使用铜纳米粒子修饰的μPAD技术快速低成本检测原料牛奶中的土霉素

《Food Analytical Methods》：Rapid and Low-Cost Detection of Oxytetracycline in Raw Bovine Milk Using a Copper Nanoparticle-Functionalized μPAD

　　摘要
四环素类抗生素被广泛用于牛只，以治疗和预防细菌感染，包括肠道和全身性疾病。它们还用于治疗乳腺炎，这种病症会影响牛奶的质量和产量。不当或过度使用可能导致动物产品中残留抗生素，从而对公共卫生构成威胁，并促进抗菌素耐药性的产生。在这项研究中，我们检测了巴西东北部半干旱地区的生牛乳中的土霉素（OTC）残留量。我们使用了一种基于纸张的微装置（μPAD），其中含有铜纳米颗粒（CuNPs）。样品来自30头随机选取的Girolando奶牛的四个乳头上。该方法表现良好，显示出1至25 μg mL?1范围内的线性响应，并具有较高的相关系数（R2 = 0.99946）。回收率为94.70%，表明其准确性与国家标准相符。检测限和定量限分别为0.47和1.56 μg mL?1。总体而言，μPAD是一种有效、灵敏、低成本且便携的工具，适用于检测生牛乳中的土霉素。

图解摘要
四环素类抗生素被广泛用于牛只，以治疗和预防细菌感染，包括肠道和全身性疾病。它们还用于治疗乳腺炎，这种病症会影响牛奶的质量和产量。不当或过度使用可能导致动物产品中残留抗生素，从而对公共卫生构成威胁，并促进抗菌素耐药性的产生。在这项研究中，我们检测了巴西东北部半干旱地区的生牛乳中的土霉素（OTC）残留量。我们使用了一种基于纸张的微装置（μPAD），其中含有铜纳米颗粒（CuNPs）。样品来自30头随机选取的Girolando奶牛的四个乳头上。该方法表现良好，显示出1至25 μg mL?1范围内的线性响应，并具有较高的相关系数（R2 = 0.99946）。回收率为94.70%，表明其准确性与国家标准相符。检测限和定量限分别为0.47和1.56 μg mL?1。总体而言，μPAD是一种有效、灵敏、低成本且便携的工具，适用于检测生牛乳中的土霉素。

引言
牛奶是人类饮食的重要组成部分，因为它富含营养。它含有乳糖、蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质和酶（Biland?i? et al. 2015; Ribeiro et al. 2022; Mellors et al. 2023; Wilms et al. 2024）。2022年，全球牛奶产量超过了5.3亿吨。巴西在2024/2025年度的牛奶生产排名中位列第六（Tadesse et al. 2024; USDA 2025）。牛奶生产链对经济和粮食安全至关重要。在巴西，东北部和阿拉戈拉斯州为牛奶生产做出了重要贡献（Sachi et al. 2019; Andrade et al. 2023; IBGE 2024）。
农民越来越多地使用兽医药物，特别是抗菌剂，以提高产量并保护动物健康。一个常见的用途是治疗乳腺炎等疾病，这是一种乳腺组织的炎症（Prado et al. 2015; Biland?i? et al. 2015; Sachi et al. 2019）。磺胺类药物和四环素类药物，如氯四环素（CTC）、多西环素（DXC）和土霉素（OTC），由于其广泛的疗效和低成本而在养牛业中得到广泛应用（Prado et al. 2015; Bellisai et al. 2023; Banerjee et al. 2024）。不合理使用兽医药物会导致牛奶中残留药物，这些残留物可能引起过敏反应、毒性问题以及由于批次处理而造成的经济损失（Licata et al. 2012; Guimar?es et al. 2020; Ahmad et al. 2021; Cruz et al. 2023; Bellisai et al. 2023）。因此，国际和国家机构制定了四环素的最高残留限量（MRLs）：虽然常见限量为100 μg L?1，但FDA允许的最大限度为300 μg L?1（FAO/WHO 1969; Zhanel et al. 2004; Fritz and Zuo 2007; Kishida 2011; Urapen and Masawat 2015; Banerjee et al. 2024）。
传统的分析方法，如HPLC、LC-MS/MS和电化学技术虽然精确，但需要先进的设备、高昂的成本和大量时间（De Ruyck et al. 2000; Chung et al. 2009; Kishida 2011; Pacheco-Silva et al. 2014; Zhang et al. 2022）。基于纸张的分析微装置（μPADs）是一种低成本、便携且快速的替代方案。它们利用基于纸张的微流控技术来控制液体的流动（Grudpan et al. 2015; Lu et al. 2021; Carolina Rafanhin Sousa et al. 2021; Soares et al. 2022）。将μPADs与比色技术结合使用，可以通过智能手机进行视觉和定量检测，从而减少试剂的使用和分析废物（Martins et al. 2015; Meneses et al. 2015; Masawat et al. 2015; Rossini et al. 2019; de Fran?a et al. 2021; Guimar?es F. Júnior et al. 2022; Zhang et al. 2022; Soares et al. 2022）。此外，金属纳米颗粒，如淀粉稳定的铜纳米颗粒（CuNPs），可以增强比色方法的效果，因为它们具有催化特性，并能与其他抗生素（如OTC）形成复合物，从而提高检测灵敏度（Dungchai et al. 2011; Mallick et al. 2012; Khan et al. 2016; Lu et al. 2021; Carolina Rafanhin Sousa et al. 2021; Díaz-García et al. 2022）。
本研究的目的是利用一种含铜纳米颗粒的基于纸张的分析微装置来测定生牛乳中的OTC残留量。目标是开发一种便携、快速且低成本的方法，以监测牛奶质量并确保食品安全。

