利用广谱气相色谱- Orbitrap技术对高污染沉积物和鸥鸟卵中的有机污染物进行全面分析

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Comprehensive characterisation of organic pollutants in high-polluted sediments and gull eggs using a broad-scope gas chromatography–Orbitrap methodology

　　**摘要**

受历史上六氯苯（HCB）、多氯联苯（PCBs）、二氯二苯三氯乙烯（DDTs）和多环芳烃（PAHs）排放影响的污染沉积物，由于其生物累积性和毒性特性，对野生动物构成了风险。本文提出了一种基于气相色谱-轨道阱高分辨率质谱（GC–Orbitrap–HRMS）的分析方法，用于检测Flix氯碱厂污染热点区域沉积物中的多种污染物，并利用奥杜因鸥（Larus audouinii）的蛋作为生物监测器，评估这些污染物对埃布罗河三角洲自然公园内鸟类的影响。通过优化目标化合物与可疑化合物的联合分析方法，实现了以下目标：（i）对45种目标持久性有机污染物（POPs）和PAHs进行定量分析，并评估包括回收率、重复性、灵敏度、选择性和不确定性测量在内的质量参数；（ii）利用高分辨率NIST库数据库进行可疑化合物筛查，以识别额外的污染物。研究发现不同基质中的化合物分布存在差异。在沉积物中，4,4′-DDT是检测到的主要化合物，其最大浓度达到49,386 ng g?1干重（dw），而PCB同系物的浓度范围为0.06至1376 ng g?1 dw。在鸥蛋中，检测到4,4′-二氯二苯二氯乙烯（4,4′-DDE）的浓度为1426至3473 ng g?1 dw，PCB浓度范围为0.40至2190 ng g?1 dw。可疑化合物筛查在沉积物中发现了88种污染物（其中73种为PCBs），在鸥蛋中发现了43种化合物（其中33种为PCBs）。此外还检测到了增塑剂、工业化学品和农药等额外污染物。这项工作展示了在污染热点区域进行全面污染物表征的重要性，有助于我们更好地了解这些污染物对自然生态系统中野生动物的潜在影响。

**引言**

对环境样本中持久性有机污染物（POPs）的全面表征对于理解其分布、迁移途径和潜在影响至关重要。POPs是一类复杂的有机卤化化合物，包括多氯联苯（PCBs）、有机氯农药（OCPs）、溶剂和阻燃剂等。利用气相色谱（GC）与质谱（MS）或串联质谱（MS）结合的多残留物分析技术可以对其进行分析。然而，高分辨率质谱（HRMS）的出现通过可疑化合物筛查（SSA）和非目标分析（NTA）显著扩展了化合物表征的能力[1,2,3]。这些方法依赖于精确的质量测量，以提高已知和新兴污染物的识别率[4]。GC–Orbitrap质谱提供了稳健且可重复的测量结果，分辨率为60,000至280,000全宽半最大值（FWHM，m/z 200），质量精度可达到5 ppm以下，在某些情况下甚至低于1 ppm[5,6,7]。其优势包括：（a）单次分析能覆盖更多化合物；（b）能够对缺乏参考标准的化合物进行追溯数据分析；（c）数据采集流程更加简化[8]。此外，使用广泛的高分辨率质谱电子电离（EI）光谱库（如美国国家标准与技术研究院（NIST）的数据库）可实现精确的质量光谱匹配，大大扩展了化合物识别的范围[9, 10]。文献中报道，化学特征可以在不同的置信水平上进行确认[11, 12]。

