牛心水解物作为一种潜在的降压肽来源，可通过抑制ACE-I和神经利辛（Neprilysin）的活性发挥作用

《Food and Bioprocess Technology》：Bovine Heart Hydrolysates as a Source of Potential Antihypertensive Peptides Through the Inhibition of ACE-I and Neprilysin Activity

　　**摘要**
由于人们对可持续蛋白质回收的兴趣增加，将肉类副产品作为功能性成分的来源进行开发利用正受到关注。本研究探讨了使用Novozym?、Protamex?及其与外肽酶Protana? Prime组合处理牛心蛋白水解物以生成抗高血压肽的方法。顺序酶处理显著提高了水解程度和氨基酸释放量，而单一内肽酶则表现出更强的血管紧张素转化酶I（ACE-I）和神经肽酶（NEP）抑制活性，其中Protamex水解物中的ACE-I抑制活性达到68.72%，Novozym水解物中的NEP抑制活性达到58.48%。通过LC–MS/MS技术对肽进行鉴定，从最有活性的组分中分离出1251种肽，这些肽主要来源于肌肉蛋白质。利用PeptideRanker的计算机模拟分析预测出172种具有高生物活性的肽，而AHTpin实验验证了其中109种肽具有抗高血压作用。MultiPep软件预测NPPKFDK、VYPFPGPI和VYPFPGPIPN具有ACE抑制活性，其中VYPFPGPIPN的抗高血压活性得分最高（0.995）。此外，KPPVVKW、LKPLPPK和LKPRPPAR的细胞穿透评分超过0.6，表明它们具有潜在的细胞摄取能力。这项研究是首次报道牛源肽具有NEP抑制活性的研究之一，突显了牛心蛋白水解物作为功能性食品或营养保健品中多功能肽的宝贵来源。

**引言**
肉类产业不仅提供了大量富含蛋白质的产品供人类消费，同时也产生了大量副产品，如骨头、皮肤、内脏、血液等，这些副产品是宝贵的蛋白质来源（Toldrá等人，2021年）。据估计，欧盟和英国每年产生的肉类副产品量约为1800万吨（EFPRA，2023年）。除了营养价值外，这些副产品还蕴含着未被充分开发的生物活性化合物。因此，随着对可持续蛋白质来源需求的增长，重新利用这些副产品并为其增值变得日益重要。一种有前景的方法是利用副产品生产生物活性肽。这些在天然蛋白质中通常不活跃的化合物可以通过酶水解、发酵或食品加工过程释放出来，并展现出多种促进健康的作用（Mora等人，2014年）。多项研究证明了来自不同牛源副产品（如骨头（Chiang等人，2019年）、胶原蛋白（Zhang等人，2013年）、血液（Grimaldos和Zapata，2021年；Lafarga和Hayes，2016年）以及心脏（Juknien?等人，2023年）的水解物具有生物活性。这些发现表明牛源副产品是开发功能性肽的潜在优质来源。

血管紧张素转化酶I（ACE-I）抑制肽因其在调节肾素-血管紧张素系统和激肽系统中的作用而受到特别关注，这些系统对血压、体液和电解质平衡以及心血管功能具有调节作用（Jogi等人，2021年）。因此，来自食品蛋白质的ACE-I抑制肽已得到广泛研究，并有大量文献记载，包括多项关于来自不同牛源肽的ACE抑制作用的研究。例如，Fu等人（2016年）从木瓜蛋白酶水解的牛胶原蛋白中鉴定并纯化了五肽GPRGF，其IC50值为200.91 μM。Lee和Hur（2019年）证明，用碱性AK蛋白酶消化牛肉肌原纤维蛋白获得的小于3 kDa的肽具有高ACE抑制活性（74.29%），并在自发性高血压大鼠模型中表现出显著的抗高血压效果，其中LIVGIIRCV肽被确定为活性成分。另一方面，神经肽酶（NEP）是一种依赖锌的内肽酶，能够切割长度为40至50个氨基酸的肽。这种酶在人体内广泛表达，在心血管、肾脏、肺部、胃肠道、内分泌和神经系统等方面发挥着关键作用。与ACE-I不同，食品来源的NEP抑制肽研究相对较少，尽管NEP能够调节包括利钠肽、缓激肽、肾上腺髓质素和P物质在内的多种肽，以及血管收缩剂如血管紧张素II、神经肽和内皮素（Bozkurt等人，2023年）。鉴于NEP的广谱底物特异性及其在心血管稳态中的作用，它已成为开发抗高血压食品肽的重要靶点。迄今为止，仅有少数研究报道了NEP抑制作用，包括来自猪血或骨头（Carrera-Alvarado等人，2024年；Moreno-Mariscal等人，2025a）和牛肝（Gallego等人，2024年）的水解物，这表明需要进一步研究肉类副产品作为NEP抑制肽的来源。