材料与方法
本研究中使用的所有试剂均无需预先处理。三氯乙酸（C2HCl3O2）和氢氧化铵（NH4OH）购自Merck公司。纯度≥96%的土霉素（C22H25N2O9）购自Sigma-Aldrich公司。铜纳米颗粒（CuNPs）的制备方法按照Khan等人（2016）的描述进行。关于显色溶液（CuNPs + NH4OH）制备的详细信息见补充材料。傅里叶变换红外光谱（FTIR）使用Nicolet? Summit X光谱仪（Thermo Scientific）录制，该光谱仪配备了衰减全反射（ATR）附件。数据采集范围为4000至600 cm?1，光谱分辨率为4 cm?1，扫描次数为32次。
紫外-可见光（UV–vis）区域的吸光度分析用于确定样品在紫外和可见光范围内的吸光程度，分析仪器为单光束光谱仪（Thermo Fisher Scientific BioMate 3S）和双光束光谱仪（Shimadzu UV-1280），使用光程长度为10 mm的石英比色皿。
样品的形态学和成分分析采用扫描电子显微镜结合能谱分析（SEM-EDX）和透射电子显微镜（TEM）进行。SEM-EDX分析使用Tescan Vega3显微镜，配备了背散射电子探测器（BSE）和EDX微分析系统。TEM分析使用FEI Tecnai G2 Spirit Twin显微镜，在120 kV电压下进行，电子源为六硼化镧（LaB?）。EDX分析使用的探测器连接在显微镜上。有关样品制备和图像采集的更多细节见补充材料。

样品收集与处理
本研究从巴西东北部阿拉戈拉斯乳品基地农村地区的不同私人农场随机选取了30头乳房外观健康的Girolando奶牛。这些奶牛的乳房经过消毒，最初排出的牛奶被丢弃。收集的样品置于4°C的冷藏条件下保存（Agricultura and Abastecimento 2018; Kurjogi et al. 2019; Lu et al. 2021; Zhang et al. 2022）。
牛奶样品用10%（v/v）的三氯乙酸处理后进行均质化，随后离心分离上清液。所有使用的溶液均用的去离子水（DW）每日制备，以确保实验的可重复性和分析质量（Meneses et al. 2015; de Fran?a et al. 2021; Guimar?es F. Júnior et al. 2022）。