我们的研究区域位于埃布罗河下游的Flix水库（西班牙加泰罗尼亚南部）。该地区是一个著名的污染热点，对埃布罗河三角洲产生了影响，这里是主要的水稻种植区，也是300多种鸟类的重要繁殖地[13, 14]。自20世纪初以来，这里就有一家氯碱厂在运营，历史上一直向Flix水库排放有毒废物，带来了环境风险[15]。1945年至1971年间，该工厂生产了约35,000吨二氯二苯三氯乙烯（DDT），1959年至1987年间，它是西班牙唯一的PCBs制造商，总共生产了29,000吨此类化合物[17]。1948年修建的大坝导致工业废物在工厂正前方的河床中积聚[18]。这些受污染的沉积物中含有大量的OCPs和PCBs，以及五氯苯（PeCB）、六氯苯（HCB）、多氯萘和多氯乙烯等有机氯化合物的副产品。此外还含有重金属，如镉、砷、铜、铬、硒、铅（包括放射性210Pb）和汞[19]。2010–2011年启动了一项大规模净化项目，将工厂附近的河床沉积物封存在不锈钢板内，形成了一个人工坝[20]。2013–2015年间实施了初步的沉积物修复计划，挖掘并清除了9公顷范围内的约100,000吨受污染物质[21]。2006年对Flix大坝沉积物的分析显示，其中含有高浓度的主要污染物，包括HCB（1900 ng g?1）、PCBs（39,000 ng g?1）以及所有类型的4,4′-和4,4′-二氯二苯乙烯（DDEs）、二氯二苯三氯乙烯（DDDs）和DDTs（1300 ng g?1）[19]。2021–2024年间，五台配备蒸汽提取系统的设备被用于从沉积物和地下水中去除数吨有机氯污染物[23]。多年来，清洗过程和疏浚活动将POPs重新释放到下游的埃布罗河流域及其三角洲，对多种物种产生了影响，例如紫鹭（Ardea purpurea）[24]、奥杜因鸥和黄脚鸥（Larus audouinii和Larus michahellis）[25, 26]、火烈鸟（Phoenicopterus roseus）[27]和鲶鱼（Silurus glanis）[16, 28]。然而，对于这些沉积物中多种污染物的广泛存在及其对鸟类种群的影响了解甚少。本研究的具体目标有两个：（1）开发一种结合目标化合物筛查的方法，全面识别和表征Flix水库沉积物中的多种POPs和其他污染物；（2）利用受保护物种奥杜因鸥（Larus audouinii）的蛋作为环境污染的生物指示器，确定这些污染物的积累情况。所采用的方法包括：（i）校准、评估目标POPs和多环芳烃（PAHs）分析的选择性、灵敏度和定量性能；（ii）使用添加了污染物的沉积物和鸡蛋作为质量控制基质（QCMs），评估固液萃取效率和方法不确定性；（iii）开发可疑化合物筛查流程，以扩大分析范围并识别高污染沉积物和鸥蛋中的额外污染模式。该方法具有检测数百种污染物的潜力，为更好地了解埃布罗河下游Flix污染热点的影响提供了关键信息。

**材料与方法**

**化学品和试剂**

用于建立GC–EI–Orbitrap–HRMS方法的目标化合物包括45种POPs，其中23种OCPs来自AccuStandard（美国康涅狄格州纽黑文），8种PCB同系物来自Dr. Ehrenstorfer（德国奥格斯堡），14种PAHs来自Sigma-Aldrich（德国达姆施塔特和美国密苏里州圣路易斯）。内标包括从Cambridge Isotope Laboratories, Inc.（美国马萨诸塞州安多弗）购买的13C6–HCB和13C12–4,4′–DDE，以及从Dr. Ehrenstorfer（德国奥格斯堡）购买的PCB 65和PCB 209，还有从Sigma-Aldrich（德国达姆施塔特和美国密苏里州圣路易斯）购买的2H10-莰、2H10-菲喃、2H12-蒽和2H12-苝。Native标准品和内标的组成参见补充信息（SI）中的Text S1。用于残留分析的n-己烷（Hex）、二氯甲烷（DCM）和异辛烷（ISO）来自Merck（德国达姆施塔特）。

