一种源自肠道的芽孢杆菌对新热带地区白蚁存活和进食的剂量依赖性影响 玛丽亚·拉塞达（Maria Lacerda）、德里克·利拉（Derick Lira）、阿尔贝托·阿拉布（Alberto Arab）、马里奥·赫拉克拉诺·德·奥利维拉（Mário Herculano de Oliveira）、莉齐安妮·玛丽亚·德·利马（Liziane Maria de Lima）、埃里卡·兰贝斯（érica Lambais）和玛丽亚·阿瓦尼·贝泽拉-古斯芒（Maria Avany Bezerra-Gusm?o）

《Diversity》：Dose-Dependent Effects of a Gut-Derived Bacillus on Survival and Feeding in a Neotropical Termite Maria Lacerda, Derick Lira, Alberto Arab, Mário Herculano de Oliveira, Liziane Maria de Lima, érica Lambais and Maria Avany Bezerra-Gusm?o

　　摘要
白蚁的生态成功与其与肠道微生物群落的关联密切相关，但这些相互作用也可能带来潜在的适应性代价。肠道相关细菌对宿主表现的影响仍然知之甚少。在本研究中，我们实验性地评估了一种来源于肠道的芽孢杆菌（Bacillus sp.）分离株对白蚁Constrictotermes cyphergaster（Silvestri, 1901）（Termitidae: Nasutitermitinae）工蚁存活率和取食行为的影响，并以机会性病原体铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为对照处理。工蚁暴露于逐渐增加的细菌剂量下，生存分析显示两种细菌均引起了显著的剂量依赖性存活率下降。然而，与对照组相比，该芽孢杆菌分离株导致的总体存活率下降更为明显，而铜绿假单胞菌虽然也降低了存活率，但其效果相对较弱。取食活动与细菌剂量无关，但暴露于芽孢杆菌分离株显著减少了食物消耗量，而铜绿假单胞菌未观察到这种现象。这些结果表明，在实验条件下，肠道来源的细菌可能对宿主的存活率和取食行为产生负面影响，这突显了考虑宿主相关微生物的有益和潜在有害效应的重要性。

1. 引言
宿主相关的微生物群落在塑造宿主适应性方面起着核心作用，这一观点通常在整体共生体（holobiont）概念框架内得到阐述[1,2,3]。这些关联涵盖了从互惠共生到寄生等多种相互作用形式，其结果取决于微生物群的组成和功能稳定性[4,5,6]。微生物可以提供必要的代谢功能，并在资源有限的环境中促进宿主的表现[7,8,9]。然而，这些相互作用并不一定是积极的：在某些条件下，宿主相关的微生物可能会带来生理代价或成为机会性病原体[10,11,12,13]。
白蚁（Blattaria: Isoptera）因其生态成功与其复杂的肠道微生物群落密切相关而被广泛认为是研究宿主-微生物相互作用的模型系统[14,15,16,17]。在白蚁科中，微生物群已经共同进化，以优化宿主的代谢效率并促进生态位的扩展[18,19,20]。然而，白蚁群体拥挤且基因 homogenous 的环境也增加了对病原体爆发的易感性[21,22,23]。作为回应，白蚁演化出了多层防御机制，包括个体免疫反应和常被称为社会免疫的集体行为[24,25,26,27]。这些机制有助于调节微生物暴露并减少外部病原体和机会性微生物的影响。

芽孢杆菌科（Bacillaceae）的成员，特别是芽孢杆菌属（Bacillus）的菌株，在白蚁肠道中频繁被检测到，并表现出广泛的生态作用。虽然一些菌株是公认的昆虫病原体[28,29,30]，但也有报道指出某些菌株与白蚁存在关联，却没有明确的致病证据[31,32,33,34]。这种功能多样性引发了关于不同芽孢杆菌菌株如何与宿主相互作用以及它们在何种条件下可能影响宿主适应性的问题。在新热带半干旱环境中，白蚁Constrictotermes cyphergaster（Silvestri, 1901）（Termitidae: Nasutitermitinae）在木材分解和养分循环中起着关键作用[35,36]，并且拥有适应Caatinga生物群季节性限制的特化微生物群[37]。尽管在C. cyphergaster的肠道中发现了芽孢杆菌菌株[38]，但它们对宿主存活率和行为的影响仍不为人所熟知。解决这一空白需要通过实验方法来比较肠道来源的细菌与已知机会性病原体的影响。
本研究的主要目的是评估细菌来源和接种剂量如何影响白蚁的存活率和取食行为。为此，我们比较了C. cyphergaster工蚁对一种来源于肠道的芽孢杆菌分离株和外来病原体铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在不同接种剂量下的反应。我们假设细菌来源会调节宿主反应，从而导致不同剂量水平下的存活率和取食行为差异。通过将白蚁暴露于受控的细菌接种中，我们在标准化条件下评估了肠道来源和外来细菌对宿主适应性的影响。

