综述：利用微晶电子衍射（MicroED）技术研究膜蛋白的结构与动力学

《Biochemical Society Transactions》：Membrane protein structure and dynamics probed by MicroED

　　

膜蛋白是细胞信号传导、运输和内环境稳定的关键，但其两亲性、对脂质或去垢剂的依赖性，以及通常困难的表达和纯化过程，使其成为X射线晶体学等结构生物学方法的困难目标。此外，人类蛋白质组中的大多数膜蛋白因分子量过小而无法通过单颗粒冷冻电子显微镜（single-particle electron cryomicroscopy）方法进行研究。微晶电子衍射（Microcrystal Electron Diffraction, MicroED）作为一种强大的方法应运而生，能够克服这些障碍，实现在脂质膜的近天然环境中，对嵌入其中的膜蛋白纳米晶体进行结构解析。在本篇综述中，我们讨论了MicroED技术的最新进展，例如聚焦离子束铣削（focused ion-beam milling）和高通量数据收集方法，如何促进了结构解析和蛋白质动力学研究。研究人员重点关注了连接形成蛋白、G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors, GPCRs）和离子通道等方面的应用。在这些领域中，MicroED揭示了通过其他结构生物学方法无法获得的、具有生理相关性的组装体、脂质相互作用以及瞬时功能状态。

膜蛋白带来的独特挑战

膜蛋白是许多生理过程的核心，包括信号传导和细胞稳态。在脂质双分子层中，它们作为受体、通道、转运蛋白和酶发挥作用。尽管只有约30%的人类基因组编码膜蛋白，但它们却是所有药物的最大作用靶点。超过三分之一的市售药物仅针对膜蛋白中的一个类别——G蛋白偶联受体（GPCRs）。尽管它们非常重要，但膜蛋白的实验性结构解析仍然很少。与可溶性蛋白相比，已报道的膜蛋白结构要少得多。膜蛋白给实验结构解析带来了特殊挑战。尽管结构预测（如AlphaFold）取得了显著进展，但膜蛋白由于其构象折叠依赖于脂质环境和当前算法未直接模拟的构象状态，仍然是一个特殊的难题。膜蛋白具有两亲性，拥有疏水的跨膜区域和亲水的结构域。这些生化特性使得膜蛋白在表达的每个阶段都极具挑战性。此外，膜蛋白通常具有极端的等电点，并且许多膜蛋白的功能需要天然脂质，而这些脂质常在纯化过程中丢失。与可溶性蛋白相比，可获得的蛋白量通常较低。鉴于这些挑战，使用单晶X射线衍射（SCXRD）的研究常常失败，因为这些实验需要大晶体和大量稳定的蛋白质。为了加速膜蛋白结构解析，冷冻电子显微镜（cryoEM）方法——单颗粒分析（SPA）已被广泛应用。然而，这种方法仅适用于有限部分的膜蛋白质组，因为绝大多数膜蛋白的尺寸远远低于SPA所能处理的下限。事实上，人类蛋白质组中膜蛋白的平均大小仅为约35 kDa，这低于SPA的可行范围。

