局部应用框架核酸透皮递送系统用于重编程皮肤树突状细胞以维持移植物的免疫稳态

《Bioactive Materials》：Topical framework nucleic acid transdermal delivery system for reprogramming cutaneous dendritic cells to maintain graft immune homeostasis

　　

摘要 免疫排斥是影响同种异体皮肤移植物长期存活的主要挑战。当前的免疫抑制疗法通常通过全身给药来减轻排斥反应，但会产生显著的副作用。因此，研究人员在此提出一种基于四面体框架核酸（Tetrahedral Framework Nucleic Acids, tFNAs）的局部免疫调节策略，旨在提高同种异体皮肤移植物的存活率。研究人员将一个microRNA（miR-23b）和一个靶向树突状细胞（DC）的适配体（Aptamer）与tFNAs结合，构建了一种复合物（命名为TR），并将其嵌入到一种四臂聚乙二醇（4-armed PEG）水凝胶（MixPEG）基质中，形成MixPEG-TR。利用tFNAs的透皮递送能力和水凝胶提供的缓释作用，TR靶向皮肤中的树突状细胞，诱导其成为耐受性树突状细胞（Tolerogenic DCs, tolDCs），从而建立起持久的局部免疫耐受。在同种异体皮肤移植小鼠模型中，局部应用该制剂减少了炎性细胞浸润，促进了均匀的真皮胶原沉积，并显著延长了移植物的存活时间。这些研究结果突显了一种能够增强局部免疫耐受、减轻炎症反应的透皮、靶向树突状细胞的核酸递送策略，从而有可能维持移植物相关的免疫稳态，并为皮肤移植及其他皮肤免疫介导性疾病的免疫调节提供一个更安全、位点特异性的平台。

研究背景与目的

同种异体皮肤移植是治疗严重烧伤和广泛创伤的重要生物敷料。然而，皮肤组织具有高度免疫原性，移植物富含树突状细胞（Dendritic Cells, DCs）并高表达主要组织相容性复合体（MHC）分子，极易引发急性排斥反应。目前，系统性使用免疫抑制剂（如环孢素A、他克莫司）虽可延缓排斥，但长期使用常导致感染、恶性肿瘤及肝肾毒性等严重副作用，限制了同种异体皮肤移植的临床长期应用。因此，通过局部、无创的递送方式诱导移植部位的免疫耐受，有望在延长移植物存活的同时减少全身毒性，具有重要的临床意义。

树突状细胞是启动皮肤移植物排斥反应的关键抗原提呈细胞。成熟的DCs会上调共刺激分子（如CD80、CD86）并分泌促炎细胞因子（如IL-1β、TNF-α），从而驱动效应T细胞（Teffs）扩增，加剧炎症和排斥。相反，耐受性树突状细胞（TolDCs）则会下调共刺激分子并分泌抗炎细胞因子IL-10，抑制Teffs，促进调节性T细胞（Tregs）的生成，从而维持局部免疫稳态。因此，靶向并重编程DCs，使其从促炎表型向耐受表型转变，是诱导局部免疫耐受的根本策略。MicroRNA-23b（miR-23b）已被证明可通过抑制Notch1/NF-κB等信号通路，在DCs中驱动耐受性表型。然而，miRNA和靶向适配体在体内易被核酸酶降解，且透皮递送需克服皮肤角质层屏障。四面体框架核酸（tFNAs）作为一种三维DNA纳米结构，具有良好的稳定性、低免疫原性及优异的生物屏障（如皮肤）穿透能力，是理想的核酸递送平台。此外，为了克服游离tFNAs在皮肤局部滞留时间短的问题，需要一种能够提供缓释和局部粘附的递送基质。

基于此，本研究旨在构建一种整合了DC靶向适配体和miR-23b的tFNA复合物（TR），并将其封装在具有组织粘附性的四臂聚乙二醇水凝胶（MixPEG）中，形成MixPEG-TR透皮递送系统。研究人员假设该系统能够实现透皮、靶向、持久地重编程皮肤DCs功能，诱导局部免疫耐受，从而延长同种异体皮肤移植物的存活，为局部治疗免疫介导性疾病提供新策略。相关研究成果发表在《Bioactive Materials》期刊。