2. 材料与方法
2.1. 研究区域和白蚁采样
C. cyphergaster的工蚁来自位于巴西东北部帕拉伊巴州S?o Jo?o do Cariri实验站（7°20′34″ S, 36°31′50″ W）的五个活跃群体。这些群体专门用于肠道解剖和细菌分离程序。巢穴被小心地从宿主树上取出并密封在塑料袋中运送到实验室。下文描述的所有后续程序都在无菌条件下进行，以尽量减少污染。

2.2. 肠道相关细菌的分离与培养
为了分离可培养的肠道相关细菌，在无菌条件下使用无菌生理盐水溶液（0.9% NaCl）在立体显微镜下解剖了来自每个采样群体（n = 250）的50只工蚁的消化道，并将样本汇集到无菌微管中。每个群体的肠道样本分别在解剖、匀浆和系列稀释步骤中进行处理。对于每个群体，将解剖出的肠道在90 mL的无菌蒸馏水中匀浆，然后按照Lacerda等人的方案[39]在9.0 mL的0.9%盐水溶液中进行系列稀释。从10^-4到10^-8的稀释液中取100 μL的量用Drigalski环涂布在营养琼脂板上，并在37 °C下培养24-48小时。一旦获得可培养的细菌菌落，就将其集中起来进行后续鉴定和实验测定，而不系统地追踪其来源群体。
细菌细胞浓度通过两种互补的方法进行估计。首先，直接从琼脂板上计数菌落形成单位（CFU）。其次，将每个稀释液中的10 μL样品加载到Neubauer计数室中，并在光学显微镜下计数细胞[40]。这两种方法都用于确保细菌密度的准确估计。分离的菌落被保存在20%甘油储备溶液中，并在-20 °C下储存，以备进一步的致病性测定使用。无菌操作通过标准无菌技术维持，包括使用无菌材料和层流条件。包括了阴性对照（无菌培养基和未接种细菌的滤纸）以检测潜在污染。细菌培养物从新鲜样本制备，并在应用前根据可见生长和预期的菌落形态确认菌落的活力。

2.3. 细菌分离株的分子鉴定
细菌的分类鉴定基于16S rRNA基因测序。使用Doyle和Doyle的CTAB方法[41]从培养的细菌分离株中提取基因组DNA。使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1389R（5′-ACGGGCGGTGTGTACAAG-3′）扩增16S rRNA基因。PCR反应在最终体积为25 μL的溶液中进行，其中包含20 ng的基因组DNA、1 U的Taq DNA聚合酶（Ludwig Biotechnology Ltda, Alvorada, RS, Brazil）、10 μmol的每种引物、1× PCR缓冲液和10 mM的每种dNTP。热循环条件包括初始变性95 °C 3分钟，然后是30个循环的95 °C 1分钟变性、55 °C 2分钟退火和72 °C 2分钟延伸，最后在72 °C下延伸10分钟。
PCR产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳可视化，随后使用ABI PRISM 3130遗传分析仪（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）在巴西萨尔瓦多CpqGM/Fiocruz的测序设施中进行测序。基于Sanger测序获得的16S rRNA基因的部分序列进行系统发育分析。正向和反向读段被组装成共识序列，在分析前排除了低质量读段和短片段。为了提供分类学背景，从NCBI GenBank数据库中检索了Bacillus cereus和Bacillus thuringiensis的代表性16S rRNA序列，并仅保留了500至2000 bp之间的序列。使用R中的DECIPHER包[42]对序列进行了对齐[43]。系统发育关系使用phangorn包[44]中的最大似然法推断。选择了最佳拟合的替换模型（GTR），并使用最近邻交换法优化树拓扑结构。节点支持度通过1000次自助法复制进行评估。结果树以中点根表示，仅显示自助值≥70%的节点。我们注意到，16S rRNA基因测序可能无法充分区分芽孢杆菌属内密切相关的物种。因此，分类学归属应在属或种复合体水平上解释。

