综述：基于天然质谱的气相小角X射线散射在蛋白质结构解析中的应用

《Biochemical Society Transactions》：Native mass spectrometry meets X-rays for the elucidation of protein structures

　　

小角X射线散射（SAXS）是一种强大且广泛使用的结构生物学技术，可用于在溶液状态下（即无需结晶或低温条件）获取结构信息。然而，当样品存在异质性、构象混合物或聚集时，其应用受到限制。虽然现代生物SAXS（BioSAXS）常规采用在线纯化（例如，尺寸排阻色谱-小角X射线散射，SEC-SAXS）来处理异质性问题，但以天然质谱（nMS）作为样品输送方法实现的气相SAXS，通过提供明确且质量选择后的离子群，提供了更高程度的群体选择性。这种方法的主要挑战在于气相中固有的低粒子密度。在本综述中，研究人员展示了气相SAXS对病毒非结构蛋白和衣壳的模拟，并将其与原型GroEL的衍射图案进行了比较。研究人员评估了在实验现实条件下预期的散射信号，并讨论了在同步辐射光源和X射线自由电子激光（XFEL）上的潜在实施方案和用例，从而概述了气相SAXS可能成为结构研究中一种可行的补充工具的适用领域。

引言

结构与功能密切相关，驱动着确定蛋白质结构和获取机制洞察的广泛研究。小角X射线散射（SAXS）可在近天然条件下提供生物分子的溶液结构信息，补充了晶体学等高分辨率方法和冷冻电镜（cryo-EM）等较新的技术。随着同步辐射自动化和光束线性能的进步，SAXS在生物学中的应用已显著扩展。本工作概述了如何通过对气相生物分子进行散射，将SAXS扩展到高度异质的系统。这种能力在考虑蛋白形态时尤其有价值。由于平衡、基因剪接或可变的修饰模式，它们共存导致的异质性使得晶体学、cryo-EM和传统的溶液SAXS变得复杂，而溶液SAXS对尺寸混合物特别敏感，因为记录的SAXS信号是所有物种的平均值，从而限制了可解释性。

气相SAXS通过与天然质谱（nMS）集成，通过实现尺寸和构象选择性的样品输送，提供了显著优势，同时在很大程度上保留了类溶液的生物分子结构。气相SAXS的一个特殊优势是样品周围没有溶剂，这减少了背景从而提高了对比度，并显著减轻了溶液中自由基诱导聚集引起的辐射损伤。在气相中，辐射损伤需要多个同时发生的电离事件，而根据X射线吸收截面估计或在nMS-X射线光谱实验中观察到，这在同步辐射光源中可以忽略。

生物分子气相SAXS的主要限制在于与X射线相互作用区域的低粒子密度。这可以部分通过提高离子束密度的技术或利用现代X射线源（即X射线自由电子激光，XFEL）的高亮度来缓解。XFEL已被用于溶液中超稀释（<0.1 mg/ml）样品的SAXS测量，目前正在探索用于气相单粒子成像（SPI）方法。与SPI相比，气相SAXS不需要紧密聚焦的X射线束和数百万个高质量命中（hit）的选择，因为每个脉冲探测大量生物分子集合，并对信号有同等贡献。虽然由此产生的衍射图案包含的结构信息少于SPI，但由于其对离子束和X射线束的要求较低，气相SAXS在实验上要求较低。SAXS中的总散射信号由气相中生物分子的数密度、相互作用体积和入射光子总数决定。在典型条件下，当离子束的横截面超过X射线束时，更大的X射线焦点会减少每个生物分子的散射，但被照射到的更多粒子数量所补偿。这可以通过减少对生物分子的辐射损伤提供优势，这对于较小的（<100 kDa）蛋白质复合物尤其重要，而这些复合物对于基于X射线的SPI实验来说仍然太小。

