利用自组装树突状细胞纳米疫苗对抗术后免疫抑制

《Bioactive Materials》：Countering postoperative immune suppression with a self-assembling dendritic cell nanovaccine

　　

由转化生长因子β（transforming growth factor β，TGFβ）介导的树突状细胞（dendritic cell，DC）功能障碍驱动的术后免疫抑制会显著削弱抗原特异性T细胞应答，并提高癌症复发风险。其核心机制是TGFβ导致DC溶酶体功能缺陷，该缺陷源于溶酶体前体蛋白prosaposin（pSAP）的缺失。本研究开发了一种体内生成的DC疫苗——BAIT（boosting antigen-delivering immunovaccine for T cell priming，T细胞 priming增强型抗原递送免疫疫苗），其将DC招募、抗原递送与免疫激活整合于单一平台。受精氨酸代谢驱动溶酶体生物发生及酸化的启发，BAIT采用富含精氨酸的自组装肽骨架，肿瘤裂解物抗原与趋化因子CCL20通过配位相互作用在该骨架中共组装。术后早期给药时，BAIT可招募DC，促进抗原内化，并激活mTOR通路以上调pSAP表达。这种BAIT介导的DC调控逆转了TGFβ诱导的抗原消化及主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）-肽复合物形成损伤。为优化精准免疫治疗，研究人员采用功能性精准医疗策略，定制经铁死亡、坏死性凋亡或凋亡诱导的肿瘤裂解物制剂。在小鼠术后癌症模型中，采用凋亡裂解物制备的Apo-BAIT使肿瘤负荷降低85.5%。研究结果表明，BAIT靶向溶酶体mTOR-pSAP轴恢复DC功能，为对抗手术诱导的免疫抑制提供了一种个性化术后癌症疫苗策略。

论文解读

研究背景与意义

手术切除是原发或转移性肿瘤的核心治疗手段，但手术创伤本身可能促进微转移灶生长与新转移灶形成，这一现象与术后“免疫抑制窗口期”密切相关。该阶段内，手术应激、麻醉等围手术期因素在促进伤口愈合的同时，会引发系统性免疫抑制，其中树突状细胞（DC）功能损伤是核心特征。既往研究表明，手术移除肿瘤后，肿瘤微环境被破坏，DC迁移所需的趋化因子梯度消失，同时手术应激释放的前列腺素、转化生长因子β（TGFβ）等介质会直接损害DC功能，导致其抗原摄取与T细胞启动能力下降，进而削弱抗肿瘤免疫并促进转移进展。进一步机制研究发现，术后升高的TGFβ会导致溶酶体前体蛋白prosaposin（pSAP）过度糖基化，使其无法结合分选受体sortilin进入溶酶体，反而被错误导向分泌途径释放到细胞外，造成溶酶体内pSAP及其剪切产物saposins（SAPs）严重缺乏，最终引发溶酶体膜完整性受损、抗原加工障碍，尤其是凋亡细胞来源抗原的交叉呈递能力下降。尽管已有研究证实，通过抗DEC205抗体向DC靶向递送pSAP可改善抗原呈递并降低肿瘤负荷，但传统DC疫苗需体外分离单核细胞、诱导分化为DC、负载抗原并诱导成熟后回输，难以应对术后体内高TGFβ的免疫抑制微环境，临床疗效有限。针对上述问题，中山大学研究团队在《Bioactive Materials》发表研究，开发了名为BAIT（boosting antigen-delivering immunovaccine for T cell priming，T细胞启动增强型抗原递送免疫疫苗）的体内生成DC纳米疫苗，通过重塑术后DC溶酶体功能对抗免疫抑制，并结合功能性精准医疗策略优化疫苗效能，为预防术后肿瘤复发提供了新型个性化治疗思路。

关键技术方法

研究主要采用分子动力学模拟验证肽与钙离子（Ca²⁺）的配位作用；通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜、动态光散射、流变学分析表征BAIT的形貌、尺寸与力学性质；利用实时细胞迁移实验评估DC招募能力；采用激光共聚焦显微镜、流式细胞术、蛋白质印迹法、实时荧光定量PCR分析DC的抗原摄取、消化、溶酶体功能、mTOR通路活化及pSAP表达水平；通过转录组测序与细胞因子检测评估DC成熟度与T细胞激活状态；构建小鼠术后肺癌复发模型，以肿瘤生长曲线、肿瘤重量、组织学染色、流式细胞术分析评估体内抗肿瘤疗效与免疫微环境重塑效应；采用功能性精准医疗策略，分别用顺铂、香茅醇、多柔比星诱导肿瘤细胞发生铁死亡、坏死性凋亡、凋亡，制备不同免疫原性细胞死亡（ICD）来源的肿瘤裂解物，筛选最优疫苗配方。

研究结果

2.1 BAIT的制备与力学性能

研究人员设计合成精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸重复序列肽，其可通过静电作用与氢键自组装为β-折叠纳米纤维，以Ca²⁺为连接子将肿瘤裂解物抗原与趋化因子CCL20锚定在肽骨架上，经超声处理后形成BAIT纳米凝胶。分子动力学模拟显示Ca²⁺与肽的天冬氨酸、丙氨酸、精氨酸残基稳定配位，圆二色光谱证实Ca²⁺加入后肽-抗原复合物发生显著构象变化，扫描电镜与透射电镜显示BAIT为单分散纳米颗粒，平均流体力学直径为110.4±5.7 nm，抗原包封率达94.3%，流变学分析显示其具备可注射性（注射力低于2.8 N），体内外稳定性实验表明BAIT可在注射部位长效滞留，避免抗原快速清除。

