《Biochemical Society Transactions》：TAM receptor tyrosine kinases as potential mediators of the non-lytic spread of non-enveloped viruses
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Tyro3、Axl和Mer是组成TAM受体家族的受体酪氨酸激酶。这类最初被鉴定为孤儿受体的分子并不结合生长因子，而是结合可调控吞噬作用、抑制先天炎症免疫反应等过程的配体。包膜病毒可通过凋亡模拟这一机制劫持TAM受体实现病毒进入，该过程的核心是病毒利用暴露的病毒
Tyro3、Axl和Mer是组成TAM受体家族的受体酪氨酸激酶。这类最初被鉴定为孤儿受体的分子并不结合生长因子，而是结合可调控吞噬作用、抑制先天炎症免疫反应等过程的配体。包膜病毒可通过凋亡模拟这一机制劫持TAM受体实现病毒进入，该过程的核心是病毒利用暴露的病毒脂质双层包膜上的磷脂酰丝氨酸（PtdSer）“欺骗”靶宿主细胞通过内吞作用摄取病毒。尽管包膜病毒利用凋亡模拟实现进入的机制已较为明确，但非包膜病毒如何通过磷脂酰丝氨酸受体（如TAM受体）进入宿主细胞仍不清楚。现有证据表明，非包膜病毒可劫持宿主细胞信号通路，使其病毒颗粒被膜结构包裹，形成“拟包膜”病毒，进而通过一种“拟凋亡模拟”机制进入宿主细胞。这类拟包膜病毒可通过非裂解机制传播，以此逃避宿主免疫应答并将病毒颗粒递送至靶宿主细胞。本综述汇总了越来越多的证据，表明TAM受体可能通过非特异性结合膜上的磷脂酰丝氨酸参与这一过程，最终介导包裹在磷脂酰丝氨酸富集的细胞外囊泡中的非包膜病毒发生内化。
引言
细胞间通讯调控机体稳态、发育及疾病进展等关键过程，该过程通常由配体与膜受体结合启动，并在细胞内传递信号级联反应，介导影响细胞形态与功能的应答。受体酪氨酸激酶（RTK）是可结合生长因子、激素、细胞因子等配体，调控细胞及代谢信号通路的重要膜受体家族，最早被发现可作为胰岛素和表皮生长因子（EGF）的受体，目前已成为解析细胞信号通路的模式受体。
TAM受体是RTK家族的亚家族，名称来源于三个成员的首字母：Tyro3、Axl和Mer。20世纪90年代初，TAM受体因激酶结构域的PCR克隆结果被归为Tyro3/7/12簇，随后全长cDNA的分离使其被归类为结构独特的“孤儿”RTK家族。后续研究发现TAM受体可与生长停滞特异性基因6（Gas6）、蛋白S（Pros1）结合并被激活，此外还发现TUBBY、TUBBY样蛋白（TULP-1）、半乳糖凝集素-3（Gal3）、肌肉分泌蛋白feimin等潜在配体，其中feimin与Mer结合后可通过激活Akt促进葡萄糖摄取并抑制糖异生，但多数潜在配体的结合与功能仍有待进一步研究。
与其他RTK不同，TAM受体在胚胎发育中无必需功能，单敲除小鼠出生后2~3周仍可存活且具有生育能力；但双敲除或三敲除小鼠虽发育正常，却存在胞葬作用缺陷，无法清除凋亡细胞，伴随凋亡细胞累积、多组织淋巴细胞活化、促炎细胞因子水平升高及自身抗体产生，最终发展为类似人类系统性红斑狼疮、银屑病、类风湿关节炎、肾炎、多发性硬化症等自身免疫病，同时还会出现视网膜色素上皮光感受器节段吞噬清除障碍导致的失明，以及支持细胞吞噬活性受损引发的雄性不育。
TAM受体表达于哨兵免疫细胞、血管内皮细胞、神经元与胶质细胞，以及专职吞噬的免疫、神经、生殖系统细胞表面，主要功能为促进正常细胞周转产生的凋亡细胞的“稳态”或无炎症反应吞噬清除，并抑制吞噬细胞和哨兵细胞的先天炎症免疫反应。TAM受体表达异常与癌症、自身免疫病等多种疾病的发生发展相关，同时其诱导表达会增强带有宿主来源脂质双层包膜的致病病毒的进入效率。目前包膜病毒利用TAM受体的机制已较为明确，但不含宿主来源脂质双层包膜的非包膜病毒是否也可利用TAM受体及其配体实现进入仍不清楚。本综述将聚焦现有关于TAM受体在包膜与非包膜病毒感染及传播中作用的文献展开讨论。