酶水解是一种被广泛接受且环保的方法，用于获得生物活性水解物，因为它在温和条件下进行，避免了使用刺激性化学物质或极端温度（Angulo和Márquez，2023年）。该过程的效率和特异性取决于多种因素，包括酶的选择、浓度、反应条件以及蛋白质类型及其氨基酸组成（Juknien?等人，2023年）。市场上有多种酶可供选择，可以为优化水解条件以实现特定结果提供多种可能性（Toldrá等人，2020年）。这些酶制剂通常作为商业混合物用于食品蛋白质水解，因为它们具有成本效益高和催化性能平衡的优点。例如，Moreno-Mariscal等人（2025a）使用Alcalase? 4.0 L、Protana? Prime、Flavourzyme? 1000 L和Protamex?等商业酶的组合，报道了猪血水解物具有一定的ACE-I和NEP抑制活性。

近年来，计算机模拟分析已成为探索生物活性肽生成和生物潜力的强大工具。它利用专用软件、数据库和预测模型能够快速筛选大量肽序列。这些工具对于阐明肽的活性机制和探索生物活性肽的结构-功能关系也非常有用（Tu等人，2018年）。然而，用于预测相同类型生物活性的工具往往产生不一致的结果，并不总能与体外数据直接比较。因此，它们最好作为传统体外方法的补充手段使用，特别是在肽发现和开发的早期阶段（Bechaux等人，2020年）。

**材料与方法**
**化学试剂**
Novozym? 37071（75,000 PROT/g）、Protamex?（1.5 AU-A/g）和Protana? Prime（1,067 LAPU/g）购自诺维信公司（丹麦Bagsv?rd），用于制备牛心蛋白水解物。兔肺来源的血管紧张素转化酶I（ACE-I）（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）和o-氨基苯甲酰基甘氨酰-p-硝基-L-苯丙氨酰-L-脯氨酸（Abz-Gly-Phe(NO?)-Pro）三氟醋酸盐（Bachem AG，瑞士Bubendorf）分别用作ACE-I抑制测定的目标酶和荧光底物。人神经肽酶（NEP）蛋白（Acro BioSystems，瑞士巴塞尔）和N-琥珀酰-Ala-Ala-Phe-7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）用于NEP抑制测定，而氨基肽酶M（Merck，德国达姆施塔特）用于释放荧光。卡托普利（Captopril）和硫酚（thiorphan）分别用作ACE-I和NEP的阳性对照抑制剂。o-邻苯二甲醛（OPA）、十二烷基硫酸钠（SDS）和DL-二硫苏糖醇（DTT）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯），用于测定水解程度。三氟乙酸（TFA）、三乙胺（TEA）、苯基异硫氰酸酯（PITC）、甲酸（FA）和乙腈（ACN）也来自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯），用于衍生化和液相色谱分析。

**样品制备及牛心样品的酶水解**
本研究中使用的牛心样本来自西班牙Castellón当地屠宰场的12个月、14个月和18个月大的母牛，作为商业食品生产后的可食用副产品。所有实验均在死后动物上进行，因此不需要机构Animal Care Committee的伦理批准。收集后，样品在冷藏条件下（≤4°C）真空包装并运输至实验室，在-20°C下保存直至进一步处理。

样品制备过程中，首先去除牛心中的脂肪组织并分离主动脉，然后用商用绞肉机将心组织切碎。通过卤素水分分析仪（HB43，Mettler Toledo，瑞士）干燥3克切碎的心组织直至重量稳定，以测定水分含量。接着按照AOAC方法992.15（AOAC，1992年）使用杜马斯燃烧法测定蛋白质含量。样品的pH值在室温下使用pH计（型号HI 99163，Hanna Instruments Inc.，美国Woonsocket）进行测量。所有测量均重复三次。将切碎的样品与双蒸水（1:1.5 w/v）混合后，使用均质器（IUL Instruments，西班牙巴塞罗那）进行5分钟冷均质处理，随后进行水解。

牛心样品的酶水解采用四种处理方法：两种单酶水解过程和两种顺序水解过程。这些处理方法根据所用酶的名称进行命名：Novozym?（NOV）、Protamex?（PRX）、Novozym?后接Protana? Prime（NOV/PP）以及Protamex?后接Protana? Prime（PRX/PP）。每种酶的最佳pH值和温度根据制造商规格确定。酶处理条件如下：NOV（2/100（w/w）酶/蛋白质比例）在pH 9和55°C下处理1小时；PRX（2/100，w/w）在pH 6和55°C下处理1小时；PP（5/100，w/w）在pH 6和55°C下处理12小时。同时设置了未经酶处理的对照样品（C）。水解时，将35克均质化的牛心样品放入圆底烧瓶中，并放入Ball Reactor（Carousel 6 Plus Reaction Station，Radleys，英国Saffron Walden）。根据每种酶的最佳条件调整样品的pH值。达到目标温度55°C后，按上述单酶或双酶处理方式加入酶开始水解。水解结束后，将样品放入95°C的水浴中处理3分钟，然后通过冰浴冷却。酶失活后，将水解物在-20°C下保存直至进一步分析。