**样品采集与制备**

图1展示了采样区域的位置，分别在欧洲（图1A）和西班牙东北部的加泰罗尼亚地区（图1B）。2011年在Flix水库（41° 13′ N, 00° 33′ E）采集了五种沉积物样本，此时氯碱厂前的围护墙已经安装完成。图1C展示了人工坝的位置以及沉积物采样点（Flix 1和Flix 2位于水力屏障内，Flix 3、4和5位于屏障外，距离上游逐渐增加）。图1D显示了奥杜因鸥繁殖群落在埃布罗河三角洲自然公园（加泰罗尼亚南部40° 37′ N, 00° 35′ E）Punta de la Banya的位置。2012年和2019年繁殖季节开始时共采集了12枚新鲜蛋。每年准备并分析了两个各有六枚蛋的混合样本。

**图1** 的替代文本可能是使用人工智能生成的。

**样品制备过程** 包括称量0.5克冻干沉积物（筛选粒径为125 μm）和1克冻干蛋。每种基质放入50毫升玻璃离心管中，并加入50 ng的内标混合物。萃取过程使用30毫升n-己烷：DCM（1:1, v/v）溶液，交替进行1分钟涡旋和10分钟超声处理，重复三次[26]。后将上清液在3000 rpm下离心10分钟，收集后用TurboVap? LV浓缩蒸发工作站（Biotage, 瑞典乌普萨拉）在温和的N2气流下蒸发至1毫升。使用Phenomenex（美国加州托伦斯）提供的Strata–Florisil卡盒（10克，60毫克粒径，80埃孔径）进行净化，先加入10毫升n-己烷进行预处理，再用30毫升n-己烷：DCM（1:1, v/v）洗脱分析物。纯化后的提取物用TurboVap?浓缩至接近干态，使用2毫升异辛烷作为保护剂。最终提取物转移到琥珀色2毫升小瓶中，储存于-21°C备用。测定每个鸥蛋的水分含量，平均值为78.2%。沉积物和蛋的浓度以ng g?1干重（dw）表示，以便进行比较。

**GC–EI–全扫描HRMS分析**

仪器分析方法参考Oró-Nolla等人（2024）[29]。沉积物和鸥蛋样品使用TRACE 130 GC与Hybrid Quadrupole-Orbitrap?质谱仪（Thermo Fisher Scientific, 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行GC–HRMS分析。样品组分的色谱分离采用Phenomenex（加州托伦斯）提供的ZB-5MS熔融石英毛细管柱（长度60米，内径0.25毫米，膜厚度0.25 μm）。选择了一根60米长的色谱柱，以确保良好的色谱分离效果，并能够进行非目标化合物的筛选，考虑到分析样品中可能含有大量的多氯联苯（PCBs）。烤箱程序设定为70°C（保持3分钟），然后以12°C每分钟的速率升温至200°C，再以6°C每分钟的速率升温至315°C（保持15分钟）。分析时间为45分钟。Orbitrap质谱仪在70 eV的电子激发（EI）模式下运行。数据采集采用全扫描模式，质量范围为m/z 70–1000，分辨率设定为60,000（在全质量范围的一半最大宽度，即m/z 200时）。使用全氟三丁基胺（PFTBA，CAS 311–89–7）溶液进行仪器调试和质量校准，质量精度优于0.5 ppm。仪器控制和数据采集使用Xcalibur? 4.1版本（Thermo Fisher Scientific）完成。序列编程和数据处理则通过Tune 2.6和Trace Finder 4.1软件包（Thermo Fisher Scientific）进行。GC–EI–Orbitrap–HRMS光谱与NIST 23 Mass Spectral Library & Search软件中的高分辨率EI光谱进行比对，该软件包含了大约347,100种独特化合物的光谱数据。

**质量控制分析与验证：**
为了进行定量分析，准备了一组包含所有目标化合物（OCPs、PCBs和PAHs）的校准溶液，这些化合物的浓度范围为20至500 ng/mL，以及内标化合物，浓度为100 ng/mL，所有溶液均溶解在异辛烷中。表S1列出了用于内标定量的标准物质。通过连续在同一天（n=5次）和三天内（n=3天×5次重复实验）注入40 ng/mL的标准溶液混合物，评估了仪器的重复性和再现性。仪器检测限（IDLs）是根据3的信噪比（S/N ratio）估算的。质量控制和分析的可靠性是通过分析来自比利牛斯山脉（加泰罗尼亚北部）一条原始河流的沉积物和冻干后鸡蛋的结果来评估的，这两种材料均被用作质量控制材料（QCM）。这两种样品分别添加了50 ng/g干重的污染物质进行方法验证。方法检测限（MDLs）也是基于这两份QCM样品的分析结果，通过3的信噪比计算得出的。在每次提取过程中，都会分析程序空白样品，以评估背景水平对测量结果的影响。此外，还分析了空白样品（一个来自山间河流的清洁沉积物样本和一个鸡蛋样本），以评估基质成分可能的干扰。所有空白样品均添加了50 ng的内标物质，并使用所提出的方法进行分析。