TAM受体与配体的结构和功能
TAM受体经糖基化、磷酸化、泛素化等翻译后修饰后，成熟全长人Tyro3和Axl的分子量为100~140 kDa，Mer的分子量为165~205 kDa。与其他RTK类似，TAM受体由胞外域、跨膜域和保守的细胞内激酶域组成，其激酶域内存在保守序列KW(I/L)A(I/L)ES，是与其它RTK区分的关键特征。胞外域氨基端包含串联免疫球蛋白（Ig）样重复序列，其后为串联纤连蛋白Ⅲ型（FNIII）重复序列，负责配体结合；再往后是单次跨膜结构域，穿过质膜后与具有催化活性的细胞内酪氨酸激酶域连接。激酶域的激活环含有3个酪氨酸残基，是受体磷酸化的位点。配体与TAM受体结合后会触发受体与配体二聚化或聚集，随后发生激酶域的交叉磷酸化，继而发生激酶域、近膜区和羧基端的二次反式磷酸化，招募细胞内底物启动下游信号通路。
Gas6和Pros1是维生素K依赖性蛋白，预测分子量分别为75 kDa和73 kDa，二者结构高度同源，均包含氨基端γ-羧基谷氨酸（Gla）域、凝血酶敏感环区及4个后续的EGF样域，区别在于Gas6存在对丝氨酸蛋白酶切割不敏感的二硫键桥接的拇指环，而Pros1无此结构。两种配体的羧基端为2个层粘连蛋白G重复序列，组成性激素结合球蛋白（SHBG）域，是TAM受体结合与磷酸化的核心区域。Gas6对Axl和Tyro3的结合亲和力更高，可达个位数至两位数纳摩尔级别，对Mer的亲和力较低；Pros1则优先结合Tyro3，对Mer的亲和力较弱且结合范围更宽，现有研究多认为Pros1不结合Axl，但部分研究显示其可影响Axl的表达。
真核细胞质膜的磷脂分布具有不对称性：内层主要含磷脂酰丝氨酸（PtdSer）和磷脂酰乙醇胺（PtdEtn），外层主要含磷脂酰胆碱（PtdCho）和鞘磷脂（SM），该分布由翻转酶、floppase和scramblase等磷脂转运酶活性维持。细胞发生凋亡时，PtdSer会从质膜内层 redistrib到外层，标记细胞进入被吞噬状态。
吞噬凋亡细胞过程中，TAM受体与其配体在吞噬细胞表面形成“吞噬突触”：Gas6/Pros1的羧基端SHBG域结合TAM受体胞外域的Ig样重复序列，诱导受体寡聚化及细胞内酪氨酸残基交叉磷酸化，启动信号通路促使吞噬细胞发生吞噬。Gas6/Pros1氨基端Gla域的维生素K依赖性γ-羧基化是Ca2+结合的必要条件，也是TAM受体完全激活的前提，未羧基化或Gla域截短的配体虽可结合受体但无法激活TAM受体。完全激活的TAM受体-配体复合物可结合靶凋亡细胞表面的“吃我”信号PtdSer，触发肌动蛋白细胞骨架重塑的信号级联，介导靶向内化。
TAM受体信号还在调控先天炎症免疫反应中发挥重要作用。Toll样受体和I型干扰素（IFN）信号可激活巨噬细胞、树突状细胞等吞噬细胞的TAM受体信号，该信号失调会导致慢性炎症甚至自身免疫病。TAM受体通过免疫抑制作用防止失调：巨噬细胞和树突状细胞中Axl与I型IFN受体（IFNAR）共表达可抑制先天炎症免疫反应，该机制已在树突状细胞中被证实——Axl与IFNAR异源二聚化可诱导细胞因子信号抑制因子1（SOCS1）和3（SOCS3）的基因表达，抑制促炎细胞因子释放，促进免疫抑制。
包膜病毒通过凋亡模拟实现传播
已有明确证据表明TAM受体参与包膜病毒感染过程。包膜病毒含有源自宿主细胞的脂质双层包膜，表面通常装饰有病毒糖蛋白，可介导病毒附着并通过内吞或病毒包膜与宿主质膜融合实现进入。埃博拉病毒、马尔堡病毒（丝状病毒科）、寨卡病毒、登革病毒（黄病毒科）、拉沙病毒（沙粒病毒科）等多种包膜病毒已被证实可利用TAM受体促进感染。
