P4htm 在斑马鱼中起到了非冗余调节因子的作用，它控制着 HIF 信号通路，进而调控红细胞生成（erythropoiesis）和肾脏稳态（renal homeostasis）

《Biochemical Pharmacology》：p4htm acts as a non-redundant regulator of HIF signaling to govern erythropoiesis and renal homeostasis in zebrafish

　　

梁亚婷|窦雪涵|黄浩|唐燕飞|张伯奇|邱文翰|郑家宝|刘云章|李云|卢玲

中国海洋大学医药学院，教育部海洋药物重点实验室，青岛，中国

摘要

细胞对缺氧的反应主要由HIF（缺氧诱导因子）通路调节，其稳定性由PHD（脯氨酰羟化酶结构域）蛋白调控。虽然PHD2（含有脯氨酰羟化酶结构域的蛋白2）是HIF-α（缺氧诱导因子-α）稳定性的主要调节因子，PHD1/3（含有脯氨酰羟化酶结构域的蛋白1/3）起辅助作用，但P4HTM（脯氨酰-4-羟化酶，跨膜蛋白）的生理功能仍不明确。本文研究表明，p4htm敲除斑马鱼表现出持续激活的HIF，并出现包括红细胞增多症、病理性心脏重塑和新型HIF依赖性肝脂肪变性在内的系统性疾病。重要的是，我们证实p4htm突变体中的心包水肿和肾脏缺陷在机制上依赖于HIF信号通路，这一点通过Hif-α抑制剂能够得到缓解。我们的发现表明p4htm是心血管、肾脏和代谢系统中HIF介导的稳态的关键生理调节因子。

引言

氧气的可获得性是细胞代谢和生存的基本决定因素[1]、[2]、[3]。在脊椎动物中，PHD家族作为核心的分子传感器，通过调节HIF信号通路来维持生理稳态[4]、[5]、[6]。过去二十年的大量研究阐明了PHD1、PHD2和PHD3在调节HIF活性、红细胞生成和代谢平衡中的作用[7]、[8]、[9]。其中，PHD2被认为是经典HIF通路的主要调节因子[9]、[10]。相比之下，P4HTM作为PHD家族中较晚发现的成员，其功能仍很大程度上未被研究。

最近使用p4htm敲除小鼠模型的研究开始揭示其多样的生理功能。这些小鼠会出现晚发性蛋白尿和肾小球硬化，能量代谢、葡萄糖稳态和神经肌肉功能发生显著改变，并表现出降低恐惧和焦虑等有趣的表型[11]、[12]、[13]。值得注意的是，尽管一些证据表明P4HTM可能影响红细胞生成，但p4htm敲除小鼠并未出现红细胞增多症，尽管一些研究报道EPO水平可能升高[14]、[15]、[16]、[17]。此外，虽然在p4htm缺陷小鼠中观察到了肾脏缺陷，但HIF信号通路在这些病理过程中的确切作用尚未直接证实[15]。

在这种情况下，我们利用CRISPR/Cas9技术生成了能够存活到成年的纯合p4htm突变斑马鱼。值得注意的是，p4htm突变鱼表现出红细胞增多症，这一表型与phd2缺陷斑马鱼相似，同时还具有其他PHD突变鱼未见的独特肾脏功能障碍。抑制HIF通路有效缓解了肾脏缺陷，这是首次在体内证明Hif信号通路直接调节肾脏功能的证据。这些发现挑战了长期以来关于PHD家族成员功能冗余的假设，并确立了P4HTM作为维持肾脏稳态的PHD/HIF网络中独特调节因子的地位。

章节摘要

斑马鱼的饲养和伦理

成年斑马鱼（Danio rerio）在中国北京的一个循环水系统中饲养，光照时间为14小时/黑暗时间为10小时，温度为28±0.5°C，每天喂食两次新鲜孵化的卤虫。< />品系来自中国武汉的中国斑马鱼资源中心（CZRC）。敲除斑马鱼是由中国科学院水生生物学研究所的肖武汉博士生成的。所有实验程序均获得了动物伦理委员会的批准

p4htm敲除在斑马鱼中激活缺氧信号通路

为了研究p4htm的功能，我们使用CRISPR/Cas9技术生成了两条突变斑马鱼品系：p4htm^ouc1（5个碱基对缺失）和p4htm^ouc2（14个碱基对缺失）（图1A）。这两个等位基因预计会引入过早终止密码子并破坏保守的2-OG依赖性双加氧酶结构域（图1B）。与此一致，RT-qPCR结果显示两种突变体的p4hmRNA显著减少（图1C）。在缺氧条件下，突变体的Hif-1αb蛋白水平进一步升高（图1D），表明

讨论

CRediT作者贡献声明

梁亚婷：撰写——原始草案、验证、方法论、实验设计、数据分析、数据整理。窦雪涵：撰写——原始草案、验证、方法论、实验设计、数据分析、数据整理。黄浩：实验设计、数据分析。唐燕飞：方法论、实验设计。张伯奇：方法论、实验设计。邱文翰：实验设计。郑家宝：实验设计。刘云章：概念提出。李云：概念提出。卢玲：撰写——审阅与编辑，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

L.