2.4. 实验生物测定
使用来自四个独立群体的成年工蚁评估细菌暴露对白蚁存活率的影响，这些群体与用于细菌分离的群体不同。对于每个群体，随机选择工蚁并转移到含有浸有300 μL细菌悬液的过滤纸盘的无菌Petri皿（直径5.5厘米×高度1.5厘米）中，细菌浓度分别为10^4、10^5、10^6、10^7和10^8 CFU/mL。每个浓度测试四个重复样本，每个重复样本包含一个含有40只个体的Petri皿。这样每个群体共有800只个体（5个浓度×4个重复×40只个体）。白蚁被允许自由行走并吃掉浸有细菌的过滤纸，并在控制条件下（25 ± 2 °C, 70%相对湿度）以及自然光-黑暗条件下维持。阴性对照处理仅使用无菌蒸馏水湿润的过滤纸盘。
作为阳性对照，按照与芽孢杆菌相同的实验方案和浓度范围应用了昆虫病原体铜绿假单胞菌（Pseudomonadota）[45,46]的悬浮液。铜绿假单胞菌菌落来自巴西Campina Grande的INSA国家半干旱研究所环境微生物学实验室。重要的是，没有从C. cyphergaster的肠道中分离出铜绿假单胞菌，因此它被用作参考处理，以评估由非驻留细菌引起的感染死亡率基准。
白蚁的存活率连续七天每天监测，大约80%的群体在此期间死亡。当个体静止超过1分钟且对物理刺激无反应时，即视为死亡。移除死亡的白蚁以防止二次污染[47]。

2.5. 取食活动的评估
为了评估细菌暴露是否影响取食行为，通过分析过滤纸的消耗量来量化食欲减少的情况，这通常与微生物感染相关。使用ImageJ（版本1.8.0）分析生物测定中的过滤纸。使用“已知距离”= 10和“长度单位”=毫米的“设置比例”工具进行校准。然后使用分割技术确定C. cyphergaster个体所占的总面积和消耗面积的比例。消耗率计算为消耗面积与过滤纸初始总面积的比率。

2.6. 统计分析
使用假设Weibull分布的参数生存模型分析细菌处理对白蚁存活率的影响，使用R版本4.4.0中的survreg函数进行拟合[43]。通过使用drop1函数实现的似然比测试（LRTs）比较完整模型和简化模型的整体处理效果。采用α = 0.05的显著性水平。使用Dunnett的测试和emmeans包[48]进行与对照的成对比较。
对于每种细菌处理，分别通过拟合参数Weibull生存模型来评估剂量-反应关系，将剂量作为连续预测变量（log10[剂量 + 1]），并将对照组（剂量 = 0）包括在分析中。包括群体身份作为聚类变量，以解释同一群体中个体的非独立性。使用似然比测试（LRTs）评估剂量效应的显著性。
食物消耗数据使用带有Gamma误差分布和对数链接函数的广义线性模型（GLMs）进行分析。分别针对每种细菌处理（Bacillus sp.和P. aeruginosa）评估剂量-反应关系，将剂量作为连续预测变量（log10[剂量 + 1]）。在另一个模型中包括治疗组作为分类预测变量，评估处理效应的显著性。所有分析均在R版本4.4.0[43]中进行。