通过CuNP衍生物功能化的μPAD检测OTC
μPAD的制备方法见补充材料。将试剂依次施加到μPAD上，以确保分析方法的准确性（Masawat et al. 2015; Asif et al. 2020; Lu et al. 2021）。与文献中描述的使用多种额外显色试剂的方法不同，本研究仅使用CuNPs和氢氧化铵作为显色剂，以降低成本并简化分析流程。分析过程中，向μPAD的检测区分别滴加1.0 μL显色溶液（见补充材料），间隔约5分钟，确保活性物质充分固定。然后加入4.5 μL牛奶样品，通过产生的显色反应来检测OTC。获得分析信号所需的总时间约为25分钟，远少于以往研究报道的时间。

基于RGB的数字比色分析
定量分析基于公式 \((Mb-Mr)/Mr\) = mCOTC + b，其中Mb表示无OTC时的RGB值；Mr表示有分析物时的RGB值；m表示分析灵敏度（斜率）；COTC表示土霉素浓度；b表示线性系数。这种数学处理方法用于减少仪器误差并提高方法的稳健性（Asif et al. 2020; Guimar?es et al. 2020; Lu et al. 2021; Soares et al. 2022）。
检测区域在30 cm的距离下，使用50 MP像素的智能手机相机在受控LED照明条件下拍摄，所得图像 transferred 到计算机进行进一步分析。通过计算比色区域的平均像素强度来确定OTC浓度，假设绿色通道的强度越高表示OTC浓度越高（Asif et al. 2020; Guimar?es et al. 2020; Carolina Rafanhin Sousa et al. 2021; Zhang et al. 2022）。

分析方法验证
通过统计分析UV–Vis光谱在375 nm处的比色数据来验证分析方法，该波长被确定为OTC的最大吸收波长。随着抗生素浓度的增加，OTC溶液的黄色强度呈比例加深，这与现有文献的结果一致（Urapen et al. 2015; Masawat et al. 2015）。实验重复三次，以评估方法的线性、重现性和稳健性，并确定检测限（LOD）和定量限（LOQ）。LOD和LOQ值根据分析响应的标准差和校准曲线的斜率计算得出，分别考虑了三个和十个标准差，符合广泛接受的分析方法验证标准（Asif et al. 2020; Guimar?es et al. 2020; Abdulsattar et al. 2020; Lu et al. 2021; Carolina Rafanhin Sousa et al. 2021）。最终验证通过双光束UV–Vis光谱法完成。添加了牛奶的样本显示出了钙（Ca）和磷（P）的特征光谱信号，同时还检测到了钾（K）和钠（Na）的微量痕迹。图2中的替代文本可能是通过人工智能生成的。全尺寸图像。

μPAD衍生物的扫描电子显微镜（SEM）显微照片：a CuNPs；b CuNPs + NH3（水溶液）；c CuNPs + NH3（水溶液）+ OTC；d CuNPs + NH3（水溶液）+ 牛奶。这些结果表明，在牛奶这种复杂基质的存在下，μPADs中观察到的形态和成分变化直接归因于铜（II）离子与氧四环素（OTC）之间的化学相互作用。这些结果证实了所提出的比色检测机制的有效性，并证明了使用μPADs快速分析牛奶中OTC的可行性。

分析了CuNPs与OTC之间的相互作用。OTC与铜（II）的相互作用在该μPAD设备的发展中起着关键作用。为了阐明这种相互作用，应用了傅里叶变换红外光谱（FTIR）和紫外-可见光谱（UV–vis）技术。四环素（TC）与纸基质中的铜（II）相互作用，形成有色的复合物，从而产生了分析响应。根据Lu等人（2021年）的研究，配位可能涉及到三级胺的氮原子和一个相邻的羟基，形成一个显示绿色的羟基复合物。然而，文献（Baker和Brown 1966年；Dudek和Snow 1966年；Williamson和Everett 1975年；Jogun和Stezowski 1976年；Lee和Everett 1981年；Brion等人1985年、1986年；M. Mikulski等人1988年；Jezowska-Bojczuk等人1993年；Guerra等人2005年）更广泛地支持通过氧供体原子进行配位，特别是位于δ环上的羟基和酰胺基团（图3）。这种结合模式与已报道的结构数据一致，例如[HgCl?(OH?)TC]2?复合物的晶体学特性（Jogun和Stezowski 1976年），进一步证实了基于氧的配位在四环素-金属相互作用中的作用。