2.2 BAIT促进TGFβ刺激下DC的抗原摄取与消化

BAIT通过持续释放CCL20形成局部趋化因子梯度，使DC迁移数量较游离抗原组提高2.6倍。在TGFβ存在的术后模拟环境中，游离抗原处理的DC因溶酶体功能缺陷，抗原摄取达到饱和且无法有效消化已内化抗原；而BAIT处理的DC抗原摄取效率较游离抗原组提高4.4倍，且可快速消化初始摄入的抗原，持续摄取新抗原，突破TGFβ诱导的抗原摄取阻滞。

2.3 BAIT通过mTOR介导的pSAP上调恢复DC溶酶体功能

机制研究显示，BAIT释放的精氨酸通过激活mTOR信号通路，上调pSAP的mRNA与蛋白表达，促进pSAP定位于溶酶体并剪切为功能性SAPs。药理学抑制mTOR可阻断BAIT对pSAP与SAPs的上调效应。功能层面，BAIT可逆转TGFβ导致的溶酶体酸化不足，恢复溶酶体酸性环境与蛋白水解活性，使DC在18小时内完全清除内化抗原，而游离抗原组DC在相同时间内仍保留90.5%的抗原信号。

2.4 BAIT增强DC的抗原呈递能力与成熟度

溶酶体功能恢复后，BAIT处理的DC可高效将肿瘤抗原加工为多肽并加载到主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类与Ⅱ类分子上，表面MHCⅠ⁺DC比例从TGFβ模型组的29.7%提升至50.6%，MHCⅡ⁺DC比例从29.2%提升至51.1%，同时共刺激分子CD80表达显著上调，DC成熟相关基因表达升高，免疫抑制基因表达降低，证明BAIT可有效逆转TGFβ诱导的DC功能抑制。

2.5 BAIT促进T细胞激活并抑制术后肿瘤复发

体外共培养实验显示，BAIT处理的DC可使初始T细胞向细胞毒性CD8⁺T细胞分化比例显著提升，T细胞培养上清中干扰素γ（IFNγ）与肿瘤坏死因子α（TNFα）分泌水平升高。在小鼠术后肺癌复发模型中，BAIT治疗组肿瘤生长显著延缓，终点肿瘤重量较模型组与游离抗原组明显降低，肿瘤浸润抗原呈递细胞（CD45⁺MHCⅠ⁺细胞）比例从33.3%提升至53.7%，CD8⁺T细胞与CD4⁺T细胞浸润分别增加1.5倍与1.4倍，且无明显体重下降与器官毒性。

2.6 基于功能性精准医疗策略优化BAIT

研究人员分别用顺铂（铁死亡）、香茅醇（坏死性凋亡）、多柔比星（凋亡）处理肿瘤细胞，制备三种免疫原性细胞死亡来源的肿瘤裂解物，构建Fer-BAITs、Nec-BAITs、Apo-BAITs。结果显示多柔比星诱导的凋亡细胞表面钙网蛋白暴露水平最高，损伤相关分子模式（DAMP）基因表达上调最显著；以凋亡裂解物制备的Apo-BAITs促进DC成熟的效果最优，可使DC表面MHCⅠ与CD86表达较未处理组提高1.9倍，MHCⅡ与CD80双阳性DC比例提高1.8倍。

2.7 Apo-BAIT治疗显著抑制术后肿瘤复发

在术后肿瘤模型中，Apo-BAIT治疗使肿瘤重量较生理盐水对照组降低85.5%，疗效优于其他配方；组织学分析显示Apo-BAIT组肿瘤组织细胞密度降低，凋亡指数升高，增殖标志物Ki67阳性细胞减少，证实其可有效抑制术后残留肿瘤的生长与增殖。

2.8 Apo-BAIT重塑术后肿瘤免疫微环境并增强抗肿瘤免疫

免疫分析显示，Apo-BAIT组肿瘤内成熟DC（CD80⁺CD86⁺CD11c⁺DC）比例达65.8%，DC、巨噬细胞、B细胞的MHCⅠ与MHCⅡ表达均显著上调；肿瘤浸润CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺CD4⁺双阳性T细胞数量分别较生理盐水组增加4.5倍、3.3倍、9.9倍，实现术后免疫微环境从抑制性向促炎性的重编程，且所有BAIT配方均未引起明显全身毒性。

讨论与结论

讨论部分指出，传统DC疫苗的临床转化瓶颈在于体外制备过程与体内术后免疫抑制微环境的脱节，而BAIT通过体内原位调控DC功能，规避了体外操作的局限性。研究首次将精氨酸代谢-mTOR-pSAP轴作为术后免疫抑制的干预靶点，证实其可恢复DC溶酶体功能，解决TGFβ诱导的抗原加工缺陷。结合功能性精准医疗策略，筛选出的Apo-BAIT凭借凋亡细胞释放的丰富DAMPs，实现了更强的DC激活与抗肿瘤效应，且该平台的肿瘤裂解物组分可根据不同肿瘤类型灵活调整，具备广谱应用潜力。

结论部分明确，该研究开发的BAIT是一种整合DC招募、抗原递送与免疫激活的多功能体内DC疫苗，术后早期给药可通过激活mTOR-pSAP轴恢复DC溶酶体功能，逆转TGFβ介导的免疫抑制，启动强效T细胞应答。结合功能性精准医疗策略优化的Apo-BAIT可显著降低术后肿瘤负荷，为预防术后肿瘤复发提供了安全有效的个性化疫苗方案。