在实验上，所需的离子束参数可通过使用如MS SPIDOC原型等样品输送系统来获取。该系统最初为SPI实验开发，采用纳升电喷雾电离（nESI）将结构完整的生物分子复合物转移到气相。它整合了一个基于空气动力学透镜的离子传输接口，将大生物分子的离子束密度提高了一个数量级以上。此外，它集成了MS组件，包括数字控制离子过滤器和离子阱，以及用于离子淌度的漂移池，所有这些都针对大生物分子复合物进行了专门优化。最后，通过电场在高真空条件下将离子传输到相互作用区域，无需种子或聚焦气体。

当前挑战

气相衍射实验（如SAXS）的主要挑战来自于离子束相关的极低样品密度。在这种状态下，气相样品输送系统（通常需要种子气体，如超音速气体射流或空气动力学透镜）通常受到载气本身的限制。此外，高真空环境中存在残余气体，可能会产生显著贡献并成为主要背景。这尤其适用于SAXS，因为在小的散射角度下，单个粒子的散射大致与其电子数的平方成正比，而粒子集合的总散射强度与粒子数量成线性关系。因此，沿整个X射线光束路径存在的残余气体分子会产生大量检测到的背景光子。相比之下，生物分子离子表现出更大的单粒子散射截面，但仅在小的相互作用区域内与X射线束相互作用。因此，可实现的信噪比受到整体真空度、X射线束准直、相互作用区域上游寄生X射线散射的抑制以及相互作用点附近直射光束的有效阻挡的强烈影响。这些因素直接影响达到可检测信号所需的曝光时间和光束强度。然而，在稍有不同的条件下（即在离子阱中储存非天然喷雾的生物分子），在同步辐射源上进行气相SAXS的可行性已得到证明。

模拟的SAXS衍射图案与讨论

图1显示了经过处理的SARS-CoV部分多蛋白的异质性质谱图，由单体和非结构蛋白（nsp）的二聚体组成，改编自参考文献。不同的电荷态用数字表示，各种物种用不同颜色高亮。这种异质性质谱在生物系统中很常见，常构成nMS实验的基础，因为不同物种之间复杂的相互作用为理解潜在的生物过程提供了宝贵的见解。利用MS技术（如四极杆质量过滤器、离子淌度或电荷态还原）可以调整电荷态分布，隔离质谱图中的单个或多个相邻峰，并进一步基于构象分离离子。这些纯化后的样品可作为SAXS实验的理想起点。

图2显示了三种代表性尺寸范围的蛋白质复合物的模拟SAXS衍射图案，即由nsp7-11组成的（未加工的）SARS-CoV-2部分多蛋白、更大的伴侣蛋白GroEL和GII.2雪山病毒的空T= 1（三角剖分数）诺如病毒衣壳。表1总结了通过nMS确定的GroEL、nsp7-11以及不同变体T= 1诺如病毒衣壳的实验观察到的最丰富电荷态。GroEL和T= 1颗粒的结构被视为气相结构，但基于先前通过X射线晶体学和/或cryo-EM确定的结构。nsp通过柔性连接子连接，阻碍了高分辨率技术的应用。nsp7-11的结构模型目前是通过AlphaFold 2（AF2）和AlphaFold 3（AF3）获得的，产生了竞争性模型。

SAXS衍射图案是使用CONDOR模拟包计算的，采用了代表性的光束线参数，包括10 keV的光子能量和放置在距离样品4.5米处的大面积光子计数探测器，可获取高达q= 3.8 nm^-1的散射矢量。误差条表示基于pyFAI Python包实现的泊松误差模型的标准误均值（SEM）。在此框架内，不确定性仅取决于估计的离子束密度和入射X射线脉冲能量。为了评估大型设施有限时间内实验的可行性，模拟的强度被缩放到在同步辐射源上10（1）小时的采集时间，其中10小时代表了可实现的目标光束时间。相比之下，在欧洲XFEL的模拟中假设了100（10）分钟，以说明在自由电子激光器中相对较短的测量时间内的性能。括号中的数值对应于最近的仪器发展，通过提高溶液到气相的传输效率显著增加了nMS中的离子束密度，正如MS SPIDOC中所实现的。

