《Biochemical Engineering Journal》：Generation of iPSC-Derived White Adipose Tissue Spheroids for a Functional Adipose Model
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作者：?züm Begüm B?ke、Ezgi Bulut-Okumu?、Fikrettin ?ahin、Asl? Ta?l?dere、Ay?egül Do?an
土耳其伊斯坦布尔Yeditepe大学工程与自然科学学院，遗传学与生物工程系
摘要
脂肪组织是哺乳动物体内的一种松
作者：?züm Begüm B?ke、Ezgi Bulut-Okumu?、Fikrettin ?ahin、Asl? Ta?l?dere、Ay?egül Do?an
土耳其伊斯坦布尔Yeditepe大学工程与自然科学学院，遗传学与生物工程系
摘要
脂肪组织是哺乳动物体内的一种松散的特化结缔组织，在能量储存、免疫防御、内分泌功能、产热和隔热方面发挥着关键作用。因此，在体外模拟脂肪组织对于进一步阐明疾病和脂肪生成的机制具有重要意义。据我们所知，我们首次成功地利用由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的神经中胚层前体（NMPs）生成了成熟的白色脂肪组织（WAT）球体。在分析了iPSCs及其衍生的NMPs后，我们使用该团队开发的分化方案制备出了成熟的WAT球体。对WAT球体的詳細表征显示，这些球体不仅表达了高水平的脂肪生成相关基因，还具有很强的脂质储存能力。对其分泌组的分析表明，这些球体含有类似于细胞外囊泡的结构，并且含有较高的甘油三酯含量。为了进一步评估WAT球体培养基（CM）对代谢和脂肪生成过程的潜在影响，我们将β-TC-6细胞和ASC52-telo细胞暴露于WAT球体的培养基中。数据表明，WAT球体培养基能够增加β-TC-6细胞的胰岛素分泌，而ASC52-telo细胞的脂肪生成过程未发生显著变化。总体而言，本研究的结果突显了iPSC衍生WAT球体的制备以及对其本身及其分泌组的详细分析的重要性。
引言
所有生物体都需要能量来繁殖和维持生存，而在哺乳动物中，这种能量主要储存在脂肪组织中。脂肪组织是一种复杂的特化结缔组织，其中包含多种类型的细胞，包括脂肪细胞、血细胞、免疫细胞、周细胞、成纤维细胞和内皮细胞[1]。脂肪组织的功能不仅限于能量储存，还涉及产热、提供机械支撑和免疫防御，这些功能使其具有内分泌器官的特性[2]。多年来，人们对脂肪组织的认识不断深入，目前除了其调节代谢的作用外，还了解到它通过相互连接的网路协调其他生物活动，包括免疫和神经功能[3]。这个网络主要通过脂肪细胞合成或分泌的生物活性肽（即脂联素）来发挥作用[4]。脂肪组织有多种形式，包括白色脂肪组织（WAT）、棕色脂肪组织（BAT）和米色脂肪组织[1]。BAT和米色脂肪组织的主要功能是产热，而WAT主要作为能量储存库和激素分泌器官。WAT分泌的激素在调节体内代谢活动、控制胰岛素敏感性、炎症和葡萄糖稳态方面起着关键作用[1]。由于其复杂的异质性，脂肪组织容易发生多种缺陷和并发症，可能导致严重的慢性疾病，如肥胖、心血管疾病、2型糖尿病和胰岛素抵抗。因此，开发能够在体外准确模拟脂肪组织生理功能的模型至关重要，这有助于揭示疾病和脂肪生成过程中的细胞和分子机制。关于二维脂肪组织模型的多项研究无疑为学术界做出了贡献，阐明了脂肪生成和组织缺陷的机制。迄今为止，已有几种经过充分表征的细胞系（如3T3-L1、OP9、3T3-F442A和C3H10T1/2）被用于体外脂肪组织建模[5]。最早的脂肪组织建模研究之一是由Thomson等人进行的，他们旨在模拟胰岛素抵抗[6]。尽管细胞培养模型对于脂肪生成分化非常有效，但往往无法完全反映组织的真实生理特性和复杂性。例如，米色脂肪细胞和棕色脂肪细胞在分子和细胞特性上非常相似，因为它们都在产热中起关键作用[7]。然而，Zhang等人指出，由于米色脂肪细胞高表达解偶联蛋白-1（UCP1），可能会被误认为是棕色脂肪细胞，并且可以根据其胚胎发育情况来区分[8]。此外，Wolff等人的比较研究表明，与二维培养相比，脂肪来源的间充质干细胞球体具有更高的脂肪生成潜能，并且释放的促炎因子较少[9]。