**方法不确定度的计算：**
针对持久性有机污染物（POPs）和多氯联苯（PAHs）的方法不确定性是通过在重复性条件下分析QCM样品来计算的（n=5次）。欧盟SANTE 11312/2021指南被用作测量不确定性估算的参考标准[30]。扩展不确定性（\(U'\)）是使用覆盖因子k=2估算的，其中包括偏差（\(({u'}_b)\)）和精确度（\(({u'}_s)\)）的不确定性分量。与这些参数相关的测量和计算细节已在之前的研究中报告[29]。

**识别标准与可疑化合物筛选方法：**
目标化合物及其他潜在化学物质的识别依据以下标准进行：
(i) 在全扫描光谱中识别分子离子或基峰（每种化合物特有的），质量容忍度为5 ppm，丰度大于10^6任意单位（AU），并且至少有12个峰值点（全质量范围的一半最大宽度，FWHM）；
(ii) 检查保留时间，允许与标准的偏差在20%以内；
(iii) 检测另外两个最丰富且选择性的离子，作为资格确认离子；
(iv) 符合同位素离子比值（差异<10%）；
(v) 将全扫描质量光谱与NIST参考光谱库进行比对。质量测量误差（Δmi）的计算依据Oró-Nolla等人（2024年）的研究[29]进行。

对于可疑化合物的筛选，采用了Trace Finder软件中的反卷积插件[31, 32]。此外，数据还根据以下标准进行筛选：
1) 解析所有m/z谱线，以获得质量提取窗口内质量容忍度为5 ppm的纯净质量光谱，并且离子丰度大于10^6 AU，作为峰值反卷积的条件；
2) 根据综合得分来确定独特化合物：
(a) 反向搜索指数（RSI）>750，表示将未知化合物的质量光谱与精确质量光谱库（例如NIST）进行比较的结果；
(b) 高分辨率过滤（RHRF）得分>90，表示实际测量质量与理论质量（根据特定分子的元素组成）之间的差异；
3) 选择分子离子或基峰的质量谱线，其质量误差在5 ppm以内。

**结果与讨论：**
GC–EI–Orbitrap–HRMS方法具有非常高的灵敏度和选择性，能够明确识别低浓度下的污染物[33]。表1总结了用于确定沉积物和鸡蛋样品中目标化合物的整体分析方法的质量参数。在20–500 ng/mL的范围内，所有化合物的测定系数（R2）均高于0.999，显示出良好的线性。重复性和再现性值以相对标准偏差（RSD%）表示，均<20%。仪器检测限（IDLs）的范围为0.001至0.257 ng/mL。分析物对空白样品的贡献小于IDLs，因此无需进行空白样品的扣除。图S1显示了500 ng/mL标准溶液的GC-HRMS总离子电流（TIC）色谱图，使用60米长的色谱柱获得了良好的色谱分离效果和所有目标化合物的分辨率。全扫描GC–EI–Orbitrap–HRMS分析的识别标准基于保留时间和每种分析物的三个最强烈且选择性的精确质量离子。基峰用于定量，另外两个最丰富且选择性的离子被作为资格确认离子。在本研究中，所有化合物的Δmi<1.84 ppm（表S2）。沉积物的方法检测限（MDLsed）介于0.01至0.33 ng/g干重之间，而鸡蛋样本的MDLeggs介于0.05至2.39 ng/g干重之间。所提出的提取方法对大多数目标化合物（沉积物中38种，鸡蛋中39种，共45种）的回收率较高（69–121%），RSD%值<18%。对于滴滴涕（Dieldrin），最初选择m/z 79的离子作为定量离子，因为它是强度最大的碎片，但其强度较低，这可能是由于C-trap对低分子量离子的捕获效率低所致，可能导致错误识别[34]。因此，最终选择了m/z 263的离子进行定量，但回收率非常低（沉积物中为13%，鸡蛋样本中为33%）。