**水解程度测定**
水解程度（DH）按照Nielsen等人（2001年）描述的方法测定。OPA试剂的制备方法是：将7.620克十水合四硼酸钠和200毫克SDS溶解在150毫升双蒸水中。另外，将160毫克OPA溶解在4毫升乙醇中，再用双蒸水冲洗后加入前述混合物中，再加入176毫克DTT，最终体积调节至200毫升。进行分析时，将初始水解物（0.8 mg/mL）稀释至2 mg/mL。每个样品取36 μL与对照品和标准品（L-丝氨酸，0.9516 meq/L）混合后，加入270 μL OPA试剂。在室温下孵育2分钟后，使用CLARIOstar?多功能微孔板读数仪（BMG LABTECH，德国Ortenberg）在340 nm处记录吸光度。

**游离氨基酸测定**
各水解物中的游离氨基酸（FAA）含量按照Aristoy和Toldrá（1991年）描述的脱蛋白和衍生化程序进行测定。为此，准备了250 μL的三份水解物（浓度为50 mg/mL），并与50 μL的10 mM L-诺莱辛（用作内部标准）和750 μL的ACN混合。样品经涡旋振荡后，在室温下孵育1小时，然后在4°C下以15,000 rpm的速度离心5分钟。将所得上清液的100 μL部分在SpeedVac SPD120高速真空浓缩器（Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA）中于35°C下干燥2小时。随后加入15 μL的干燥试剂（甲醇：1 M醋酸钠：TEA，比例为2:2:1）。再次涡旋振荡后，在相同条件下干燥样品，并通过加入15 μL的衍生化试剂（甲醇：水：TEA：PITC，比例为7:1:1:1）进行衍生化。反应混合物在室温下孵育20分钟后，再在35°C下干燥2小时。

色谱分析基于Flores等人（1997年）开发的方法，并作了一些修改。衍生化后的样品重新悬浮在250 μL的稀释试剂（pH 7.4的5 mM二钠磷酸盐和5% ACN）中，涡旋振荡后，在4°C下以15,000 rpm的速度离心5分钟。氨基酸的分离使用Waters ACQUITY Arc系统（Waters Corp., Milford, MA, USA）和Pico Tag C18柱（3.9 × 300 mm，4 μm；Waters Corp.）完成。柱子在52°C下运行，流速为1 mL/min，紫外检测波长为254 nm。流动相A由70 mM醋酸钠和2.5% ACN组成，调整至pH 6.55；流动相B由ACN、水和甲醇以45:40:15的比例组成。注入样品量为10 μL，洗脱梯度为：初始时0% B；13.5分钟时3% B；24分钟时6% B；30分钟时9% B；50分钟时34% B；61分钟时34% B；63.5分钟时50% B；67分钟时100% B。氨基酸的定量是通过每种氨基酸的标准曲线进行的，结果以mg FAA每克样品表示。

水解物的生物活性
- ACE-I抑制活性
水解物的ACE-I抑制活性根据Sentandreu和Toldrá（2006年）的方法进行测定。将50 μL的水解物（10 mg/mL）与50 μL的ACE-I溶液（3 mU/mL，溶于0.150 M Tris盐缓冲液，pH 8.3）混合。通过加入200 μL的荧光底物Abz-Gly-Phe(NO2)-Pro（0.45 M，溶于含有125 M NaCl的150 M Tris盐缓冲液，pH 8.3）来启动反应。荧光在37°C下使用CLARIOstar?多模式微孔板读取器动态监测60分钟，激发波长和发射波长分别设置为355 nm和405 nm。卡托普利（10 μM）用作阳性对照。结果以固定水解物浓度下的抑制百分比表示。
- 纳普利辛抑制活性
NEP抑制测定按照Moreno-Mariscal等人（2025b）描述的方法进行。酶溶液在0.1%牛血清白蛋白中制备至400 μg/mL，然后用双蒸水以1:1000的比例稀释。AMC作为底物，浓度为0.2 mM，溶于50 mM HEPES/NaOH缓冲液（pH 7.4）。为了制备工作底物溶液，向HEPES/AMC溶液中加入氨基肽酶M，以达到每孔最终浓度为0.75 μg。在三次重复实验中，将25 μL的水解物（50 mg/mL）和25 μL的酶溶液混合。在黑暗中于37°C下孵育10分钟后，加入50 μL的底物溶液启动反应。使用CLARIOstar?多模式微孔板读取器在37°C下以动力学模式测量荧光，持续时间60分钟，激发波长和发射波长分别设置为320 nm和420 nm。噻吩（1 mM）用作阳性对照。结果以固定水解物浓度下的抑制百分比表示。

反相高效液相色谱
使用Agilent 1100 HPLC系统（Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA）进行反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析，以获得肽谱并进行分离。分析前，样品用三体积的乙醇脱蛋白，然后在4°C下过夜孵育。随后，样品在4°C下以10,000 rpm的速度离心10分钟，使用Heidolph Hei-VAP Value旋转蒸发器（Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach, Germany）在60°C和80 rpm下去除乙醇。得到的样品冻干后，用双蒸水重新配制至100 mg/mL的浓度用于分析。将20 μL的样品注入RP-HPLC系统以获得肽谱。肽的分离使用Symmetry C18柱（4.6 × 250 mm，5 μm；Waters Co., Milford, MA, USA）进行，以梯度模式操作。流动相A由含有0.1% TFA的双蒸水组成；流动相B由ACN和双蒸水的混合物（60:40, v/v）组成，TFA浓度为0.085%。洗脱梯度为：初始时0% B；5分钟时2% B；50分钟时45% B。流速为1 mL/min，肽的洗脱通过214 nm处的紫外吸光度监测。此外，对于制备性分馏，将100 μL的样品注入并在相同的色谱条件下进行分析。收集各10 mL的洗脱肽段，冻干后用4 mL的双蒸水重新配制，以便用于生物活性测定。