首先考虑同步辐射的情况，模拟表明，在同步辐射源上进行气相SAXS可以解析生物分子的整体尺寸和形状，例如，可以获取其全局结构域组织的信息。相比之下，区分更细微的结构差异（例如本文考虑的两种AlphaFold模型之间的差异）在估计的实验条件下似乎不可行。然而，基于同步辐射的气相SAX S提供了比离子淌度MS等技术更多的结构信息，因为后者仅报告单一取向平均的碰撞截面。通过捕获完整的散射剖面，SAXS衍射图案能够更好地区分替代构象或组装状态。

总体而言，模拟结果与预期的较大生物分子复合物在低q值下具有更高散射强度相符。它们也表明较小生物分子的SEM会增加，这应谨慎解读。这里应用的相对密度缩放假设了恒定的离子电流，而在天然MS中，分子质量与体积成正比，电荷态与表面积成正比。因此，在这种假设下，较大的生物分子固有地产生更强的散射信号，从而导致相应地更低的SEM。这并不一定反映生物分子真实的相对离子束密度，由于其强烈依赖于实验条件（如浓度、电离效率或依赖于m/z的仪器传输函数），难以先验估计。值得注意的是，在同步辐射下对nsp7-11的模拟低估了离子阱中气相SAXS可实现的性能；参见报道的实验结果。其中，甚至更小的细胞色素c离子（约12 kDa）在非天然条件下电喷雾并在离子阱中探测，产生了可测量的散射信号。

在XFEL（如欧洲XFEL）上进行的气相SAXS实验可以将这项技术扩展为结构生物学中一个非常强大的工具，因为它们能够检测细微的结构差异。这种能力以nsp7-11的两个不同AlphaFold模型（AF2和AF3）为例，它们产生了统计学上可区分的散射剖面，误差条小于符号尺寸。与模拟相结合，这些测量将允许在相对较低的散射分辨率下获得对三级结构排列的结构洞察。

图2中的模拟代表了一个理想化的场景，其中背景贡献被忽略，并且假设了固定的生物分子结构。实际上，生物分子（尤其是多蛋白）是柔性的，可能采用多种构象，因此测量到的散射将代表一个整体平均值，而不是单一结构。残余气体和寄生光束线效应的散射也会降低可实现的信噪比，尤其是在低q值下。表1报告了在给定离子束密度下，每毫焦耳入射脉冲能量的衍射光子数，而不是应用通用的背景模型。这些数值为在光束线特定条件下估算每个散射角度可容忍的背景同时仍能获得可测量信号提供了基础。

结论与潜在科学应用

从我们的模拟和报道的实验来看，研究人员推断开发基于MS的气相SAXS用于衍射实验有潜力成为结构生物学的一个有用工具。同步辐射源被视为主力工具，可用于确定生物分子的整体尺寸和构象。另一方面，XFEL可以提供非常有针对性的信息，例如结合位点，特别是与基于AI的结构预测模型（如AlphaFold）结合时。为了更具体地说明在同步辐射源或XFEL上进行气相SAXS的潜力，除了模拟的系统外，研究人员还重点介绍了四种特定类型的系统，该技术的发展将对它们产生特别显著的影响。

以诺如病毒为例的病毒组装中间体

诺如病毒组装成二十面体衣壳，其中三角剖分数T定义了亚基数量和准等价位置。天然颗粒是T= 3，具有180个VP1（主要衣壳蛋白）拷贝，但在碱性条件下或N端截断后可形成T= 1颗粒。天然离子淌度MS已探测了组装中间体，其碰撞截面与部分五聚体顶点最匹配，暗示了合理的成核途径。这意味着T= 1和T= 3颗粒可能来自相似的成核事件，条件决定了最终的尺寸分布。然而，离子淌度的分辨率和可用结构模型有限。另一方面，溶液SAXS需要比nESI（<1 mg/ml）更高的（>1 mg/ml）蛋白质浓度，这可能导致动力学捕获状态。因此，目前尚不清楚牛诺如病毒SAXS报告的中间体是否在正确的组装路径上。结合AlphaFold等结构预测工具，气相SAXS可以更清晰地区分候选中间体，并改进对衣壳尺寸是在成核时固定还是在后期决定的理解。