图3中的替代文本可能是通过人工智能生成的。全尺寸图像。

OTC的分子结构式。

CuNP悬浮液的UV–vis光谱（图4）显示了由于悬浮纳米粒子引起的典型指数衰减轮廓。加入氨水后，悬浮液变为蓝色（图S3），相应的光谱（图4）显示出一个在650纳米处具有最大值的强烈、对称且宽的带。这个带出现在可见光区域，加上观察到的蓝色溶液，强烈表明形成了一个铜（II）-胺复合物，该复合物的一般公式为[Cu(NH3)?-xL?]2?（1 ≤ x ≤ 5；L = H?O或其他中性配体）（Elliott和Hathaway 1966年；Lever 1968年；Earl 1985年；Lu等人2021年）。加入OTC或牛奶后，蓝色溶液变为绿色（图S3），这表明胺配体被螯合物种所取代。这导致了图1中所示的假设。在最初形成铜（II）-胺复合物（蓝色溶液）之后，胺配体逐渐被OTC螯合配体取代，从而生成绿色溶液（或设备上的绿色斑点）。

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加入氨水前后CuNPs悬浮液的UV–vis光谱。石英比色皿，b = 1厘米。

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铜（II）胺复合物（蓝色溶液）和铜（II）- OTC复合物（绿色溶液）的形成。

图5显示了OTC（固态）和铜（II）胺复合物（支持在纸上）的FTIR光谱。OTC的光谱显示了与酰胺和芳香官能团相关的预期带，包括ν(C≡O)和δ(N–H)模式（Li等人2010年；Rakshit等人2013年）。

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化合物的FTIR光谱。左图：a 纸支撑；b 支持在纸上的铜（II）胺复合物（发色团）；c 固态OTC（ATR模式）。右图：a 纸支撑；b 固态OTC（ATR模式）；c 发色团；d 发色团 + OTC；e 发色团 + 牛奶。右图中的c、d和e光谱是针对支持在纸上的样品收集的。

铜（II）胺复合物的形成得到了N–H伸缩和弯曲模式的带的出现的支持，这与配位胺物种一致（Nakamoto 2009年）。绿色物种中OTC的存在通过1700–1550厘米?1区域的带得到证实，这些带相对于游离OTC显示出红移。特别是ν(C≡O)带（酰胺和环羰基）向低波数的移动是配位的诊断特征，表明OTC通过氧供体原子与铜（II）发生了螯合，这与所提出的配体交换机制一致（Li等人2010年；Rakshit等人2013年）。

使用μPAD进行比色测定的验证和优化

对方法进行分析验证对于确保结果的可靠性、准确性和重复性至关重要。这一过程是通过评估用OTC强化过的牛奶样本构建的校准曲线来进行的（图6），该校准曲线在研究的浓度范围内是线性的，证明了所提出方法的适用性。线性通过相关系数得到确认，表明分析数据满足了监管机构制定的性能标准。

图6中的替代文本可能是通过人工智能生成的。全尺寸图像。

用OTC强化的牛奶样本进行UV–vis分光光度分析的校准曲线。

在受控实验条件下获得的分析数据变化较小，证实了方法的稳健性。在1至25微克每毫升（μg mL?1）的分析浓度范围内，显示出了高线性（R2 = 0.99901）和准确性。LOD（检测限）和LOQ（定量限）值是根据响应的标准差和校准曲线的斜率（分析灵敏度）确定的，分别使用了3和10的乘法因子。LOD和LOQ值分别为0.02微克·毫升?1和0.07微克·毫升?1。虽然传统的HPLC方法用于OTC检测需要大量的样品清洗和较长的分析时间，但所提出的μPAD在不到25分钟内即可得出结果，且试剂用量极少（< 5微升）。这显著减少了分析通量和每次检测的成本，使其成为现场质量控制的快速筛查工具（Shalaby等人2011年）。

所达到的分析限值与先前报道的结果一致。Masawat等人（2015年）报道了在类似 dairy 基质中OTC的检测限为10微克每千克（μg kg?1），而Bellisai等人（2023年）报告的LOD和LOQ值分别为0.03和0.10微克每毫升（μg mL?1）。这些值与本研究中获得的值接近，进一步增强了所开发分析方法的可靠性、灵敏度和潜在应用性（Masawat等人2015年；Bellisai等人2023年）。