关于方法不确定性，大多数污染物（沉积物中35种，鸡蛋中39种，共45种化合物）的\(U{\prime}\)值≤50%，这表明所提出的分析方法性能良好，符合SANTE 11312/2021的建议[30]。由于使用商业分析标准样品进行添加实验，因此认为添加水平相关的不确定性可以忽略不计。对于七氯环氧树脂（heptachlor epoxide）和甲氧氯（methoxychlor），由于其回收率较低（28%至62%），\(U{\prime}\)值>100%。在这些情况下，不确定性主要受到添加值偏差的影响（偏差），而非测量重复性。表S3显示，沉积物中39种化合物的偏差组分\(({u'}_b)\)的范围为0.8%至31%，鸡蛋中43种化合物的偏差组分\(({u'}_b)\)的范围为1.9%至38%，表明回收值通常接近理论添加浓度，除了异滴滴涕（isodrin）、七氯环氧树脂（heptachlorepoxide）、滴滴涕（dieldrin）和甲氧氯（在两种基质中），以及苯[a]芘（benzo[a]pyrene）和苯[g,h,i]芘（benzo[g,h,i]perylene），这些物质的偏差\({u'}_b\)>50%。精确度组分\({u'}_s\)反映了在方法重复性条件下使用添加样品进行测量的变异性，此变量没有真实或确定的数值。如果\({u'}_s\)值较低，则表明性能良好，因为重复实验之间的分散度较小。在本研究中，沉积物的\({u'}_s\)组分范围为0.7%至22%，鸡蛋的\({u'}_s\)组分范围为0.2%至28%。偏差组分比精确度组分变化更大，这与良好的再现性（RSD<20%）相关；而偏差与接近添加值的程度有关，未能有效回收的化合物会导致\({U'}\)值的增加。总之，\(U{\prime}\)的计算提供了一个额外的质量参数，证明了所提出方法适用于确定沉积物和鸡蛋样品中的POPs和PAHs，使得分析结果的可比性得到保证。以往的研究显示，使用GC–Orbitrap方法测量POPs和PAHs的\(U{\prime}\)值范围为21%至47%[29]；在鱼类样品中，使用GC–MS/MS方法测量OCPs和多溴联苯醚（PBDEs的\(U{\prime}\)值范围为14%至29%[35]；使用GC–Orbitrap方法测量HCB、HCBu、PeCB和HCHs的\(U{\prime}\)值范围为4.8%至15%[28, 35]。总体而言，GC–EI–Orbitrap–HRMS方法在识别POPs和PAHs方面表现出高度的可靠性，即使沉积物和鸡蛋是复杂的基质。

**埃布罗河三角洲沉积物和海鸥蛋的浓度：**
图2比较了Flix 1和Flix 2沉积物中目标污染物的平均浓度以及2012年和2019年海鸥蛋中的浓度。可以看出，这两种基质中的污染物的分布非常不同：沉积物积累了所有的滴滴涕（DDTs）、多氯联苯（PCBs）和植物产生的溶剂，而鸡蛋则积累了4,4'-DDE和其他不一定来源于植物的OCPs，以及积累量最大的PCBs。虽然两种基质中的污染模式不同，但沉积物是POPs的主要污染源，这突显了这些污染物的持久性和在埃布罗河三角洲生态系统中持续存在的营养传递现象。此外，修复活动改变了海鸥蛋中的POP浓度，但没有改变污染模式，表明海鸥蛋长期暴露于高浓度的污染物中。