淀粉样蛋白

淀粉样蛋白在形成原纤维的途径中形成多种寡聚中间体，小寡聚体被认为是神经病理学中的细胞毒性物种。虽然原纤维可通过cryo-EM研究，但早期寡聚体则不能，主要通过MS进行研究。将MS与气相SAXS结合，将为这些瞬态中间体以及具有不同结构的原纤维形成机制提供更好的结构洞察。

病毒糖蛋白

包膜病毒携带膜嵌入的糖蛋白，这些糖蛋白对附着、进入和融合至关重要。广泛的糖基化屏蔽了这些蛋白，使其免受免疫识别，但聚糖的灵活性阻碍了cryo-EM和X射线晶体学的结构分析。传统的SAXS可以探测聚糖整体，但受膜环境限制。使用隐型盘的小角中子散射可以解决这个问题，尽管它复杂且昂贵。nMS可以去除膜成分，实现对释放蛋白的结构表征，甚至可以直接从线粒体膜等进行表征。气相SAXS将通过提供不受膜干扰的全局结构信息来扩展这些能力。

人类血浆糖蛋白，如血清转铁蛋白

人类血清转铁蛋白转运Fe³⁺，含有19个二硫键和最多三个N-连接聚糖，并作为急性炎症生物标志物。基于MS的分析能够表征疾病相关糖型的血清转铁蛋白。因此，这将是一个有趣的气相SAXS测试案例，用于评估翻译后修饰（PTM）或单核苷酸多态性是否会引起可能导致表型改变的构象变化。目前尚不清楚聚糖结构在气相条件下如何受到影响。对电喷雾聚糖进行的软着陆实验和随后的扫描隧道显微镜显示，即使是轻微的活化也会引起结构重排，这表明糖蛋白的SAXS数据对实验条件敏感。SAXS比离子淌度等其他气相技术更深入地探测结构，因此是揭示聚糖在转移到气相时如何反应的有希望的方法。尽管聚糖结构具有挥发性，但电喷雾蛋白质被认为在接近其溶液构象时被动力学捕获，这意味着即使聚糖塌缩，它们对蛋白质构象的影响仍然存在。事实上，离子淌度MS已显示聚糖身份对糖基化DC-SIGN碳水化合物识别域的结构有显著影响。这个例子意味着气相SAXS可能是理解PTM与蛋白质结构之间相互作用及其在生物学中作用的途径。

展望

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  强调该领域的重要性：蛋白质构成复杂系统，存在多种共存的蛋白形式、化学计量和其他类型的异质性，这限制了结构生物学的常规技术。利用nMS中的非破坏性分离来输送蛋白质进行下游SAXS衍射，是从复杂混合物中解析特定蛋白质结构并更全面了解蛋白质系统结构复杂性的一种途径。
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  当前思考总结：问题在于，对nMS提供的稀释样品进行气相SAXS是否可行。本文提出的计算表明，此类实验确实可以在高度明亮的X射线源（如XFEL）以及第三代同步辐射源上进行。
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  未来方向评论：将nMS与SAXS结合，有潜力增进我们对许多蛋白质系统的认识。其影响将特别显著的例子包括：（I）多分散系统，包括自组装蛋白质，如病毒衣壳和淀粉样蛋白，其众多的组装中间体用X射线晶体学、cryo-EM和其他技术难以或无法捕获；（II）高度修饰的蛋白质，如糖蛋白，它们在病毒感染和许多其他与健康疾病相关的系统中起关键作用。为了实现此类研究，需要在同步辐射光束线上投入精力进行技术开发、测试和整合nMS驱动的SAXS。