MicroED：基本原理与方法学

MicroED是一种冷冻电镜（cryoEM）方法，它使用典型的透射电子显微镜（TEM）从微米或亚微米尺寸的晶体收集电子衍射数据。该方法可被视为电子显微镜和X射线晶体学的交叉：它使用电子而非X射线，但两者都依赖于晶体样品的衍射数据。电子与物质的相互作用比X射线强得多，即使微小的晶体也能产生可测量的衍射。此外，电子对晶体中的库仑势（电荷分布）敏感，而不是电子密度。这意味着，虽然SCXRD提供电子密度图，但MicroED提供电荷密度图，其中电荷、离子和质子很容易被分辨。例如，早期的MicroED研究发现，在约3 ?分辨率的库仑势图中可以揭示氢原子的位置，以及蛋白质和氨基酸侧链中金属离子的带电状态。MicroED数据收集涉及将微晶体冷冻，并在低温下将其暴露于低剂量电子束，同时在曝光期间连续旋转晶体。与SCXRD中的旋转方法类似，衍射数据作为连续旋转电影被捕获。信号和辐射损伤之间存在重要的相互作用：由于电子会迅速造成损伤，因此MicroED通常使用相对较低的电子剂量，这反过来导致信号较弱。每个晶体通常至少旋转20度，以便在没有晶胞尺寸或对称性先验知识的情况下进行指标化，并且通常合并多个晶体（或一个晶体的多个区域）的数据以获得完整的数据集。由此产生的衍射强度通过标准的晶体学软件进行处理，以指标化反射并确定结构因子振幅。MicroED在电子衍射方法中是独特的，因为它的数据可以使用标准晶体学软件进行处理。这是通过连续旋转数据收集实现的。MicroED数据的相位确定可以通过分子置换（通常使用同源结构）实现，或者对于高分辨率数据，可以通过直接法或从头计算方法实现。值得注意的是，分子置换最初是在使用水通道蛋白-0（AQP0）的二维晶体的电子衍射中建立的。制备MicroED样品是关键步骤，特别是对于膜蛋白。通常，使用专门的结晶方法，如脂质立方相（LCP）或双性分子（bicelles），为膜蛋白提供类似天然的脂质环境。或者，可以将膜蛋白整合到膜囊泡中，形成适用于电子衍射的晶片。将微晶溶液分配到TEM载网上，通常是带有孔的碳载网，经过辉光放电处理使其清洁并略带亲水性。为了将样品玻璃化并将晶体维持在低温，接下来将载网浸入液态乙烷中进行快速冷冻。如果晶体厚度超过约0.5 μm或嵌入粘性介质中，可以使用冷冻聚焦离子束铣削（cryo-FIB）将其减薄至合适的厚度。使用聚焦离子束，可以将冷冻晶体切削成理想厚度为150-300 nm的薄片。例如，扫描电子显微镜可用于识别在LCP中生长的大板状晶体；FIB随后在晶体周围开窗，并逐渐将其研磨至适当厚度。该过程已通过等离子体FIB的发展得到改进，等离子体FIB使用惰性气体离子（如氙或氩）来更均匀地铣削生物材料，且比传统的镓离子损伤更小。重要的是，有报道称氙和氩可以铣穿LCP中的粘性脂质膜，而镓只有在沉积高能量后才能做到，但这会破坏样品的结晶性。集成的荧光显微镜可用于定位在LCP中生长的蛋白质晶体，并进行光-电镜关联以指导铣削。在FIB铣削之后，将薄晶片转移到TEM中进行数据收集。MicroED数据采集涉及缓慢旋转载有晶体的样品台，同时用快速相机记录衍射图像。由于样品台在曝光期间旋转，电影中的每一帧都包含倒易空间中的一个楔形，这反过来允许在没有晶胞尺寸或对称性先验知识的情况下进行指标化，因为如果每个晶体收集至少20度的数据，这些参数可以通过实验确定。由于电子与原子之间的强相互作用，即使极小的晶体体积也能获得高分辨率反射。重要的是，虽然SCXRD和串行飞秒晶体学（SFX）使用了大量样品，但MicroED只需要单个晶体就能提供相同分辨率的结构。MicroED中的样品保持在冷冻水合状态，以提供更准确的反射并有助于减轻辐射损伤的影响。然而，辐射损伤积累很快；通常，总暴露量仅为约1 e?/?²就足以破坏二硫键、使蛋白质特征退化并限制可达分辨率。因此，通常使用快速灵敏的相机，使得在总暴露量小于1 e?/?²的情况下完成完整的数据收集，并允许以原子分辨率确定结构。即便如此，根据收集剂量的不同，衍射强度可能会随着晶体旋转而衰减，合并多个晶体的数据是解决结构的常用方法。最近的一份报告详细说明了MicroED实验的金标准。尽管存在这些挑战，MicroED已成为一种可行的方法，用于解析其他结构生物学方法无法获得的膜蛋白结构，并在多项研究中实现了令人印象深刻的分辨率，其中离子、配体、激活剂、抑制剂、质子化状态，甚至在某些情况下氢键网络都通过实验可视化。

