熟的亲本可以实现短时间内同步产卵，这对于提高苗种均匀性和养殖效率至关重要。因此，开发一种快速且非侵入性的方法来识别亲本的性成熟度对于P. clarkii的可持续水产养殖非常重要。

在甲壳类动物中，性成熟通常伴随着在性激素调节下出现的明显次级性特征（Farhadi等人，2021年）。这些特征可以作为评估亲本成熟度的快速且非侵入性指标（Scholtz，1994年）。在十足目甲壳类动物中，次级性特征通常出现在附肢上。例如，在雄性虾类如Litopenaeus vannamei（Chang等人，2024年）和Penaeus schmitti（de Moraes等人，2025年）中，第一对胸足的内肢在性成熟期间融合并硬化，这一特征被广泛用于成熟度评估。在如Orconectes propinquus（Stein，1976年）和Faxonius immunis（Scudamore，1948年）这样的螯虾中，第一对胸足发育成具有明显性别差异的特殊螯肢。雄性在繁殖季节的螯肢更长更宽（Yoshino等人，2011年），这有助于交配时的竞争和抓握（Snedden，1990年）。在P. clarkii中，雌性出现水泥腺与卵巢发育密切相关（Li等人，2024年）；当覆盖率达到45%时，雌性通常处于卵黄后期（Qin等人，2024年），这成为雌性成熟的可靠外部标志。然而，同样可靠的雄性成熟度外部指标仍缺乏。早期形态学观察到雄性第三和第四对胸足内缘上有类似钩子的结构，这与交配行为密切相关（Taketomi等人，1990年）。这些类似钩子的结构定义为位于第三和第四对胸足腹缘的坚硬、弯曲的角质突起。功能上，它们作为交配时的夹持结构，使雄性能够与雌性胸足相互锁定并稳定交配位置。这些特征突显了它们作为P. clarkii>雄性性成熟度次级性特征的潜力。

十足目甲壳类动物中睾丸和次级性特征的发育主要受眼柄-雄激素腺-睾丸（EAT）轴的调节。在这个轴中，由雄激素腺分泌的类似胰岛素的雄激素腺激素（IAG）在决定雄性性分化模式和维持雄性次级性特征方面起着核心作用（Levy和Sagi，2020年；Wang等人，2024年）。抑制或去除雄激素腺会导致雄性特征退化，而外源性IAG的施用或过表达则可在雌性中诱导类似雄性的特征（Sun和Li，2021年）。上游调节因子，如甲壳类高血糖激素（CHH），包括甲壳类高血糖激素亚型1（CHH1）和亚型2（CHH2），它们是甲壳类中发现的CHH家族的不同转录变体（Kung等人，2013年），以及Doublesex和Mab-3相关转录因子（Dmrt

因此，本研究的目的是：1）识别P. clarkii雄性的次级性特征并确定其发育阶段；2）评估这些特征作为性成熟度非侵入性指标的可靠性；3）描述EAT轴调节因子在钩子和睾丸发育过程中的协同表达模式。结果为开发P. clarkii雄性非侵入性成熟度评估系统提供了理论基础，并为甲壳类动物的性特征发育和分子调控提供了新的见解。

章节摘要

实验动物和管理

实验在中国武汉市蔡甸区的华中农业大学P. clarkii养殖中心进行（30°32′20.1″N，114°04′55.6″E）。2024年4月10日，将50公斤P. clarkii苗种（每只约3克）投入中心的一个0.2公顷的池塘中。实验期间采用了常规的池塘管理措施。P. clarkii每天喂食含有32%蛋白质的商业饲料；喂食量为估计生物量的5%。

每隔七天

第三和第四对胸足上钩子的发育阶段和特征

在监测期间，P. clarkii雄性的体长、螯肢长度和体重持续增加（图3），其体色逐渐从绿色变为红色。从4月到5月中旬，雄性和雌性的外部形态相似，除了初级生殖结构外，未观察到明显的次级性特征。5月底，第三和第四对胸足的内缘出现了明显的形态变化（图S3）。

讨论

准确识别P. clarkii的次级性特征可以实现非侵入性选择成熟的亲本，这对于同步交配和集中产卵至关重要。这些优势直接提高了苗种的均匀性和养殖效率。目前，雌性尾肢上的白色斑块，当覆盖率达到45%时，是卵巢成熟的可靠指标（Li等人，2024年；Qin等人，2024年）。然而，长期缺乏相应的雄性外部标志物。

结论

在这项研究中，我们描述了第三和第四对胸足上钩子形成的完整过程，并证明钩子是性成熟的可见且准确的外部指标。通过整合关键EAT轴因子的表达模式，我们构建了一个与钩子发育相关的无向加权网络，并确定IGFBP、IAG、CHH、Fem-1和Dmrt是与钩子形成和睾丸发育密切相关的核心节点（图10）。这些发现为

CRediT作者贡献声明

黑春宇：撰写 – 原稿、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。陶阳：调查、数据管理。胡瑞雪：资金获取、项目管理、撰写 – 审稿与编辑。陈楠：撰写 – 审稿与编辑、监督。王江华：撰写 – 审稿与编辑、监督。顾泽茂：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。

利益冲突声明

致谢

湖北省科技创新人才计划（2025DJB021）、湖北省科技创新计划（2025BBA005）、支持湖北省高质量种子产业发展的资助项目（HBZY2023B009）、湖北省农业科技创新中心（2025-621-000-001-029）以及湖北省农业研究系统的专项基金（2023HBSTX4-05）的支持。