**表2：**
表2显示了Flix水库中五种沉积物和海鸥蛋中污染物的浓度，仅包括在两种或其中一种基质中检测到的化合物。沉积物中的∑POPs浓度范围为14.7至62,132 ng/g干重。污染最严重的样品是Flix 2，其次是Flix 1（均位于水坝范围内），其余地点的浓度依次为Flix 3 > Flix 4 > Flix 5。显然，封闭沉积物（Flix 1和Flix 2）中的∑POPs浓度比水坝外的沉积物（Flix 3至Flix 5）高几个数量级，这表明水坝的范围包括了含有污染残留物的区域。最常见的化合物是4,4'-DDT、PCBs、HCB、六氯丁二烯（HCBu）、PeCB和六氯环己烷（HCHs）。尽管DDT的生产已于1971年结束[16]，但在2011年的样本中，DDT的浓度范围为1.65–49,386 ng g?1 dw，DDE的浓度范围为0.06–882 ng g?1 dw，DDD的浓度范围为0.23–4,073 ng g?1 dw，并且随着距离工厂的距离增加，浓度逐渐降低（如图1C所示），在Flix 5处甚至没有检测到一些DDT。Flix 2的4,4′-DDT浓度最高，这可能与其靠近工厂的排放管道或河流流向有关。在多氯联苯（PCBs）中，PCB28的浓度最高，范围为0.28–1376 ng g?1 dw，其次是PCB180 > PCB153 > PCB52 > PCB138 > PCB101 > PCB118，浓度范围为0.06–540 ng g?1 dw；从Flix 1到Flix 5，浓度减少了1000倍。沉积物中存在的高氯化PCBs表明这些化学物质通过埃布罗河从Flix传输到了河流三角洲，可能影响了Audouin鸥以及其他地区的物种。

关于HCB，其浓度从Flix 1的11,512 ng g?1 dw逐渐减少到Flix 4和Flix 5的3.23 ng g?1 dw和3.55 ng g?1 dw；HCBu和PeCB也表现出类似的趋势，浓度从Flix 1的342 ng g?1 dw和543 ng g?1 dw分别减少了10倍和100倍，最终在外围区域的浓度降至相对较低的1.09 ng g?1 dw和0.18 ng g?1 dw。α-, β-, γ-和δ-HCH异构体的浓度比其他有机氯污染物（OCPs）低得多，且在围墙内的沉积物中浓度更高（最高达到35.1 ng g?1 dw），其中β-HCH和γ-HCH是最常见的异构体。Mirex仅在Flix 1中被检测到，且浓度接近检测限（MDL）。Heptachlor epoxide和chlordanes仅在鸟蛋中被检测到，而在沉积物中未检出。PAHs在Flix沉积物中未检出。

对于2012年和2019年收集的鸟蛋样本中目标化合物的浓度（表2），2012年鸟蛋中的∑POPs浓度大约是2019年样本的两倍。两年中PCBs都是最普遍的化合物，其中PCB153 > PCB180 > PCB138的浓度最高，2012年的浓度范围为1063–2190 ng g?1 dw，2019年减少到557–1,354 ng g?1 dw。这种化合物分布模式与六氯和七氯联苯具有更高的生物累积潜力一致。具体而言，PCB118的浓度范围为159–299 ng g?1 dw，而PCB28、PCB52和PCB101的浓度低于15 ng g?1 dw（两年数据均如此）。图3展示了PCBs的色谱轮廓差异，与标准混合物相比，沉积物中显示了更多的PCB特征和更高的多样性，而鸟蛋中则以标记化合物为主。