连接形成膜蛋白

一些膜蛋白专门负责形成细胞间粘附。这些蛋白将两个细胞紧密连接在一起，有时会形成紧密的密封，甚至溶质的简单扩散也无法通过（如紧密连接）；有些形成仍允许通过细胞外空间扩散的细胞间粘附连接；而另一些则形成细胞间通讯连接，在相邻细胞之间创建连续的溶质交换路径。这些粘附蛋白类别的代表性成员已通过电子衍射实验确定结构，对于其中一些，只有电子衍射提供了生理相关的组装体。AQP0，也称为主要内在蛋白（MIP），是眼睛晶状体纤维细胞膜中的水通道，已知可形成粘附的11 nm薄细胞间连接。水通道通常形成通过生物膜的水高效渗透路径。第一个水通道蛋白（水通道蛋白-1）的结构是通过二维晶体的电子晶体学确定的。近十年后，AQP0的结构通过使用双层二维晶体的电子衍射确定。在这两种情况下，蛋白质都形成四聚体，并在脂质膜的天然环境中结晶，采用了水通道蛋白的典型结构。然而，在AQP0的情况下，当它在脂质双分子层中结晶时，还采用了意想不到的结构：它被发现在两个膜之间介导粘附连接，一个AQP0四聚体与相对双分子层中的另一个AQP0四聚体结合。由于AQP0是在双层膜中结晶的，它代表了通过非常薄的3D晶体（仅两层膜厚）进行电子衍射确定膜蛋白结构的第一个例子。该结构通过分子置换解析，是分子置换适应并应用于电子衍射研究的第一个例子。原子分辨率密度图首次在冷冻电镜中解析了有序的水分子，显示了原子性以及与蛋白质相互作用的完整脂质膜双分子层。有趣的是，AQP0的SCXRD研究虽然分辨率较低，但并未显示在晶状体纤维细胞中普遍存在的生理相关的11 nm薄粘附连接。详细分析还表明，脂质对膜蛋白稳定性很重要。这些观察结果强调了在脂质膜的近天然环境中研究膜蛋白的必要性，并为最终MicroED的发展铺平了道路。在AQP0研究之后，大脑中的相关水通道蛋白AQP4也通过电子衍射从双层二维晶体中解析，再次在其粘附连接形式下结晶。继这两个使用薄3D晶体的初步研究之后，第三个例子是来自连接蛋白26（Cx26）的三层二维晶体。连接蛋白是一类形成细胞间通讯连接的膜蛋白。与不形成连续细胞间水孔的AQP0粘附连接不同，连接蛋白连接（称为间隙连接）确实形成连续的细胞间孔，小肽和溶质可以自由通过细胞。在结构上，连接蛋白是小的膜蛋白，以四个跨膜螺旋穿过膜，并组装成六聚体。一个半通道可以与相对膜中的另一个半通道以头对头的方式对接，形成所谓的间隙连接。间隙连接对神经传递至关重要。Cx26的结晶是在脂质膜中实现的，就像水通道蛋白的情况一样。每个膜层包含一层有序的半通道，通过添加另一个膜层自发组装成间隙连接。晶体学对称性允许三层组装成一个薄3D晶体，从中收集电子衍射数据。第三种膜连接类型通过电子衍射进行了研究，特别是在MicroED出现并建立了使用连续旋转进行结构研究所需的方法学之后。紧密连接蛋白是形成细胞间紧密连接的膜蛋白，在细胞之间形成防水密封。尽管通过SCXRD和SPA在确定紧密连接蛋白结构方面做出了努力，但都无法提供完整紧密连接的结构。这可能是由于两种方法的共同方法：在SCXRD的情况下使用抗体片段来增强晶体接触，在SPA中用于增加颗粒质量以使其能够成像。然而，这个抗体片段阻止了连接的形成。完整紧密连接的生理相关结构最近通过紧密连接蛋白家族的一个远缘成员MP20的MicroED确定，这是通过实验确定的完整紧密连接结构的第一个例子。MP20是第二丰富的晶状体膜蛋白，其结构和功能几十年来一直难以捉摸。全长人源MP20的结构通过MicroED在3.5 ?分辨率下解析，使用了在LCP中生长的纳米晶体，蛋白质在脂质膜中结晶。在结构上，每个MP20单体形成4个跨膜螺旋，其N端和C端位于细胞质中。在跨膜螺旋1和2之间，它包含一个长的胞外环，折叠成暴露于细胞外空间的指状结构域。同样，一个胞外环也在胞外侧连接TM3和TM4。MP20组装成四聚体，每个四聚体与相对膜双分子层中的另一个四聚体以头对头的方式结合，形成紧密连接。相互作用主要由胞外环介导，整个连接厚度为11 nm。这些例子强调了在脂质双分子层的天然环境中研究膜蛋白的重要性；然而，这种方法在技术上很困难，需要像聚焦离子束铣削这样的专门方法。研究人员最近发布了使用FIB铣削膜蛋白晶体用于MicroED的分步指南。简而言之，在LCP中生长的晶体本质上是粘性的，是载网制备的困难样品，因为围绕纳米晶体的溶液太粘而无法轻易吸走。研究人员建立了一个使用荧光显微镜和FIB铣削的流程，以靶向LCP中的纳米晶体，并使用FIB为MicroED暴露它们。在MP20的情况下，蛋白质在结晶前被荧光标记。纳米晶体通过集成在等离子体FIB系统上的荧光显微镜通过荧光识别。研究人员建立的相关方法被用来引导FIB铣削周围的LCP，仅暴露一个200 nm薄的晶片用于MicroED。从这些晶体样品中，可以使用连续旋转MicroED确定MP20的结构。