3. 结果
3.1. 芽孢杆菌分离株的系统发育特征和选择
从C. cyphergaster的肠道中共回收了10株芽孢杆菌（GenBank登录号OQ615298–OQ615307；见图S1）。系统发育分析显示了两个不同的分支：一个包含与Bacillus thuringiensis和B. cereus群体密切相关的分离株，另一个与B. velezensis和B. megaterium聚类（图S1）。基于其高的生物量生产力和与B. thuringiensis组成员的系统发育接近度（16S rRNA基因序列相似度为98.5%），选择了9631B03菌株进行后续的所有实验生物测定。该菌株主要属于B. cereus组（图S1），尽管没有观察到B. cereus和B. thuringiensis之间的明显分化。3.2. 桔孢杆菌对工蚁存活率的影响处理显著影响了C. cyphergaster工蚁的存活率（LRT = 10.29；df = 2；p = 0.0058）（图1）。这种效应主要由接触肠道来源的桔孢杆菌9631B03引起，与对照组相比，工蚁的存活率显著降低。作为阳性对照的铜绿假单胞菌也显示出与对照组相比存活率的统计学显著降低。使用Dunnett检验进行的事后比较证实了这些模式，结果显示在桔孢杆菌处理下平均存活时间显著减少（比率 = 0.86；df = 96；t = ?3.97；p < 0.001）。同样，铜绿假单胞菌相对于对照组也显示出存活率的统计学显著降低（比率 = 0.894；SE = 0.0438；df = 96；t = ?2.29；p = 0.0459）。图1. Constrictotermes cyphergaster（白蚁科：鼻白蚁亚科）在不同细菌处理后随时间的存活概率。实线代表根据Weibull参数模型预测的存活概率，而虚线梯形线表示使用Kaplan–Meier方法计算的观察到的存活概率。蓝色：对照组；红色：桔孢杆菌；绿色：铜绿假单胞菌。剂量-反应分析表明，两种病原体的接种剂量都显著影响了白蚁的存活率。对于桔孢杆菌，剂量-反应模型显示出剂量对存活率的显著影响（LRT = 7.92；df = 1；p = 0.004）（图2）。同样，对于铜绿假单胞菌，也观察到随剂量增加的存活率显著下降（LRT = 10.2；df = 1；p = 0.001）（图3）。图2. 在不同浓度的桔孢杆菌（10^4–10^8）处理下，与对照组相比的宿主存活概率随时间的变化。存活曲线显示了强烈的剂量依赖性效应。时间以小时为单位。图3. 在不同浓度的铜绿假单胞菌（10^4–10^8）处理下，与对照组相比的宿主存活概率随时间的变化。曲线代表拟合的存活函数，显示出随剂量增加的存活率下降。时间以小时为单位。3.3. 食物消耗行为和病态反应在两种处理中，食物消耗量与细菌剂量无关（桔孢杆菌：β = ?0.043 ± 0.051，t = ?0.854，df = 58，p = 0.397；铜绿假单胞菌：β = 0.032 ± 0.096，t = 0.329，df = 18，p = 0.746）。然而，不同处理之间的食物消耗量存在差异，接触桔孢杆菌的个体消耗量显著低于对照组（Tukey检验，比率 = 0.599，df = 97，p = 0.0014），而铜绿假单胞菌与任一组之间没有差异（图4）。图4. Constrictotermes cyphergaster工蚁在不同细菌处理下的纸盘消耗量。彩色点代表个体重复实验（随机波动），黑色点和误差条表示基于广义线性模型（GLM）得出的调整后平均值和95%置信区间。与对照组（灰色）相比，接触桔孢杆菌的个体（红色）的食物消耗量显著减少，而接触铜绿假单胞菌（绿色）的个体在进食行为上没有显著差异。4. 讨论了解肠道相关微生物如何影响宿主的适应性是阐明共生系统生态和进化动态的关键。在这项研究中，我们调查了白蚁C. cyphergaster与一种肠道来源的桔孢杆菌菌株之间的相互作用，并将其效果与机会性病原体铜绿假单胞菌进行了比较。我们的结果显示，两种细菌处理后宿主存活率均显著下降，较高的接种密度导致寿命缩短。然而，桔孢杆菌引起的存活率下降幅度大于铜绿假单胞菌，并且还伴随着进食活动的减少。