包膜病毒主要通过凋亡模拟机制利用TAM受体进入宿主细胞。该机制最早在乙型肝炎病毒感染的肝细胞中提出：感染肝细胞产生的乙型肝炎表面抗原非感染性亚病毒颗粒富含PtdSer，可帮助病毒逃避免疫清除。PtdSer是凋亡细胞的吞噬清除标记，包膜病毒可将PtdSer整合到自身宿主来源的脂质双层包膜外层，模拟凋亡细胞状态，“欺骗”吞噬细胞吞噬病毒。
凋亡模拟的利用依赖于PtdSer和/或PtdEtn在病毒包膜外层的分布，包膜病毒已进化出多种机制促进PtdSer和PtdEtn从质膜内层向外层重排，以提升子代病毒的凋亡模拟能力。例如埃博拉病毒感染可激活scramblase跨膜蛋白16F（TMEM16F）促进PtdSer外翻；若凋亡诱导的scramblase XK相关蛋白8（XKR8）缺失，产生的埃博拉病毒粒子感染性更低，包膜PtdSer含量也更少。
凋亡模拟过程中，TAM受体并不直接作为病毒受体，而是由Gas6和Pros1作为桥接分子，连接病毒包膜与表达TAM受体/配体复合物的靶宿主细胞。包膜病毒仍需通过其自身的主要受体完成进入与后续感染，而TAM受体的间接利用及激活后的先天炎症免疫反应抑制，可共同促进病毒复制与免疫逃逸。所有三种TAM受体均可作为埃博拉病毒和马尔堡病毒的进入因子：原本抵抗丝状病毒感染的淋巴样细胞在诱导异位表达TAM受体后，可被携带丝状病毒包膜糖蛋白的假病毒成功感染，而使用靶向全长及可溶性TAM受体和Gas6的抗体处理可消除这种感染性增强效应；Axl突变体功能研究也证实，丝状病毒通过Axl介导的感染依赖Axl的生理功能。此外，Gas6和Pros1还可作为桥接分子，连接辛德比斯病毒（披膜病毒科）包膜假型慢病毒载体的PtdSer与靶细胞的Axl；登革病毒感染性也可被HEK293T细胞表达的Tyro3和Axl增强，推测是Gas6结合病毒包膜的PtdSer后介导病毒被Tyro3或Axl识别。寨卡病毒包膜的PtdSer含量高于登革病毒和西尼罗河病毒，因此更易结合Gas6。
除RNA基因组包膜病毒外，痘病毒科的DNA病毒 vaccinia病毒也可利用凋亡模拟。vaccinia病毒复制过程中产生的细胞内成熟病毒（MV）粒子来自宿主细胞内膜，通过细胞裂解释放，大小与凋亡细胞相近且膜含PtdSer，可通过巨胞饮进入细胞，凭借模拟凋亡细胞的特征实现潜在免疫逃逸；而含有高尔基体或早期内体来源额外包膜的胞外包膜病毒（EEV）粒子可利用人Gas6（hGas6）进入宿主细胞，用抗Axl抗体或膜联蛋白V（ANX5）处理人微血管内皮细胞可阻断hGas6介导的EEV感染增强。
除TAM受体外，其他PtdSer受体也参与病毒进入过程。T细胞免疫球蛋白粘蛋白（TIM）家族蛋白可调控自身免疫与过敏性疾病的发生，同样作为PtdSer受体，可在正常细胞中增强TAM介导的吞噬作用；稳定表达TIM1和TIM4的HEK293T细胞对登革病毒的易感性显著高于野生型细胞，且抗TIM1和抗Axl抗体可减弱感染增强效应，提示登革病毒需要TIM和TAM受体共同识别PtdSer以实现感染；TIM1还参与埃博拉病毒感染，异位表达TIM1可增强埃博拉病毒感染，而阻断TIM1与PtdSer结合的ARD5单克隆抗体可抑制病毒结合与感染。CD300a是CD300家族的磷脂受体，可直接结合登革病毒粒子并通过网格蛋白介导的内吞作用增强病毒进入，HEK293T细胞中该作用可被证实，抗CD300a抗体也可部分抑制巨噬细胞中的登革病毒进入。乳脂肪球-EGF因子8蛋白（MFG-E8，又称lactadherin）是可启动凋亡细胞吞噬清除的PtdSer结合蛋白，虽可结合轮状病毒并阻止感染，但也被发现可增强假病毒粒子进入，成为包膜病毒进入的增强因子，目前尚不清楚这些由CD300a和MFG-E8介导的病毒进入过程是否有TAM受体与配体参与。