液相色谱-串联质谱
对显示最高生物活性的不同牛水解物RP-HPLC fraction进行液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）分析，使用EvoSep One LC系统（Odense, Denmark）和Tims TOF fleX质谱仪（Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany）。分析前，根据制造商的说明使用ZipTip C18吸头（Merk Millipore Ltd., Cork, Ireland）对样品进行清洗。然后将样品装载到Evotip纯柱中，并使用制造商预设的30 SPD色谱方法进行洗脱，流动相A为水中含0.1% FA的溶液，流动相B为ACN和双蒸水的混合物（60:40, v/v），TFA浓度为0.085%。洗脱梯度为：初始时0% B；5分钟时2% B；50分钟时45% B。流速为1 mL/min，肽的洗脱通过214 nm处的紫外吸光度监测。此外，对于制备性分馏，将100 μL的样品注入并在相同的色谱条件下进行分析。收集每个洗脱肽段各10 mL，冻干后用4 mL的双蒸水重新配制，以获得浓度提高2.5倍的肽段用于生物活性测定。

液相色谱-串联质谱
对具有最高生物活性的不同牛水解物的RP-HPLC fraction进行液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）分析，使用EvoSep One LC系统（Odense, Denmark）和Tims TOF fleX质谱仪（Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany）。分析前，根据制造商的说明使用ZipTip C18吸头（Merk Millipore Ltd., Cork, Ireland）对样品进行清洗。然后将样品装载到Evotip纯柱中，并使用制造商预设的30 SPD色谱方法进行洗脱，流动相A为水中含0.1% FA的溶液，流动相B为ACN和双蒸水的混合物（60:40, v/v），TFA浓度为0.085%。洗脱的肽在1700 V和200°C下使用CaptiveSpray源电离，MS谱在100–1700 m/z范围内获取。应用了自定义的TIMS设置：1/K?范围为0.7–1.76 V·s/cm2，上升时间100 ms，上升速率9.42 Hz。数据以DDA-PASEF模式采集，共4次PASEF上升，总周期时间为0.5 s。设置强度阈值为1,000，目标强度为12,500，并启用活性排除。使用Mascot Distiller v2.7.1（Matrix Science, Inc., Boston, MA, USA；https://www.matrixscience.com）进行自动光谱处理、峰值列表生成和数据库搜索。Mascot搜索引擎通过将MS/MS数据中的实验肽序列与Uniprot蛋白质序列数据库（UniProtKB；https://www.uniprot.org/）进行匹配，识别肽的来源蛋白质，选择Chordata（脊椎动物及其近亲）作为分类，并不区分酶特异性。前体离子的质量容忍度为100 ppm，MS/MS片段的质量容忍度为0.3 Da，显著性阈值为P < 0.01。

基于计算机的分析
使用多种基于计算机的工具评估了鉴定肽的生物活性潜力。首先使用PeptideRanker（http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）进行初步筛选，该工具基于N到1的神经网络模型预测生物活性概率。每个肽被赋予一个PeptideRanker比率（PRR）分数，范围从0到1，分数高于0.5的肽被认为具有潜在的生物活性（Mooney等人，2012年）。接下来，使用MultiPep（https://cphbat.shinyapps.io/MultiPep/）分析PRR > 0.5的肽，该工具根据特征氨基酸序列模式将肽分类为20个预定义的生物活性类别。在每个类别中，MultiPep为肽分配一个概率分数，范围从0到1，反映肽真正属于该特定生物活性类别的概率（Gr?nning等人，2021年）。然后使用AHTpin（http://crdd.osdd.net/raghava/ahtpin/）进一步评估肽的生物活性，该工具基于支持向量机（SVM）模型预测抗高血压潜力。该模型比较查询肽的原子和氨基酸组成与已知的抗高血压肽。SVM得分大于0的肽被认为具有抗高血压潜力。AHTpin还用于获取生物活性肽的关键理化性质，包括疏水性、亲水性、净电荷和分子量（Kumar等人，2015年）。此外，还使用CPPpred工具（http://distilldeep.ucd.ie/CPPpred/）基于神经网络方法预测肽的细胞穿透潜力（Holton等人，2013年）。因此，这种基于计算机的方法包括：（i）通过LC–MS/MS和数据库搜索鉴定肽；（ii）使用PeptideRanker进行初步生物活性筛选；（iii）使用MultiPep进行功能分类；（iv）使用AHTpin预测抗高血压潜力；（v）使用CPPpred评估细胞穿透潜力。这种逐步的方法使用基于计算机的工具，提供了关于观察到的体外活性的潜在肽的补充信息，并为未来的研究确定优先级。

