CryoClean技术：一种新型封闭式玻璃化系统，兼具高效性和无菌性，适用于胚胎的冷冻保存

《Cryobiology》：CryoClean technology: A novel closed vitrification system combining high efficiency and sterility for embryo cryopreservation

　　

摘要

胚胎玻璃化是辅助生殖技术（ART）的基石。传统的开放式系统虽然效率较高，但存在微生物污染的风险，而封闭式系统则更注重安全性，但冷却效率会受到影响。本研究介绍了一种创新的封闭式玻璃化技术“CryoClean”，该技术采用“先冷冻、后密封”的原则，使用无菌液态空气（含约14.5%的氧气）作为冷却剂，以弥补效率与安全之间的差距。CryoClean的冷却速度与直接浸入液氮的速度相当。微生物培养证实了所用液态空气的无菌性，而储存的液氮中检测到了Moraxella osloensis和Neomicrococcus aesculi。使用8细胞小鼠胚胎进行实验发现，CryoClean在解冻后存活率（100%对100%）、囊胚形成率（84.8%对83.9%）和孵化率（64.3%对65.4%）方面与开放式Cryotop方法相当（所有p值>0.05）。全基因组亚硫酸盐测序显示，两种玻璃化方法在CpG岛及其邻近区域的甲基化模式上没有显著差异。来自CryoClean玻璃化胚胎的后代在出生后的生长、器官重量、血清生化指标、心脏功能或生殖能力方面与来自新鲜胚胎的后代无差异（p值>0.05）。总之，CryoClean有效结合了开放式系统的高效率与封闭式系统的生物安全性，为解决临床ART中无菌胚胎玻璃化的效率瓶颈提供了一个有前景的解决方案。

引言

1983年，Trunson和Mohr首次报道了人类通过冷冻胚胎移植成功妊娠的案例[30]。自那时起，冷冻保存技术不断改进，现已成为辅助生殖技术（ART）最重要的组成部分之一[3]。根据国际辅助生殖技术监测委员会的数据，截至2023年，全球已有超过1000万婴儿通过ART出生。根据中国国家卫生健康委员会2022年的报告，中国通过体外受精-胚胎移植（IVF-ET）出生的婴儿中有52.3%使用了冷冻胚胎移植。美国疾病控制与预防中心（CDC）2023年的报告显示这一比例更高，达到65.8%，凸显了胚胎冷冻保存的关键作用。胚胎和卵子的冷冻保存主要采用两种方法：慢速冷冻（也称为程序性冷冻）和玻璃化[1]。传统的开放式玻璃化系统（如Cryotop方法）涉及含冷冻保护剂的液滴与液氮的直接接触。这些系统的冷却速率极高（通常超过20,000°C/分钟）[22]，能有效防止致命的细胞内冰晶形成并确保胚胎的高存活率。然而，开放式系统的主要缺点是在与非无菌液氮直接接触时存在微生物交叉污染的风险。相比之下，封闭式系统旨在消除这一风险，但往往由于密封材料的热阻而导致冷却速率降低[17,29,32,36]。

为了降低与开放式系统相关的病原体污染和交叉感染风险，ART诊所引入了封闭式玻璃化设备，例如法国的CBS吸管[27]和封闭式拉动吸管（CPS）[9]。然而，这些系统的效率通常较低。当前封闭式玻璃化系统的原理是“先密封再冷冻”。在这种方法中，装有胚胎的载体首先被放置在外壳内，两端封闭后浸入液氮中，从而避免了与液氮的直接接触，最小化了污染风险。Bielanski等人的研究表明[4]，在病毒污染的液氮中储存3-5周的未密封小瓶、吸管或开放式拉动吸管（OPS）中的胚胎，病毒检测率为21.3%（13/61），而密封载体中的胚胎检测率为0%（0/36）。但由于外壳的隔热效应和被困空气的影响，封闭式系统的冷却速率约为500°C/分钟[19]，导致总体效率低于开放式系统[6,35,36]。尽管封闭式系统对人类囊胚的玻璃化在解冻后存活率、着床率或临床妊娠率方面与开放式系统没有显著差异，但生育率较低。因此，封闭式系统还不能完全替代开放式系统在临床ART中的应用[35]，Cai等人的研究也支持这一观点[6]。为了在保持开放式系统高效率的同时消除交叉污染风险，迫切需要一种安全高效的封闭式玻璃化技术来处理人类卵子和胚胎[5]。