关键技术方法

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：首先，通过DNA链退火自组装合成了tFNAs，并通过碱基互补配对将靶向DCs表面受体CD209a的DNA适配体和小鼠miR-23b逐步装载到tFNAs上，构建了靶向复合物TR。其次，使用一种商品化的四臂聚乙二醇衍生物（4ArmPEG-NHS和4ArmPEG-NH₂）水凝胶（MixPEG）系统，通过其末端的活性酯与胺基原位交联，将TR封装其中，形成MixPEG-TR复合水凝胶。在体外研究中，使用了小鼠骨髓来源的树突状细胞系DC2.4，并利用脂多糖（LPS）刺激模拟炎症环境，评估TR对DC表型的影响。在体内研究中，建立了雄性C57BL/6小鼠之间的同种异体全层皮肤移植模型，术后局部应用不同组别的水凝胶制剂。研究综合运用了多种表征和分析技术，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）、扫描电子显微镜（SEM）、流式细胞术、免疫荧光、酶联免疫吸附试验（ELISA）、蛋白质印迹法（Western Blot）、转录组测序（RNA-seq）以及非靶向代谢组学分析等，从多个层面系统评估了纳米复合物的理化性质、细胞摄取、免疫调节效应及其在动物模型中的治疗效果。

研究结果

2.1. tFNAs和TR的表征

通过PAGE、DLS、Zeta电位、TEM和AFM等一系列表征手段，研究人员证实了tFNAs及功能化复合物TR的成功组装。TR的流体动力学直径（~16.78 nm）大于tFNAs（~12.44 nm），表明miR-23b的成功装载。电镜图像显示了清晰的四面体纳米结构。

2.2. TR的细胞内分布

通过共聚焦显微镜和流式细胞术分析发现，与单链DNA（S2-Cy5）相比，Cy5标记的TR（Cy5-TR）能够更高效地被DCs摄取，并广泛分布于细胞质中，表明四面体纳米结构显著增强了核酸有效载荷的细胞内递送效率。

2.3. MixPEG-TR的构建与表征

将TR封装入MixPEG水凝胶中形成了MixPEG-TR。SEM显示水凝胶具有均匀的多孔结构（孔径120-200 μm）。流变学测试表明其具有典型的凝胶行为，且TR的加入增强了水凝胶的弹性。衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）证实了TR被成功嵌入水凝胶网络。体内透皮实验显示，通过MixPEG递送的TR能够穿透表皮进入真皮层，并且其荧光信号与皮肤DCs标志物CD11c的染色区域广泛重叠，表明MixPEG显著增强了TR的透皮递送效率和DCs靶向性。

2.4. TR在体外诱导树突状细胞产生耐受性表型

在LPS刺激的体外模型中，研究人员评估了TR对DCs表型的影响。扫描电镜显示，TR处理减少了LPS诱导的DCs表面突起。流式细胞术分析表明，TR处理显著降低了DCs表面共刺激分子CD80和CD86的表达水平。免疫荧光和ELISA结果显示，TR处理有效抑制了LPS诱导的NF-κB核转位以及促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达，同时显著上调了抗炎细胞因子IL-10的表达。

转录组学分析揭示了TR处理引起了DCs广泛的基因表达重编程。与对照组相比，LPS+TR组有413个差异表达基因，这些基因在Gene Ontology（GO）条目中富集于“对刺激/胁迫的反应”和“防御反应”，在KEGG通路中则富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、NOD样受体以及IL-17等与炎症相关的信号通路。蛋白质印迹分析进一步在蛋白水平证实，TR处理下调了TLR4的表达，抑制了IκBα的降解和NF-κB p65的磷酸化，同时降低了IL-1β和TNF-α蛋白水平，增加了IL-10蛋白水平，表明TR通过抑制TLR4–NF-κB炎症信号通路，促使DCs向耐受表型转变。