数据分析
数据分析使用OriginPro 2023（OriginLab Corp., Northampton, MA, USA）进行。首先应用单因素方差分析（ANOVA），然后进行Fisher的诚实显著差异（HSD）测试，以评估组间的统计差异。结果以平均值±标准差表示，统计显著性为P < 0.05。

结果与讨论
对新鲜牛心脏样品进行了表征，以优化水解条件。样品的含水量为76.69 ± 0.55%，蛋白质含量为19.21 ± 0.48%，pH值为5.98 ± 0.01。这些结果与先前的研究一致，这些研究报道了相同副产品的含水量在76–80%之间，蛋白质含量在17–20%之间（Masoud等人，2025年；Biel等人，2019年；Tsermoula等人，2019年）。

酶解后，测量了水解度（DH）以评估每种处理的效率。如图1所示，不同水解物之间存在显著差异。PRX/PP样品的水解度最高（38.93 ± 1.93%），其次是NOV/PP样品（35.02 ± 0.32%）。这些发现表明，内肽酶和外肽酶的顺序作用提高了蛋白水解活性。Chiang等人（2019年）也报告了类似的结果，他们发现含有内肽酶和外肽酶活性的Flavourzyme?酶酶解的牛肉骨提取物显示出最高的水解度，而仅用内肽酶如Protamex?和菠萝蛋白酶处理的样品则较低。同样，Moreno-Mariscal等人（2025a）观察到，使用三种酶（Alcalase?、Protana? Prime和Flavourzyme?或Protamex?）顺序作用获得的海猪血液水解物显示出比仅用两种酶处理更高的水解度，使用同时具有内肽酶和外肽酶活性的酶时达到最高值（33.39 ± 0.98%）。当比较单独使用内肽酶的水解效果时，NOV水解物的水解度几乎是PRX的三倍。Szucs等人（2021年）评估了各种细菌内肽酶的效率，表明像Alcalase?这样的碱性蛋白酶通常更适合肉残渣的水解，这归因于酶特性的差异。这一观察结果与当前研究一致，即使用碱性内肽酶Novozym?获得的水解物显示出比使用中性内肽酶Protamex?更高的水解效率。

图1
这种图像的替代文本可能是使用AI生成的。
心脏水解物的水解程度（%）：C：对照组，未水解；NOV：Novozym水解；PRX：Protamex水解；NOV/PP：Novozym和Protana Prime水解；PRX/PP：Protamex和Protana Prime水解。不同的字母表示样品之间的统计显著差异（P < 0.05）。

游离氨基酸（FAA）的含量在不同酶处理之间也存在显著差异（表1）。NOV/PP样品的总FAA含量最高（85.40 ± 2.57 mg/g），其次是PRX/PP水解物（76.17 ± 3.64 mg/g）。外肽酶作用于多肽链的末端，释放小肽和FAA。相比之下，内肽酶在多肽链内部切割，产生较大的蛋白质片段、多肽和肽（Castro & Sato，2015年；Toldrá等人，2020年）。在顺序水解处理中观察到的较高FAA含量可以通过内肽酶和外肽酶的互补酶特异性来解释。虽然内肽酶在蛋白质链内部切割肽键，但外肽酶如PP从肽末端逐步释放氨基酸，导致广泛的肽降解和FAA积累。在两种顺序水解样品中，最丰富的氨基酸是Glu、Leu和Lys。除了Gln、Tau、Pro和Cys-Cys在PRX/PP中含量较高外，所有个别FAA的浓度在NOV/PP样品中都更高。与DH结果一致，内肽酶和外肽酶的组合使用相比单独使用内肽酶能够释放出更多的FAA，其他作者也有类似的报道（Domínguez等人，2024年；Moreno-Mariscal等人，2025a年；Nchienzia等人，2010年）。实际上，PRX中的FAA含量与样品C相似，而NOV样品中的FAA含量显著增加，达到了20毫克/克。简单水解产物中最丰富的残留物是Leu、Gln和Glu。与Juknien?等人（2023年）对牛心水解物的研究结果相比，木瓜蛋白酶在降低FAA浓度方面比胃蛋白酶更有效，这表明肽的形成得到了增强；而最丰富的游离氨基酸是Glu、Lys、Leu和Arg。Damgaard等人（2015年）在用Alcalase?和Protamex?水解猪心2小时后也发现了类似的结果，其中Glu（0.83克/100克）、Asp（0.47克/100克）、Lys和Leu（约0.4克/100克）是主要的氨基酸。表1显示了牛心水解物中的游离氨基酸（FAA）含量。