在OCPs方面，2012年检测到4,4′-DDE的浓度为3473 ng g?1 dw，2019年减少到1426 ng g?1 dw；4,4′-DDT仅在2019年被检测到，浓度为7.80 ng g?1 dw，证实这种高持久性化合物在其生产超过50年后仍以其前体的形式存在。两年中4,4′-DDE的浓度都远低于沉积物中普遍存在的4,4′-DDT，这表明在鸥体内发生了代谢作用，这与先前的研究结果一致[24,25,26]。其他化合物如4,4′-DDD、2,4′-DDE和2,4′-DDT在鸟蛋中的浓度低于10 ng g?1 dw，而2,4′-DDD未被检测到。β-HCH和γ-HCH也表现出类似的趋势。HCB在2012年的浓度为22.7 ng g?1 dw，2019年减少到18.7 ng g?1 dw，表明多年来暴露水平较低。尽管HCB、PeCB和HCBu在沉积物中的浓度较高，但其在鸟蛋中的浓度较低，这可能是由于其生物累积潜力低且挥发性高的缘故[19]。Dieldrin是过去使用最多的杀虫剂之一，2012年和2019年的最大浓度分别为21.1 ng g?1 dw和11.5 ng g?1 dw。尽管Flix从未生产过Dieldrin，但其在鸟蛋中的浓度高于沉积物，可能反映了该地区过去的农业活动。Dieldrin对高营养级鸟类存在特别风险[36]。Heptachlor epoxide、chlordanes和mirex仅在鸟蛋样本中被检测到，浓度低于10 ng g?1 dw，可能来源于该地区的农业活动而非受污染的沉积物。2012年和2019年鸟蛋中PAHs均未检出。

2012年和2019年鸟蛋浓度的比较显示，遗留POPs水平下降了50%，尤其是4,4′-DDE和高度氯化的PCB化合物。这意味着 remediation措施在减少鸟体内的POPs负担方面有效。由于鸟蛋是埃布罗河三角洲自然公园鸟类繁殖区POPs污染的生物指示器，这些结果对确保生态系统的健康至关重要。这些发现进一步证实了鸥类是该地区有机污染的有效生物监测器。

图4总结了用于化合物鉴定的工作流程，包括以下步骤：(1) 在特征生成和优先级排序阶段，Deconvolution插件确定了约2500种潜在候选化合物，并与NIST库进行比对。为了确保高置信度，应用了预先设定的优先级阈值（RSI > 750, RHRF > 90）。保留时间对齐进一步将列表精炼为1280个具有明确质谱的特征，并提高了光谱库匹配的概率（置信度为4）。(2) 在临时公式和结构分配阶段，分子离子或基峰离子在5 ppm质量误差范围内的存在对于临时化学公式分配至关重要（置信度为3）。此外，还手动评估了质谱中其他离子的存在，以确认观察到的碎片模式是否与提出的化学结构一致（置信度为2）。使用含有所有目标化合物的标准混合物（浓度为40 ng/mL）评估了可疑筛选方法，并对添加了40 ng g?1 dw的沉积物和50 ng g?1 dw的鸟蛋样本进行了分析（置信度为1）。表S4显示了Deconvolution插件自动识别的结果；在研究的45种化合物中，大多数被正确识别。然而，由于基质成分的存在，一些化合物的自动识别未能完成，这增加了与光谱库匹配的难度。对于同分异构化合物（如PCBs和PAHs），有时给出的库名称和化学公式不正确，因此需要根据测试标准溶液的保留时间和质谱手动分配正确的名称。还有证据表明，当化合物浓度超过50 ng g?1 dw时，Deconvolution插件软件能可靠地从NIST库中匹配到唯一的化合物[31]。低于此阈值时，强烈建议进行手动识别和确认。这些方法的性能取决于化合物本身，并受到离子化和离子碎片特性的影响。

提出的可疑筛选方法应用于分析埃布罗河三角洲的沉积物和鸟蛋中的有机污染物。从五个沉积物样本中，选择了污染最严重的样本（Flix 1）进行全面数据分析，而从四个分析的鸟蛋样本中选择了2019年收集的一个样本。在检测到的化合物中，PCB同系物是两种基质中占主导地位的POPs，由于其多种同系物结构具有相似的m/z值，完全鉴定这些化合物是一个挑战。表3列出了在置信度2水平下暂时识别的化合物，包括保留时间、PCB的氯原子数量、最强烈的离子及其质量误差值（以ppm为单位）、NIST库中匹配的化合物名称以及RSI分数（对于显示的化学物质，RFRH分数设置为>90）。在Flix沉积物中识别出88种化合物，其中包括73种PCBs；在Larus audouinii鸟蛋中识别出43种化合物，其中33种是PCBs。确认PCBs的具体方法是验证每个NIST库匹配是否符合相应的氯化程度。这种可疑筛选方法证实了两种基质中所有PCBs的正确氯化程度分配。两种样本中的PCB轮廓差异显著：沉积物中低氯化PCBs较多，而鸟蛋中从五氯到八氯同系物的比例增加。这些PCBs的广泛存在与其高生物累积潜力相关，本研究提供了关于Flix污染热点地区存在的氯化化合物多样性的新数据。