在这项研究中，我们开发了一种与传统封闭式系统根本不同的新型胚胎玻璃化技术，后者采用“先密封再冷冻”的方法。我们的方法采用“先冷冻再密封”的策略，即胚胎通过接触-195°C的无菌液态空气进行玻璃化。这种方法实现了与开放式系统相当的冷却速率，同时保持了封闭式系统的生物安全优势。我们将这种新方法命名为“CryoClean”，结合了“Cryopreservation”（冷冻保存）和“Clean”（清洁）两个词，以体现其无菌、无污染的设计特点。该技术使用含有约85.5%氮气和14.5%氧气的高压无菌空气。最近的研究已经报道了使用预冷却液态空气进行人类精子[6,28]、异常受精的人类胚胎[17]和小鼠囊胚[2]的冷冻保存。然而，这些研究仅关注了体外发育指标，如解冻后存活率、分裂率和孵化率，没有关于体内着床或后代结果的数据。因此，迫切需要对解冻后的体内发育潜力和后代安全性进行全面评估。在本研究中，我们系统地比较了使用CryoClean、传统玻璃化和新鲜对照组保存的胚胎的DNA甲基化谱型。我们还评估了后代在胚胎移植后的生长情况、生殖能力和肿瘤易感性。我们的研究结果表明，CryoClean为现有封闭式系统的效率限制提供了一个有前景的解决方案，并具有很强的临床应用潜力。

章节片段

实验设计

本研究分为三个阶段进行：

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  系统验证： 使用不同直径的试管测试了无菌液态空气的生成效率（每组3个试管）。通过细菌培养自行制备的液态空气与实验室储存的液氮（LN2）来评估微生物安全性。
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  体外胚胎发育： 将8细胞小鼠胚胎随机分配到CryoClean（液态空气）、Cryotop（开放式，液氮）或新鲜对照组。评估其存活率和囊胚形成情况（CryoClean组：n=33）；

CryoClean玻璃化系统的发展和无菌性验证

图1展示了CryoClean方法与传统的开放式和封闭式玻璃化系统的对比。在CryoClean过程中，外壳的一端被密封，另一端连接到一个无菌过滤器。然后将外壳垂直插入充满液氮（-196°C）的容器中。冷源使外壳内的空气液化，形成真空，不断吸入环境空气并使其液化。几分钟后...

讨论

胚胎和卵子的冷冻保存是辅助生殖技术（ART）中的关键技术。最近的研究表明，与胚胎的冷冻时间相比，男性年龄和精子质量对妊娠结果的影响更为重要[20]。玻璃化因其便捷性和高效性而逐渐取代了慢速冷冻，现已成为全球许多实验室首选的冷冻保存方法。根据...

结论

总之，我们成功开发了CryoClean这种新型封闭式玻璃化技术，它采用“先冷冻、后密封”的策略，并使用无菌液态空气进行高效冷冻。这种方法有效避免了直接接触液氮所带来的微生物污染风险。在小鼠模型中，CryoClean不仅保持了与传统开放式冷冻方法相当的胚胎存活率和发育潜力，而且对DNA没有显著影响...

CRediT作者贡献声明

Rongxiang Wang： 写作——审稿与编辑，撰写——初稿，数据分析，概念构思。Hui Yang： 写作——审稿与编辑，撰写——初稿，数据分析，概念构思。Hongjuan Ye： 写作——审稿与编辑，撰写——初稿，数据分析，概念构思。Laiqing Yan： 写作——审稿与编辑，撰写——初稿，数据分析，概念构思。Liya Shi： 验证，方法学，数据分析。Jiwen Zhou： 软件...

数据和模型可用性声明

数据未存放在任何官方数据库中。不过，如需数据，可向通讯作者提出合理请求。

伦理批准

动物研究计划获得了同济大学动物保护与利用委员会的批准（批准编号：TJBB04822101）。

资金声明

本研究得到了中国国家自然科学基金（82171691、32170800和31871490）的资助。

利益声明

作者声明没有利益冲突。