比色法和数字分析用于测定牛奶中的氧四环素

本研究中使用的比色反应基于CuNPs与氨水相互作用后形成的铜（II）胺复合物。胺配体通常在溶液中形成蓝色的铜（II）复合物，这归因于d-d配体场的电子跃迁，与可见光谱红色区域的辐射吸收有关（Elliott和Hathaway 1966年；Vogel 1979年；Earl 1985年）。这种光谱行为与大约D4h对称性的配位球相关（Procter等人1968年）。

在检测区域进行的定量分析使用了智能手机捕获的图像，并通过ImageJ进行处理，从而可以确定平均像素强度。观察到绿色强度与氧四环素（OTC）浓度之间存在直接相关性：绿色信号的强度越大，说明牛奶样本中抗生素的含量越高，如图7所示。

图7中的替代文本可能是通过人工智能生成的。全尺寸图像。

分析了用OTC强化的牛奶样本（微克每毫升（μg mL?1）。

为了确认比色结果（图7）并量化OTC的水平，还对剩余的牛奶样本应用了补充的分析方法（图8）。

图8中的替代文本可能是通过人工智能生成的。全尺寸图像。

所提出方法的校准曲线是通过将比色强度与OTC浓度相关联构建的，在1.0到25.0微克每毫升（μg mL?1）范围内显示出线性趋势（R2 = 0.99946），证明了所使用分析模型的可靠性。获得的回收率（94.70%）表明精度良好，符合现行法规制定的标准。尽管原始牛奶中存在已知会与四环素相互作用的Ca2?和蛋白质，但从蓝色到绿色的明显颜色变化证实了OTC对铜（II）-胺复合物的亲和力足以克服基质干扰。通过分光光度分析（图S4）验证了牛奶基质中没有光谱干扰。然而，与纯化溶液相比回收率的轻微变化可能是由于这些较小的竞争效应。

此外，LOD（0.47微克每毫升（μg mL?1）和LOQ（1.56微克每毫升（μg mL?1）的值表明该方法对分析物定量具有足够的灵敏度，相对标准偏差也为0.32，这与复杂基质中的比色分析一致。这些结果与之前的研究结果相符，支持了所建议的方法的稳健性和适用性（Urapen和Masawat 2015年；Masawat等人2015年；Lu等人2021年；Bellisai等人2023年）。Rahman和Raheem（2024年）也开发了一种高灵敏度的比色方法用于在同一基质中测定OTC，在1.0到10.0微克每毫升（μg mL?1）范围内获得了线性（R2 = 0.9981），LOD为0.33微克每毫升（μg mL?1）；结果与本研究中观察到的结果相当。

结论

如本研究讨论的那样，检测乳制品中的OTC对于减少生产链中的浪费、防止经济损失和保护公共健康非常重要。在许多情况下，尤其是在偏远地区，传统分析方法的应用受到高成本、需要专门的实验室基础设施以及分析时间长的限制。在这种情况下，μPADs作为一种可行、高效且成本效益高的替代方案，适用于筛查原始牛乳中的OTC残留物。

本工作中开发的铜纳米粒子功能化μPAD提供了显著的分析和操作优势，包括快速的结果（分析时间约为25分钟）、低试剂消耗、操作简便，以及无需复杂设备或高度专业化人员即可直接在挤奶厅操作。此外，该方法通过使用少量试剂和减少潜在有害化学废物的产生，体现了可持续性的原则。

从分析角度来看，所开发的方法表现令人满意，具有1–25微克每毫升（μg mL?1）的线性检测范围、R2为0.99946以及94.70%的平均回收率，表明其精确度和准确性符合既定的分析标准。此外，低检测限和定量限（分别为0.47和1.56微克每毫升（μg mL?1），加上高精度（RSD = 0.32%，n = 3），证明了该方法适用于强化牛奶的分析。

因此，可以得出结论，用铜纳米粒子功能化的μPAD是一种有效、实用且成本低廉的分析工具，可用于检测原始牛乳中的氧四环素残留物，在质量控制、现场监测和食品安全支持方面具有广阔的应用前景。