表S5显示了在置信度2水平下额外检测到的15种化合物（通过库光谱匹配确认）。其中五种化合物，如联苯和二苯呋喃（工业化学品）、八氯苯乙烯（某些电解过程的意外副产品）以及两种农用化学品phosmet和pyridaben，仅在沉积物中被识别。杀虫剂bioallethrin、pyracarbolid、terbucarb和resmethrin仅在鸟蛋中被识别，这些化学品在农业中广泛使用；最后一种用于驱蚊，其存在与该地区易受洪水影响的特性相符。最后，有六种化合物在两种基质中都被发现，表明这些化合物有广泛暴露。这些化合物包括羟基联苯、三氯苯、二氯苯、二丁基邻苯二甲酸酯和二乙基邻苯二甲酸酯以及甲基萘，它们可能与工业用途（如热传递介质或溶剂）或农业应用有关。

总体而言，提出的可疑筛选方法能够检测到广泛的有机污染物，包括遗留污染物（如PCBs）、农用化学品和增塑剂，并允许识别工业化学品和副产品。这些发现突显了综合靶向和可疑筛选方法在扩大化合物覆盖率和提高化合物识别信心方面的价值，从而有助于理解污染物在沉积物-生物体系统中的传输和积累。然而，需要进一步的研究来增强对非常规监测有机污染物的表征和检测，以全面评估鸟类种群中的化学负担。

基于GC–EI–Orbitrap–HRMS的分析方法开发了一种用于筛选和定量45种POPs和PAHs的方法，并研究了Flix沉积物和埃布罗河三角洲Larus audouinii鸟蛋中其他有机污染物的存在。该方法的质量参数证明了其灵敏度和选择性，不确定性分析也证实了其整体稳健性。目标分析显示沉积物和鸟蛋之间的污染特征存在差异：4,4′-DDT仅存在于沉积物中，而其代谢物4,4′-DDE主要存在于鸟蛋中，表明4,4′-DDT在生物体内发生了代谢作用并得到了生物放大。高氯含量的多氯联苯（PCBs）在鸟蛋中的检测频率高于沉积物中，且2012年采集的鸟蛋样本中该污染物的浓度略高于2019年的样本。研究者采用了一种名为“可疑物质筛查”的方法，通过Deconvolution插件对光谱数据进行过滤，并将其与NIST标准质谱库进行比对（RSI＞750，RHRF＞90），从而大幅减少了潜在污染物的数量。从最初的1,280个候选化合物中，最终在沉积物中鉴定出88种化合物，在Audouin鸥的蛋中鉴定出43种化合物并对其进行了表征。多氯联苯是这两种样本中最普遍存在的污染物，这与其来源于Flix氯碱厂的历史工业污染有关。这些污染物被输送到了埃布罗河三角洲地区，在鸥类体内实现了生物累积，并对其他共享该栖息地的物种产生了广泛影响。研究还发现，沉积物的清除活动有助于降低鸥体内该污染物的浓度。在分析样本中发现的其他污染物还包括与水稻种植相关的农用化学品、工业化学品以及与区域工业活动相关的增塑剂。将靶向分析与可疑物质筛查相结合的方法显著扩大了可检测有机污染物的范围，并提高了化合物鉴定的准确性。通过增加可检测有机化合物的种类，我们能够获得更多关于自然生态保护区污染热点影响的数据。总体而言，本研究增进了对高生物累积性和持久性污染物的认识，为评估这些物质对野生动物的毒理学影响提供了更坚实的基础。