将基因组毒力及抗菌素耐药性决定因素与新兴牛乳腺炎病原体乳酸肠球菌（Enterococcus lactis）的宿主相互作用表型联系起来 玛丽亚·F·塞里奥利（Maria F. Cerioli）， 弗朗科·D·费尔南德斯（Franco D. Fernández）， 梅利娜·V·莫利瓦（Melina V. Moliva）， 米沙埃尔·桑切斯-佩雷斯（Mishael Sánchez-Pérez）， 费德里科·塞拉尔（Federico Serral）， 达里奥·费尔南德斯·多波尔托（Darío Fernández Do Porto）， 埃利娜·B·雷尼索（Elina B. Reinoso）

《Bacteria》：Linking Genomic Virulence and Antimicrobial Resistance Determinants to Host-Interaction Phenotypes in the Emerging Bovine Mastitis Pathogen Enterococcus lactis María F. Cerioli, Franco D. Fernández, Melina V. Moliva, Mishael Sánchez-Pérez, Federico Serral, Darío Fernandez Do Porto and Elina B. Reinoso

　　**摘要**
乳酸肠球菌（Enterococcus lactis）日益被认为是引发乳腺炎的新兴病原体，但其毒力机制及相关健康风险的功能基础仍不明确。本研究对从患有亚临床乳腺炎的牛体内分离出的EL-A150菌株进行了综合的基因组和表型分析。全基因组测序显示，该菌株拥有一条2.49 Mb的环状染色体，编码多种与黏附（acm、bepA、fms、sagA）、生物膜形成（empB、empC）以及抗生素耐药性相关的基因，其中包括针对氨基糖苷类和大环内酯类的耐药决定因子。表型检测结果表明，该菌株生长迅速，具有很强的生物膜形成能力，并能高效黏附于牛乳腺上皮细胞，但其内在化能力较弱，细胞内持久性短暂。比较基因组分析确认了该菌株属于乳酸肠球菌分支（ANI与参考基因组的相似度达99.5%），且其耐药谱主要由染色体编码的基因构成，未检测到质粒或大型移动遗传元件。综上，EL-A150菌株具备促进乳腺内定植的特征，符合机会性病原体的定义。该菌株的毒力潜力与临床相关抗生素耐药性的共存凸显了“同一健康”（One Health）问题的紧迫性，强调了需要建立将功能验证与基因组风险评估相结合的监测体系。

**1. 引言**
乳腺炎是奶制品生产中影响最大的疾病之一，导致重大经济损失并降低牛奶质量。该病由多种环境和传染性细菌引起，这些细菌能够在临床和亚临床形式下造成持续感染[1,2]。有效管理需依赖于准确识别病原体，但传统表型方法在区分密切相关的菌株时存在局限性[3]。全基因组测序（WGS）技术的出现有效克服了这一诊断难题，实现了物种级别的精准鉴定，并揭示了此前被忽视的乳腺相关病原体。乳酸肠球菌就是其中之一，尽管在系统发育上与粪肠球菌（E. faecium）相近，但遗传和代谢特征已证明存在差异[4,5]。历史上这种菌株常与乳制品相关联，但最近在乳腺炎病例中被发现，证实了其在临床环境中的存在[6]。从环境共生菌向潜在乳腺内病原体的转变提出了关于其致病机制的关键未解问题，尤其是其黏附和损害乳腺的毒力决定因子尚未明确。此外，其抗生素耐药性的功能与临床意义尚不明确。目前对乳酸肠球菌在乳腺炎中的认识虽然有所增加，但仍存在碎片化。尽管有研究（如阿根廷最近的一项基因组和表型分析[6]）确认了其存在并提供了特定菌株的信息，但基因组毒力和耐药性决定因子在乳腺炎发病机制中的关键作用尚未在综合框架下得到系统评估。同时，抗生素耐药基因在动物-人类-环境界面上的临床意义、进化起源及传播潜力也尚未阐明，限制了从“同一健康”角度进行风险评估。