G蛋白偶联受体

GPCRs（也称为7TM蛋白）是一组近1000个膜蛋白，它们作为受体整合来自激素、神经递质和其他配体的信号，产生细胞反应。GPCRs以是重要的治疗靶点而闻名，但由于上述原因，确定它们的结构很困难。最早被解析的GPCR结构之一是其细菌同源物——细菌视紫红质，其结构早在20世纪70年代末就通过电子晶体学确定。在结构上，GPCRs包含7个跨膜螺旋，通常在细胞质中与G蛋白形成复合物。大多数信号传导是通过G蛋白的激活发生的。因此，为了能够研究受体在与G蛋白结合进行信号传导之前的状态，研究受体本身很重要。这些受体往往很小，通常约为40 kDa，这意味着它们太小而无法通过SPA进行研究。确实，有几项使用SPA的研究报告，但总是在G蛋白复合物的背景下。研究受体本身完全是晶体学方法的领域，大多数SCXRD研究是使用在LCP中生长的纳米晶体完成的，以使蛋白质在脂质的天然环境中稳定。迄今为止，已有两种人源GPCR蛋白通过MicroED确定结构；一种是用作方法开发的标准蛋白，另一种是加压素1B受体，这是一种尽管多个实验室付出了大量努力，但仍无法通过其他结构生物学方法获得的新型GPCR结构。人腺苷A_2A受体是第一个使用MicroED解析的GPCR结构。A_2A在神经和心血管功能中发挥作用，它也是大脑中咖啡因的作用靶点。与拮抗剂结合的A_2A微晶体在LCP中生长，并按照上述方法经过FIB铣削处理后，通过MicroED以原子分辨率进行研究。在结构上，A_2A采用了GPCRs的典型7TM结构，在结合口袋中有清晰的拮抗剂密度，并且蛋白质表面有几个独特的胆固醇分子。事实上，由于蛋白质是在LCP中结晶的，观察到了包围受体并与之相互作用的近乎完整的脂质双分子层。随后的一项研究建立了一个更强大的流程，直接在LCP内部对晶体进行FIB铣削，允许在不进行海绵相转换的情况下进行MicroED数据收集，并从单个纳米晶体获得了2.0 ?分辨率的A_2A结构。MicroED获得的分辨率与其他人使用SCXRD和SFX获得的分辨率相同。主要区别在于样品要求：虽然SCXRD和SFX都使用了相当大的晶体，但SFX需要数毫升的晶体来解决结构，而MicroED只需要一个1 μm³的晶体。这个例子说明了MicroED在利用极其微小的晶体和极少量的材料阐明膜蛋白结构方面的能力，表明那些SCXRD或SFX无法获得的样品可能适合通过MicroED进行结构解析。这一点确实在另一个长期寻求的GPCR——人加压素1B受体上得到了证明。加压素1B受体是一个重要的药理学靶点，因为它主要表达于垂体前叶，参与应激、情绪调节和攻击行为。尽管几个实验室跨越数十年的研究付出了巨大努力，但V1BR的结构仍然难以捉摸。这主要是因为V1BR的晶体对于SCXRD来说太小，对于SFX来说又太稀疏。然而，它们是MicroED的理想样品。V1BR在LCP中结晶，其结构通过MicroED在约3.2 ?分辨率下解析。通过合并来自14个FIB铣削的晶片的数据创建了一个完整的数据集。所得结构揭示了V1BR的七螺旋束结构，并提供了对其配体结合口袋以及与相关受体差异的见解。该研究代表了一个里程碑，展示了MicroED确定先前未知的、超出其他结构生物学方法范围的GPCR结构的能力。