PtdSer受体在促进病毒进入的同时也可限制病毒传播：表达PtdSer受体的细胞可结合新出芽的病毒粒子并阻止其释放，类似tetherin将出芽的人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）粒子“拴”在细胞表面的作用。共转染HIV-1前病毒DNA和TIM1质粒的HEK293T细胞表面积累的成熟HIV-1粒子多于未表达TIM1的细胞，且该效应在PtdSer结合缺陷的TIM1突变体中显著减弱；病毒编码的负调控因子（Nef）蛋白可通过诱导TIM1等TIM受体内化抵消该抑制作用。基孔肯雅病毒感染中也观察到类似现象：宿主细胞表面表达TIM1会显著降低病毒粒子释放，仅TIM1敲除或改变脂质组成可恢复释放效率。这表明PtdSer结合受体（如TIM和TAM）对病毒进入的作用可能是促进也可能是抑制，具体取决于病毒种类，而病毒感染诱导的免疫应答差异也可能决定PtdSer结合受体对病毒进入的作用方向。
非包膜病毒通过囊泡介导的整体传播
目前学界日益关注TAM等PtdSer受体在非包膜病毒进入中的作用，尽管其在包膜病毒进入中的角色已较为明确，但越来越多证据表明非包膜病毒也已适应利用PtdSer受体促进靶宿主细胞进入。非包膜病毒离开宿主细胞时通常不会获得脂质双层包膜，但部分非包膜病毒可劫持细胞外泌体机制，在细胞间启动感染，这类拟包膜病毒含有带PtdSer的膜结构，可通过PtdSer受体实现进入，该传播模式被称为“囊泡介导的整体传播”。这种传播模式可使多个病毒基因组同时进入靶宿主细胞启动有效感染，还能帮助病毒逃避免主免疫应答，通过非裂解传播增强毒力。多数病毒执行裂解复制程序，通过出芽和后续细胞裂解实现传播，但也有部分病毒采用非裂解程序，在不裂解细胞的情况下实现传播。
多种非包膜病毒已被证实可利用细胞外囊泡作为增强毒力的额外进入机制。JC多瘤病毒（多瘤病毒科）是进行性多灶性白质脑病的致病DNA病毒，可产生含有感染性粒子的细胞外囊泡，保护病毒免受抗体中和，且无需依赖乳糖系列四糖C和5-羟色胺这两种病毒进入受体即可实现传播。胃肠道RNA病毒轮状病毒和诺如病毒（杯状病毒科）也可被包装进细胞外囊泡实现整体传播：含轮状病毒粒子的细胞外囊泡源自质膜，含诺如病毒的囊泡则源自含PtdSer的多泡体，通过外泌体途径释放，两类拟包膜病毒均可通过粪口途径排出并保持感染性。戊型肝炎病毒（戊肝病毒科）在血液中以拟包膜形式循环，非包膜形式则通过粪便排出；拟包膜戊型肝炎病毒通过网格蛋白介导的内吞作用劫持内吞途径进入细胞，运输至溶酶体酸性区室降解拟包膜粒子后再发生穿入，虽然仍具感染性，但因缺乏病毒附着蛋白，所需接种时间长于非包膜形式。
甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒（小RNA病毒科）等非包膜病毒也被证实可利用该传播机制。甲型肝炎病毒可将自身包裹在与外泌体高度相似的细胞膜结构中，用抗衣壳抗体处理可消除这类拟包膜甲型肝炎病毒粒子的复制，这种劫持宿主细胞膜实现保护与传播的特性，本质上消除了包膜病毒与非包膜病毒之间的界限。脊髓灰质炎病毒是引起脊髓灰质炎的肠道病毒，感染期间会重塑细胞内膜和脂质池，形成富含磷脂酰肌醇-4-磷酸（PtdIns4P）和胆固醇的复制细胞器，在其中完成病毒复制与组装，随后被包装进内质网来源的自噬体，这类自噬体呈微管相关蛋白1A/1B轻链3B（LC3）阳性，且富集PtdSer，每个自噬体约包裹20~30个未成熟脊髓灰质炎病毒粒子，在向质膜运输过程中随腔内酸化逐渐成熟；与典型自噬体不同，这类自噬体不与溶酶体融合，而是与质膜融合，将脊髓灰质炎病毒粒子以LC3阳性、PtdSer富集的细胞外囊泡形式释放。