这些发现表明，来自白蚁肠道环境的细菌可能对宿主的存活率和行为产生负面影响。这种效应突显了宿主与其相关微生物之间可能存在多种相互作用，某些情况下可能会导致不利结果。4.1. 肠道来源桔孢杆菌的致病潜力肠道来源的桔孢杆菌引起的显著死亡率表明，与白蚁肠道环境相关的细菌在实验条件下可能表现出致病效应[49,50,51,52]。尽管该菌株与B. thuringiensis组的16S rRNA基因序列相似度为98.5%，但由于该标记物的分辨率有限，其精确的分类身份仍不确定。此外，我们无法确定它是一个稳定的微生物群成员还是一个暂时的或机会性生物。因此，我们的结果表明，肠道来源的细菌在某些条件下可能对宿主存活产生负面影响，这强调了在考虑宿主相关微生物群落中的有益和有害相互作用时的重要性。在这里，桔孢杆菌引起的更强死亡率与外源性的铜绿假单胞菌相比，突显了这两种细菌与宿主相互作用的差异[53,54,55,56]。然而，这种模式背后的机制尚不清楚。观察到的效应可能不是由于特定的适应性以克服宿主防御机制，而是由于细菌生理、毒素产生或在实验条件下的生长动态的差异[57,58,59]。4.2. 剂量依赖性和毒力策略两种菌株都遵循经典的剂量-反应关系，即较高的接种密度导致宿主寿命显著缩短[60,61]。然而，C. cyphergaster对桔孢杆菌的敏感性高于铜绿假单胞菌，表现为随剂量增加导致的存活率下降更为明显[62,63]。这种模式可能反映了微生物毒素与宿主生理脆弱性之间的高度兼容性，导致随着剂量增加而产生更强的致病效应[64,65,66]。相反，铜绿假单胞菌影响的减弱表明其感染机制不同。作为一种机会性环境病原体，铜绿假单胞菌可能依赖于群体感应介导的毒力或代谢竞争，这需要达到临界密度才能克服宿主防御[67,68,69]。然而，类似的剂量依赖性机制也可能适用于桔孢杆菌，但我们的数据无法区分这两种可能性。这强调了白蚁与病原体之间的进化军备竞赛[70,71,72,73]，其中宿主已经发展出有效的屏障，当病原体达到较高密度时这些屏障会被突破[26,74,75]。4.3. 行为障碍和生理崩溃接触桔孢杆菌的个体食物消耗量的减少进一步表明这种细菌影响了宿主的进食行为。在昆虫-病原体相互作用中，进食减少是一个常见的反应，可能由多种因素引起，包括生理压力、免疫激活、肠道损伤或避免受污染的食物[76,77,78,79,80]。在我们的研究中，仅在桔孢杆菌处理中观察到进食减少，而尽管铜绿假单胞菌也导致了剂量依赖性的死亡率，但它没有产生类似的效应。已知桔孢杆菌属细菌会导致昆虫肠道损伤，从而减少进食[81,82,83]，但我们在本研究中并未直接评估组织水平的效应。因此，虽然观察到的行为变化与感染相关压力一致，但应谨慎解读，不应将其归因于特定机制。5. 结论总体而言，我们的发现表明，从白蚁肠道中分离出的细菌可能对宿主的存活率和进食产生负面影响，其效果与外源性机会性病原体观察到的效果相当。不同细菌处理之间存在差异，肠道来源的桔孢杆菌对存活率的总体影响更大，并减少了进食活动。重要的是，这些效应是剂量依赖性的，随着细菌浓度的增加，存活率降低，这突显了接种量在塑造宿主反应中的作用。观察到的死亡率和进食减少表明，宿主相关的细菌可能以多种方式影响白蚁的存活。这些结果并不支持严格保护性的观点，而是强调了此类相互作用可能产生的多样化结果，包括在某些情况下的负面影响。尽管这些发现的更广泛的生态相关性仍有待确定，但我们的研究强调了在考虑共生系统中宿主相关微生物的有益和潜在有害作用的重要性。补充材料以下支持信息可下载自：https://www.mdpi.com/article/10.3390/d18050281/s1，图S1：根据从Constrictotermes cyphergaster肠道中回收的桔孢杆菌分离株的部分16S rRNA基因序列以及从GenBank中检索的Bacillus cereus和B. thuringiensis参考序列推断出的最大似然系统发育树。用于后续生物测定的重点菌株（10*）被高亮显示，并属于广义上的Bacillus cereus组。节点处的数字表示Bootstrap支持值（1000次重复；值≥70%显示）。该树的根位于中间。