如图2所示，与对照组（C）相比，牛心水解物的ACE-I抑制活性增加了19-35%。样品PRX表现出最高的抑制活性（68.72±4.20%），其次是NOV和PRX/PP水解物，其活性值约为57%。因此，单独使用内肽酶进行水解产生了具有高ACE-I抑制活性的水解物。相比之下，顺序水解导致ACE-I抑制作用减弱，这可能是因为从C末端位点去除了对ACE-I结合至关重要的芳香族或碱性残基（Aluko，2015年）。除了C末端残基的丢失外，顺序水解还可能促进肽过度分解成短片段和游离氨基酸，从而减少了完整生物活性肽的丰富度。类似的机制也可能解释了在外肽酶处理后观察到的NEP抑制活性降低，因为肽的长度和末端组成预计会影响酶-肽的相互作用。Sapatinha等人（2025年）也报告了类似的结果，他们发现当用Protana? Prime与内肽酶Alcalase?顺序或同时使用时，鱼副产品水解物中的ACE-I抑制活性会降低。Lee和Hur（2019年）也证明，使用碱性-AK和木瓜蛋白酶水解的牛肉肌纤维蛋白显示出高的ACE抑制值，其中<3 kDa的肽部分表现出最高的抑制率（74.29%）。同样，Gallego等人（2024年）报告称，使用胃蛋白酶和超声辅助的胃蛋白酶水解的牛肉肝液中的ACE-I抑制率约为80%。相比之下，Lafarga等人（2016年）发现木瓜蛋白酶处理后的牛血红蛋白水解物的ACE-I抑制活性约为40%，这进一步突出了底物类型、酶特异性和水解条件对生物活性肽生成的影响。

根据这些结果，与对照组相比，水解物表现出显著更高的NEP抑制活性。如图2所示，单独水解得到的样品比顺序酶作用得到的样品具有更强的NEP抑制作用，其中NOV样品的抑制活性最高（52.48±3.45%）。这些结果表明，具有内肽酶活性的酶更有能力生成具有NEP抑制潜力的肽。同样，Carrera-Alvarado等人（2024年）报告称，用Protamex?和Alcalase?处理的干腌骨水解物显示出接近60%的NEP抑制作用，而用Flavourzyme?处理后的活性降低了约20%，而Protana? Prime处理后的样品则没有观察到抑制作用。在Moreno-Mariscal等人（2025a年）的研究中，猪血水解物的NEP抑制作用范围为50-79%，使用内肽酶（Protamex?）而非外肽酶（Flavourzyme?）有利于NEP抑制肽的形成。Gallego等人（2024年）也报告称，使用胃蛋白酶和超声辅助的胃蛋白酶水解的牛肉肝液中的NEP抑制率约为87-89%。总体而言，这些发现表明酶的特异性和原材料的蛋白质组成在生成具有高NEP抑制潜力的肽方面起着关键作用。

通过RP-HPLC获得了牛心水解物的肽谱，并对每个组分进行了ACE-I和NEP抑制活性的分析（图3）。结果证明，不同水解物之间的肽分布和酶抑制潜力存在显著差异。

控制样品（C）未经酶水解处理，其色谱图谱显示早期洗脱峰较少（0-10分钟），吸光度低，表明肽的多样性和丰富度有限。相应地，ACE-I抑制活性缺失，而在0-10分钟和20-30分钟收集的组分中观察到接近80%的NEP抑制活性。相比之下，NOV和PRX水解物的肽谱在洗脱范围内显示了广泛的肽谱。关于ACE-I抑制作用，最高活性值（约70%）出现在20到40分钟的组分中，这些组分可能含有更多的疏水性肽。两种水解物的第一个组分中发现了最大的NEP抑制活性，其中含有亲水性肽，活性值超过了90%。

对于NOV/PP和PRX/PP水解物，与中段洗脱区域的肽谱相比，具有较少且强度较低的峰，这表明肽的组成或丰富度可能存在差异，这可能是由于外肽酶（PP）的作用导致肽强烈降解为FAA。在两个样品中，几个明确的峰出现在相似的洗脱时间，表明酶PP对最终色谱谱有显著影响。关于各组分的生物活性，ACE-I活性值低于NOV和PRX的活性值。PRX/PP的第一个组分中的活性最高（58.22±0.21%），而NOV/PP在洗脱时间不超过20分钟的肽组分中显示出最大活性值（接近30%）。NEP抑制活性在两种酶顺序使用后获得的第一组分中约为95%。值得注意的是，尽管顺序水解样品的RP-HPLC谱在色谱上看起来更简单，但这并不一定反映肽的多样性较低。外肽酶的广泛作用可能产生了许多在早期色谱区域共洗脱的短肽，导致解析的峰较少，但可能代表了更多的肽。

由于所有样品的第一个RP-HPLC组分（0-10分钟）在NEP抑制活性和ACE-I抑制活性方面始终较高，因此选择了该组分进行LC–MS/MS分析。由于其余组分的抑制活性较低或不一致，而不是因为冗余或排除偏差，未能优先对其进行LC–MS/MS分析。共鉴定出1251个肽，肽的长度 ranges from 7到22个氨基酸残基。结果根据不同的酶处理显示出不同的蛋白质谱（图4）。在样品之间鉴定出的肽数量存在显著差异：NOV/PP中鉴定出970个肽，PRX/PP中鉴定出135个肽，PRX中鉴定出119个肽，NOV中鉴定出27个肽，肌肉蛋白在总体上占主导地位。在顺序水解得到的样品中，来自肌动蛋白和肌球蛋白的肽占总鉴定肽的约50%。在PRX水解物中，来自肌动蛋白的肽也最为丰富，占44%，而在NOV/PP水解物中，原纤维蛋白是第二丰富的母蛋白。这些发现与先前的研究结果一致，即肌肉蛋白是ACE-I抑制肽的主要来源（Mora等人，2018年；Xing等人，2021年）。NOV水解物主要由 sarcoplasmic 蛋白质组成的肽构成，同时含有大量可能来自样品中残留商业酶的胃蛋白酶A衍生物肽。相比之下，C样品显示出更为多样的蛋白质谱，缺乏主导的蛋白质成分，表明蛋白水解程度有限。