2.5. MixPEG-TR在同种异体皮肤移植模型中的局部免疫耐受效应

在小鼠同种异体皮肤移植模型中，局部应用MixPEG-TR显著改善了移植物的存活状态。与对照组、MixPEG组和MixPEG-tFNAs组相比，MixPEG-TR处理组的移植物颜色更接近正常皮肤，组织柔软，与宿主皮肤整合良好，收缩程度最小，宏观病理评分和基于2007年班夫（Banff）标准的病理学排斥分级均显著降低。苏木精-伊红（H&E）染色显示，MixPEG-TR组移植物表皮连续、真皮层结构完整，炎性细胞浸润极少，皮肤附属器保存较好。

马松三色（Masson's trichrome）染色显示，MixPEG-TR组移植物中的胶原沉积更均匀、连续，纤维排列更规则，胶原含量定量分析结果最高。免疫组织化学（IHC）染色表明，MixPEG-TR组移植物中CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T细胞的浸润以及促炎细胞因子TNF-α的表达均显著减少，而抗炎细胞因子IL-10的表达则显著增加。免疫荧光共染色显示，移植物中CD11c⁺DCs的数量及其表面共刺激分子CD80和CD86的表达强度在MixPEG-TR组中也显著降低。

流式细胞术分析显示，MixPEG-TR处理不仅影响了局部移植物，还产生了系统性免疫调节效应。在移植后第14天，MixPEG-TR组小鼠脾脏中DCs的CD80和CD86表达降低，同时脾脏中调节性T细胞（Tregs, CD3⁺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺）的比例升高，而CD8⁺效应T细胞（CD3⁺CD8⁺CD44^highCD62L^low）的比例降低。此外，在引流淋巴结中也观察到了Tregs比例的增加。血常规检查未发现明显的系统性毒性。

非靶向代谢组学分析揭示了MixPEG-TR处理对移植物局部代谢微环境的深刻重塑。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）显示处理组与对照组代谢谱完全分离。差异代谢物主要富集在三大类代谢通路：1）脂质相关通路（如亚油酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成、甘油磷脂代谢）；2）氨基酸相关通路（如精氨酸生物合成、精氨酸/脯氨酸代谢）；3）ABC转运蛋白通路。这些代谢重编程可能与DCs的膜脂组成、信号转导及免疫表型的调节有关，共同支持了耐受性表型的建立。

讨论与结论

在讨论部分，研究人员肯定了本研究基于tFNAs的MixPEG-TR系统在诱导局部免疫耐受、延长同种异体皮肤移植物存活方面的有效性。同时，文章也指出了该策略在向临床转化过程中可能面临的挑战与展望，主要包括：1）透皮递送效率：小鼠与人类皮肤在屏障属性上存在差异，未来可能需要结合微针、电穿孔等物理增强手段来提升在人体组织中的递送深度和稳定性。2）靶向特异性：本研究使用了靶向小鼠DCs表面CD209a的适配体，而人类DCs上功能相关的C型凝集素受体是DC-SIGN，已有研究成功筛选出针对人DC-SIGN的高亲和力适配体，因此该策略具有跨物种应用的潜力。3）长期安全性：tFNAs具有良好的生物相容性和可控性，且适配体介导的靶向可减少miRNA的脱靶效应和全身暴露，为长期应用提供了安全性保障。4）临床可及性与可扩展性：基于已获批临床应用的PEG材料，MixPEG水凝胶平台具有良好的生物相容性和可规模化生产的潜力，可通过注射或喷涂方式覆盖大面积或不规则创面，为核酸药物在真实临床场景中的大规模应用提供了实用路径。总体而言，本研究在透皮递送、细胞特异性靶向、长期生物安全性及工程化可扩展性等关键维度上，为构建一种可编程的、局部免疫耐受治疗平台奠定了重要基础。

研究结论

综上所述，本研究所构建的基于四面体框架核酸的MixPEG-TR系统，具有优异的结构稳定性和局部透皮递送能力，显著增强了TR在皮肤移植区域的富集和滞留。在体外，TR抑制了树突状细胞的炎症性成熟，并诱导其向耐受性表型转变；在小鼠同种异体皮肤移植模型中，局部应用MixPEG-TR显著减轻了排斥反应和组织损伤，促进了有组织的胶原重塑，并延长了移植物的存活时间。