脊髓灰质炎病毒等肠道病毒在宿主中利用非裂解传播的程度尚不明确，但宿主自噬通路对该传播机制至关重要。脊髓灰质炎病毒被认为是典型的裂解病毒，但用自噬刺激药物洛哌丁胺和尼卡地平处理可增强其体外非裂解传播，且体内毒力更强，而用RNAi沉默LC3表达可消除这种增强效应，进一步证实脊髓灰质炎病毒非裂解传播依赖自噬。近期研究证实，脊髓灰质炎病毒编码的非结构蛋白3CD可介导非裂解传播：一方面调控自噬体形成，另一方面介导病毒粒子向自噬体中的包装及运输，最终促进包裹病毒的自噬体与质膜融合后通过胞吐作用释放；若突变3CD的LC3相互作用区域，会严重阻碍非裂解传播，既无法将病毒粒子整合进LC3阳性自噬体，也无法介导粒子向质膜运输。
TAM受体在非包膜病毒非裂解传播中的作用
尽管尚未得到确证，但越来越多证据表明TAM等PtdSer受体可能参与非包膜病毒的非裂解传播。寨卡病毒研究中发现，含PtdSer的细胞外囊泡可与Axl共定位，竞争性干扰病毒通过凋亡模拟进入，且结合囊泡的Axl会随囊泡一起发生内化，这提示包裹在含PtdSer细胞外囊泡中的非包膜病毒粒子，有可能与共定位的活化TAM受体/配体复合物结合，诱导囊泡-受体复合物内化从而实现病毒进入。
目前已发现两种可与PtdSer受体互作的非包膜病毒：甲型肝炎病毒和小鼠诺如病毒。早期研究认为TIM1可通过抗TIM1单克隆抗体阻断病毒进入，从而辅助甲型肝炎病毒进入，但后续证实TIM1对拟包膜或裸露甲型肝炎病毒粒子的进入并非必需，其可能仅协助拟包膜甲型肝炎病毒粒子内化，并将裸露粒子运输至内吞通路的不同区室；另有证据显示，TIM1可与胆固醇转运蛋白尼曼匹克病C1型（NPC1）协同，通过网格蛋白介导的内吞作用将包裹甲型肝炎病毒粒子的外泌体递送至宿主细胞。细胞水平和动物水平的小鼠诺如病毒感染均证实由CD300家族成员CD300lf介导：不同小鼠诺如病毒毒株感染野生型BV2小胶质细胞后可引发细胞病变效应，而CD300lf缺陷细胞无此现象；通常不感染小鼠诺如病毒的HeLa细胞在过表达CD300lf后对感染易感；表达CD300lf的小鼠可被不同小鼠诺如病毒毒株感染，部分小鼠粪便中可检测到病毒基因组。但人CD300lf并非人诺如病毒感染所必需，也不会阻止人诺如病毒样粒子与宿主细胞聚糖的结合。其他非包膜病毒也可能直接或间接利用PtdSer受体及其他非天然受体实现进入，但是否会通过细胞外囊泡进行非裂解传播仍不明确。
非包膜病毒进入过程中还需考虑TAM受体与病毒天然进入受体的协同作用。严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）等包膜病毒已被证实，在宿主细胞低表达血管紧张素转换酶2（ACE2）这一天然进入受体时，可利用TIM（TIM1和TIM4）和TAM（Axl）家族的PtdSer受体增强进入；且SARS-CoV-2的病毒附着蛋白并不直接与Axl互作，而是Axl结合病毒包膜上的PtdSer，类似凋亡模拟机制。这说明当病毒所处环境不利时，可能改变进入策略，优先通过PtdSer受体（如TAM受体）启动附着与进入，条件适宜时再协同天然进入受体完成感染，或在建立有效感染后仅依赖天然进入受体。这一规律可能也适用于非包膜病毒——这类病毒已进化出囊泡介导的整体传播等非裂解机制来促进感染与扩散。其他可能影响非包膜病毒利用TAM受体进行非裂解传播的因素还包括TIM等其他PtdSer受体的活性、肌动蛋白细胞骨架、活化配体的丰度，以及包裹非包膜病毒粒子的细胞外囊泡的PtdSer含量。
PtdSer含量已被证实是决定部分包膜和非包膜病毒感染与传播的关键因素：寨卡病毒包膜PtdSer含量更高，因此比包膜PtdSer含量更低的登革病毒和西尼罗河病毒更易结合TAM活化配体Gas6。由此推测，含PtdSer的细胞外囊泡包裹非包膜病毒后，可与TAM受体结合，通过“拟凋亡模拟”机制启动进入，实现细胞间的非裂解传播。这种涉及PtdSer和TAM受体的非裂解传播，可帮助非包膜病毒逃避免主免疫应答，同时为靶宿主细胞提供足够量的病毒以建立有效感染，或可解释部分非包膜病毒毒力较高的原因。