比较肽组谱显示，顺序水解（NOV/PP和PRX/PP）产生了更多的肽，而单独使用内肽酶（NOV和PRX）产生的肽谱较为有限但具有区别。外肽酶的作用导致根据先前使用的酶不同，生成的肽的数量和多样性存在显著差异。具体来说，NOV中包含27个肽，而在顺序添加PP后增加到970个肽，且没有共同的肽。相比之下，PRX和PRX/PP中鉴定了相似数量的肽，大约30%的序列在两个样品之间共享。在比较顺序处理时，共鉴定出85个肽，主要来自丰富的肌肉蛋白，如肌动蛋白和肌球蛋白。这些共享肽占NOV/PP中鉴定肽总数的8.76%，以及PRX/PP中鉴定肽总数的62.96%，占联合数据集中独特肽总数的8.33%。这种描述性的肽组学特征突显了酶处理策略如何影响肽的多样性，并可能有助于根据所需的肽输出选择适当的水解条件。

通过LC–MS/MS和In Silico分析对鉴定出的肽进行了鉴定。首先对所有样品的第一个RP-HPLC组分（0-10分钟）进行了LC–MS/MS分析，因为它在所有水解物中都表现出持续的高NEP抑制活性和显著的ACE-I抑制活性。其余组分由于抑制活性较低或不一致，而不是因为冗余或排除偏差，没有被优先用于LC–MS/MS分析。共鉴定出1251个肽，长度范围从7到22个氨基酸残基。结果根据应用的酶处理方式显示出不同的蛋白质谱（图4）。在样品之间鉴定出的肽数量存在明显差异：NOV/PP中鉴定出970个肽，PRX/PP中鉴定出135个肽，PRX中鉴定出119个肽，NOV中鉴定出27个肽，其中肌肉蛋白最为普遍。在顺序水解得到的样品中，来自肌动蛋白和肌球蛋白的肽占总鉴定肽的约50%。在PRX水解物中，来自肌动蛋白的肽也最为丰富，占44%，而在NOV/PP水解物中，原纤维蛋白是第二丰富的母蛋白。这些发现与先前的研究一致，即肌肉蛋白是ACE-I抑制肽的主要来源（Mora等人，2018年；Xing等人，2021年）。NOV水解物主要由 sarcoplasmic 蛋白质组成的肽构成，同时还含有大量可能来自样品中残留商业酶的胃蛋白酶A衍生物肽。相比之下，C样品显示出更加多样的蛋白质谱，缺乏主导的蛋白质成分，表明蛋白水解程度有限。