离子通道动力学

离子通道是调节离子水平和信号传导的膜蛋白。这些包括允许钠、钾、钙和镁等离子通过膜的通道蛋白，建立质子梯度，传播动作电位，并调节肌肉细胞功能。通常，离子通道允许离子沿其浓度梯度通过，尽管在某些类别中可能会使用能量，例如P型ATPase泵。第一个通过MicroED解析的膜蛋白结构是P型ATPase：来自骨骼肌肌质网的Ca²⁺-ATPase泵。该蛋白形成薄的二维晶体，然后组装成三维晶体，并已通过电子衍射研究了数十年。早期研究表明，可以从低温保存的Ca²⁺-ATPase样品中获得高质量的电子衍射；然而，从未从这些数据中确定结构，因为强度不准确。直到连续旋转MicroED出现，Ca-ATPase才通过电子衍射在适中的3.4 ?分辨率下确定。这是一项重大成就，因为它表明电子衍射可以用于解析甚至更大（约110 kDa）的膜蛋白的结构。ATPase的密度图质量足以构建原子模型，甚至能够分辨跨膜Ca结合位点中的两个结合的Ca²⁺离子及其电荷密度分布。这种直接观察离子静电势的能力是MicroED库仑势图的独特优势，并为泵的E1构象状态和离子配位提供了新的见解。尽管取得了这一成就，但Ca-ATPase之前已通过SCXRD在更好的分辨率下进行了研究；然而，它展示了MicroED克服困扰电子衍射领域数十年的技术困难的能力。第一个通过MicroED确定的新型离子通道结构是电压依赖性阴离子通道（VDAC），这是线粒体外膜中的一种β桶状离子通道，可调节代谢物通量和线粒体与细胞质之间的离子交换。虽然VDAC之前已通过SCXRD在结构上进行了研究，但由于晶体极小且无法生长得更大，其功能性突变体的结构一直无法获得。然而，该样品非常适合MicroED。MicroED被用于确定鼠源mVDAC1功能性突变体的结构，使用的是在双性分子中生长的晶体。晶体在冷冻电镜载网上几乎看不见，并且不适合传统的X射线衍射，因为它们浸没在粘性双性分子中，并且只长成极薄的片状。在将这些片状晶体铣削成适合MicroED的薄片后，记录了数据并解决了结构。VDAC折叠成典型的19链β桶排列，在其核心形成大的离子孔道，蛋白质N端α螺旋折叠到孔中，充当门。虽然该结构与通过SCXRD解析的VDAC结构相似，但观察到几乎完整的脂质双分子层包围VDAC并介导晶体接触。上述离子通道研究说明了MicroED分辨离子的能力，但该技术的真正力量在于其能够利用极其微小的晶体快速、高通量地以原子分辨率确定结构。最近一项使用非选择性离子通道NaK的研究，不仅说明了使用自动化高通量MicroED方法以原子分辨率确定离子通道的结构，而且还实验可视化了通道动力学。NaK是一个小的离子通道，包含在膜内组装选择性过滤器所需的最小组件。像更大的离子通道一样，它组装成四聚体，选择性过滤器位于组装的四重轴上。虽然NaK的结构已经通过SCXRD确定，但它在MicroED中被用来探测通道动力学。事实上，即使在第一份关于NaK的MicroED报告中，就捕获了一个以前未见的功能状态：在NaK选择性过滤器的入口处观察到一个部分水合的钠离子。这种瞬态状态早在几十年前就被预测用于钠通道，但直到完成MicroED研究才在结构上被捕获。在这份关于NaK的初步报告之后，建立了高通量方法，通过该方法可以自动靶向、衍射数百个纳米晶体并解析结构。这种方法最初是使用小分子建立的，后应用于NaK，并实验观察到通道动力学。确定了NaK及其突变体NaK2CNG的几种结构，并分类了孔中Na⁺离子的位置。这些结构允许对选择性过滤器中的几个不同离子结合位点进行实验测定，并确定了通道的门控和扩张机制。

展望

MicroED是一个相对较新的研究领域，因为该方法仅在过去十年中建立。在此期间，克服了几个障碍，该方法获得了发展势头，特别是在小分子研究和药物发现领域。MicroED已证明自己是一种强大的方法，能够利用极其微小的晶体和极少的材料，以原子分辨率解析那些超出SCXRD、SFX甚至SPA能力范围的样品的结构。虽然这里描述的方法侧重于膜蛋白，但同样可以应用于可溶性蛋白。对于膜蛋白，脂质双分子层的重要性不容忽视或低估——几个例子的数据似乎是一致的：应在脂质双分子层的近天然环境中研究膜蛋白，以便探测生理相关的功能状态。通过高通量方法，MicroED甚至可以探测动力学。随着更多设施的建立，MicroED技术的获取将增加，使研究人员能够找到直到最近仍超出其他结构生物学方法范围的问题的答案。