目前，干细胞与3D培养系统（包括类器官、球体和器官芯片模型）的组合被认为是一种有前景的方法，可以模拟脂肪组织的生理功能。在成本和操作便捷性方面，球体是最适合的3D培养模型，因为它可以在不使用基底膜、聚二甲基硅氧烷（PDMS）或水凝胶的情况下模拟脂肪组织的三维结构。除了模拟脂肪组织外，3D培养系统，特别是类器官和球体，还有潜力通过替代目前再生医学中使用的细胞疗法来延缓甚至治愈慢性疾病[10]。
虽然之前已有报道将人类多能干细胞（PSCs）分化为白色脂肪细胞，但大多数研究都是在二维培养系统中进行的，主要基于直接的中胚层诱导或类间充质中间体来生成脂肪细胞群体[11][12][13]。然而，尚未有研究使用瞬时胚胎细胞群（如神经中胚层前体（NMPs）在三维培养系统中进行脂肪组织分化，尤其是考虑到这些细胞的功能活性[14]。
在本研究中，我们首次利用NMPs作为模型系统，成功制备了无支架的iPSC衍生的WAT球体。在根据其分子特性对WAT球体进行表征后，我们将定向为脂肪分化方向的ASC52-telo细胞和β-TC6细胞暴露于不同浓度的WAT球体培养基中，并研究了WAT球体分泌组对脂肪生成和β细胞代谢的影响。
节片段
细胞培养
β-TC6细胞系（ATCC? CRL-11506TM）在添加了15%的热灭活（56°C加热30分钟）胎牛血清（FBS，Gibco，美国）以及1%青霉素、链霉素和两性霉素B（PSA，Invitrogen，英国）的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。细胞在37°C和5%二氧化碳的潮湿环境中孵育，每天更换一次培养基。
ASC52-Telo细胞（ATCC?-SCRC-4000）也在添加了相同成分的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。
成功构建了iPSC衍生的神经中胚层前体
作为本研究的第一步，我们分析了实验室之前制备的人类表皮成纤维细胞（HDF）衍生的iPSCs[15][16][25]。通过碱性磷酸酶（ALP）染色筛选出适合进一步实验的细胞群（图1A）。染色体分析显示iPSCs存在三体、重复或缺失现象（图1B），同时显示出比阴性对照和阳性对照更高的端粒酶活性（图1C）。
讨论
鉴于脂肪组织的多功能性和异质性，它容易发生多种缺陷和并发症，这些缺陷可能导致严重的慢性疾病，如肥胖、心血管疾病、代谢紊乱、癌症、胰岛素抵抗和糖尿病。多年来，已经建立了多种体外脂肪组织模型，使用了3T3-L1和3T3-F442A等细胞系[26]。
资助
本研究得到了土耳其科学技术研究委员会（TUBITAK）的支持，资助编号为222S560（项目编号：222S560）。
作者贡献声明
Ezgi Bulut-Okumu?： 方法论。Fikrettin ?ahin： 方法论。Asl? Ta?l?dere： 方法论。Ay?egül Do?an： 文章撰写——审阅与编辑、资源获取、方法论、实验设计、资金申请、数据分析、概念构思。?züm Begüm B?ke： 文章撰写——初稿编写、方法论、实验设计、数据分析。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了土耳其科学技术研究委员会（TUBITAK）的支持，资助编号为222S560（项目编号：222S560）。作者感谢TUBITAK的支持，并感谢P?nar Akku?-Süt博士在超微结构分析方面的帮助，以及Yeditepe大学写作中心和Hakan ?entürk在文本校对方面的支持。