多肽分析根据氨基酸模式将肽分为20个生物活性类别。一些生物活性类别定义较为宽泛，如抗菌肽、肽激素和降压肽，而其他类别则更为具体，包括ACE抑制剂、阿片类肽和二肽酶抑制剂（Gr?nning等人，2021年）。特别值得关注的是预测具有ACE-I抑制或降压特性的肽。尽管ACE-I抑制剂是降压肽的一个子集，但并非所有被预测为降压的肽都通过ACE-I抑制发挥作用，因为这一更广泛的类别还包括其他机制（Gallego等人，2018年）。鉴定出的肽NPPKFDK、VYPFPGPI和VYPFPGPIPN被赋予了大于0.5的ACE-I抑制概率分数。此外，30个肽的降压概率分数高于0.5，其中VYPFPGPIPN显示出最高的分数（0.995）（表2）。值得注意的是，与二元分类系统不同，该工具提供概率预测，因此分数低于阈值的肽仍可能具有特定的生物活性特征（Gr?nning等人，2021年）。ACE-I抑制肽通常较短（2到12个氨基酸），并对消化酶具有很强的抗性，这增强了它们的潜在生物活性（Segura Campos等人，2013年）。另一方面，数据库中包含的NEP抑制性肽序列非常少，目前也缺乏专门的预测模型，这限制了对这些肽的特征分析和机制解释。使用AHTpin工具的进一步分析支持了109种肽的降压潜力，每种肽的SVM得分均高于0，因为SVM得分大于0的肽被认为具有降压潜力（表2）。这种基于机器学习的工具根据肽的长度和特定氨基酸残基的存在来预测降压活性。有34种肽表现出较高的SVM得分（>1），其中包括来自C序列的3种，来自PRX序列的2种，来自NOV/PP序列的26种，以及来自PRX/PP序列的3种。除了生物活性预测外，AHTpin还提供了与肽的吸收、运输和与生物靶标相互作用相关的关键理化性质。预测的降压肽通常表现出中等的疏水性（-0.1至+0.1），分子量范围从700到2188 Da。这些发现与Lee和Hur（2019年）的先前研究结果一致，他们观察到低分子量（<3 kDa）的牛肉水解物部分比高分子量的部分具有更高的ACE-I抑制活性。同样，Lafarga等人（2016年）指出，高分子量肽可以减少较小活性肽的浓度，并可能干扰其活性，最终导致ACE-I抑制活性降低。根据以往的研究，肽与ACE-I的结合亲和力受到结构特征的显著影响，特别是在C端区域。C端三肽序列中芳香族、带正电或碱性氨基酸的存在在介导与ACE-I的相互作用中起着重要作用（Aluko, 2015；Fernández等人, 2016）。先前的研究还表明，具有疏水性N端残基的肽，结合C端的芳香族氨基酸如Tyr、Phe和Trp或Pro，能够增强与ACE-I活性部位的结合（Xing等人, 2021）。与这些发现一致，降压肽C端最常见的氨基酸是Phe、Leu、Ser和Tyr，而N端最常见的残基是Ala、Gly、Asp、Phe和Leu，这意味着46%的鉴定肽具有与ACE抑制相关的末端残基。另一方面，尽管关于NEP抑制性肽的结构信息仍然有限，但富含疏水性和支链氨基酸的短肽可能与NEP的催化位点相互作用（Moreno-Mariscal等人, 2025b）。因此，97.1%的鉴定肽在其序列中包含Val、Ala、Arg、Pro或Glu，17.5%的肽在N端含有Ala，大约5%的肽在C端含有Glu或Arg，这些结构特征可能有助于酶的抑制。在Moreno-Mariscal等人（2025b）的研究中，选择了19种来自鸡肉水解物的二肽，并对其ACE-I和NEP抑制活性进行了评估。其中，如GP和RP这样的二肽表现出强烈的ACE-I抑制作用（66-87%），而VV和VE则表现出显著的NEP抑制作用，VV在1 mM浓度下达到了75.24%。有趣的是，一些二肽对这两种酶都有抑制作用，显示出双重生物活性。本研究的结果强调了食品来源的蛋白质水解物作为具有NEP抑制活性肽的来源的潜力；然而，需要进一步的研究来明确它们的结构特征和作用机制。为了发挥生理效应，生物活性肽必须在胃肠道消化过程中保持稳定，抵抗酶的降解，并成功穿过肠上皮到达血液和靶器官（Toldrá等人, 2021）。穿透细胞的肽（CPPs）通常长度为5-30个氨基酸，富含Lys和Arg等碱性残基，常常表现出两亲性或部分疏水结构（Holton等人, 2013）。在这项研究中，大多数PPR > 0.5的肽表现出较低的CPP得分（<0.5），而KPPVVKW、LKPLPPK和LKPRPPAR的得分高于0.6，因此可以穿透细胞膜发挥有益作用。尽管使用计算机工具的结果对于选择或排除最有前途的肽序列非常有用，但有必要通过体外研究来确认这些结果。事实上，Coscueta等人（2022）报告说，一些通过mAHTPred和AHTpin在计算机上预测为具有降压作用的羊奶酪蛋白水解物衍生的肽在体外并未表现出生物活性。这种差异突显了当前预测模型的一个关键局限性，尽管它们能够快速筛选和识别潜在的生物活性候选物，但它们的输出并不总是与实验结果一致。因此，持续改进计算工具是必要的，需要更好地理解结构-活性关系，并扩展肽数据库以包括更广泛的生物活性。因此，计算机工具对于快速筛选和优先排序很有用，但这些方法不能替代实验验证，特别是对于目前缺乏预测模型的NEP抑制性肽。根据肽的频率、生物活性得分、理化性质以及与ACE-I和NEP抑制的相关性，VYPFPGPI、VKEPPYF、NPPKFDK、FDIPLAP或DVPGPPGPIE等肽作为潜在候选物出现。这些肽结合了有利的分子大小、疏水性和预测的降压潜力，适合通过合成和IC50测定进行实验验证。需要进一步研究酶的稳定性、动力学参数和结构-活性关系，以更好地理解其生物活性的机制。

结论：本研究表明，使用不同组合的内肽酶（Novozym?和Protamex?）和外肽酶（Protana? Prime）对牛心的酶解处理对水解程度、肽谱和所得水解物的生物活性潜力有显著影响。同时使用内肽酶和外肽酶的组合导致了最高程度的水解和游离氨基酸的释放。然而，仅用内肽酶处理的水解物表现出更高的ACE和NEP抑制活性，这表明进一步的外肽酶降解可能会降低关键序列的生物活性。这些结果强调了酶选择在水解过程中的重要性，因为酶的特异性以及所得肽的大小、结构和氨基酸组成在生成ACE-I和NEP抑制肽中起着关键作用。值得注意的是，计算机预测了许多肽，特别是在NOV/PP和PRX/PP水解物中鉴定出的肽，具有潜在的降压活性。尽管计算机预测很有前景，但仍需要通过体外和体内测试来验证计算结果。此外，由于对NEP抑制性肽的理解和工具的可用性有限，未来的研究应专注于解释它们的结构-活性关系，并开发更准确的预测模型。总体而言，商业酶如Novozym?、Protamex?和Protana? Prime在 producuing含有潜在降压效果的牛心水解物方面显示出巨大潜力，支持进一步探索这些水解物在功能性食品或旨在促进心血管健康的营养补充剂中的应用。