**2. 材料与方法**
2.1. **细菌分离、表型鉴定与储存**
EL-A150菌株来自阿根廷中部地区一例亚临床乳腺炎奶牛的混合乳样。农场兽医部门通过体细胞计数（SCC > 200,000细胞/mL）及加州乳腺炎检测（CMT）阳性结果确认了该病[7]。样品在添加了5%去纤维化牛血的胰蛋白酶大豆琼脂上培养，并于37°C条件下有氧培养24小时。选取形态均匀的单一菌落，储存在含有20%甘油的大脑心脏浸液（BHI）培养基中（-20°C）。
初步鉴定采用常规微生物和生化方法（如革兰染色、过氧化氢酶测试、胆汁-埃斯库林水解、6.5% NaCl培养及45°C培养）[8]，初步判断该菌株属于粪肠球菌属。为进一步确认，使用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′）扩增16S rRNA基因。PCR反应体系包括1× PCR缓冲液、1.5 mM MgCl2、0.2 mM dNTP、0.5 μM引物、1 U Taq DNA聚合酶及约50 ng DNA模板。热循环条件为：初始变性95°C 5分钟；然后95°C 30秒、55°C 30秒、72°C 90秒；最后72°C延伸10分钟。PCR产物经过纯化后进行双方向测序，并与公共数据库中的参考序列比对。最终通过全基因组测序确定了菌种。
2.2. **表型检测**
2.2.1. **细菌生长曲线**
10个菌落接种到胰蛋白酶大豆琼脂（TS；Britania，阿根廷）上，在37°C条件下振摇培养18小时。次日将菌液1:100稀释后重复培养。每2小时采集一次样本，连续72小时监测。总细胞密度通过OD660值测定，活菌数通过标准稀释和平板计数方法获得[9]。每个生长曲线实验重复两次。
2.2.2. **生物膜形成**
采用[10]描述的标准化微量平板法评估生物膜形成情况，该方法适用于多种实验条件的高通量评估。稀释后的菌液接种到96孔平底板中，37°C培养24小时后进行染色和 absorbance 测定。每个菌株重复四次实验。
2.2.3. **黏附、内在化及MAC-T细胞中的存活**
黏附和内在化实验遵循[11]方法进行，使用含有氢化可的松（4 μg/mL）、热灭活胎牛血清（10%；GIBCO）及抗生素混合物（ATM 100×；GIBCO）的DMEM培养基培养细胞。 confluent 后，用定义的感染复数（MOI）接种细菌悬浮液。感染后洗涤细胞并裂解，然后接种到TSA平板上计数黏附细菌。为排除外源细菌，感染后加入庆大霉素。接着洗涤细胞并裂解，计数内在化细菌。
2.2.4. **抗生素敏感性测试**
采用Mueller–Hinton琼脂上的纸片扩散法进行抗生素敏感性测试。细菌悬液调至0.5 McFarland浊度（约1–2 × 10^8 CFU/mL，按CLSI指南[13]）。测试常用抗乳腺炎抗生素，包括β-内酰胺类（氨苄西林10 μg和青霉素10 IU）、大环内酯类（红霉素15 μg）、氨基糖苷类（庆大霉素10 μg和链霉素15 μg）、氨苯砜类（氯霉素30 μg）及糖肽类（替考拉宁30 μg和万古霉素30 μg）。粪肠球菌ATCC 29212作为质量控制菌株。
2.3. **基因组DNA提取、测序、组装与物种确认**
使用Wizard? Genomic DNA Purification Kit（Promega Corporation, Madison, WI, USA）从过夜培养的菌株中提取高分子量基因组DNA。通过琼脂糖凝胶电泳验证DNA完整性，使用NanoDrop?和Quantus?荧光仪测定纯度和浓度（Promega Corporation, Madison, WI, USA）。Illumina文库使用TruSeq DNA Nano试剂盒制备，并在NovaSeq 6000平台上测序（2 × 150 bp；Macrogen，韩国）。采用Trycycler进行混合基因组组装，结合Medaka（长读长校正）和Polypolish（短读长修正）两轮处理。组装质量指标（如完整性、污染程度）使用BUSCO（lactobacillales_odb10）和CheckM v1.4.0评估。结构与功能注释通过NCBI PGAP流程完成。KEGG同源基因分配和通路重建通过KAAS和BBH（双向最佳 hit）方法实现。最终物种鉴定通过多相基因组方法完成：平均核苷酸相似度（ANI）和数字DNA-DNA杂交（dDDH）分别使用OrthoANIu和TYGS服务器计算[14,15]。系统发育定位通过最大似然树确认，该树基于OrthoFinder v2.5.2鉴定的单拷贝同源基因构建。
2.4. **深入基因组分析与比较**
通过查询预测编码序列与Virulence Factor Database（VFDB）核心数据集进行毒力谱分析。使用Comprehensive Antibiotic Resistance Database（CARD）的Resistance Gene Identifier（RGI）（Perfect/Strict hits）[16]鉴定耐药决定因子，并通过ResFinder[17]验证。耐药基因的基因组位置（质粒或染色体定位，以及与移动遗传元件的关系）通过Artemis v18.0.0和BLAST 2.17.0与公共质粒数据库比对手动确认。CRISPR阵列和Cas操纵子通过CRISPRCasFinder分析，不完整或可疑的噬菌体区域通过PHASTER标记。基于CGE的Enterococcus faecium MLST方案进行MLST（多基因位点序列分型）。管家基因序列直接从基因组组装中提取并与PubMLST数据库比对。菌株与参考菌株的基因组同源性通过OrthoFinder v2.5.2确定。核心基因的注释使用Prokka标准化。核心基因的多序列比对采用MAFFT（L-INS-i算法），最大似然系统发育树构建使用IQ-TREE和ModelFinder进行替代模型选择及1000次超快速bootstrap复制。
2.5. **统计分析**
数据以平均值±标准误差（SEM）表示。所有实验重复三次。统计分析使用InfoStat软件（UNC, Córdoba, Argentina）[19]完成。组间差异通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较测试评估，p < 0.05视为显著差异。

**3. 结果**
3.1. **菌株鉴定**
基于常规微生物和生化特征，该菌株表现出典型肠球菌的表型特征：革兰阳性、过氧化氢酶阴性、胆汁-埃斯库林水解、能在6.5% NaCl和45°C下生长。16S rRNA基因序列部分分析显示与肠球菌属高度相似（>99%），但该标记不足以明确区分粪肠球菌和乳酸肠球菌。通过全基因组测序确认其属于乳酸肠球菌。**表型特征**
乳酸菌EL-A150的生长动力学显示出一个短暂的延迟阶段，随后在接种后2至6小时之间进入一个明确的指数增长阶段（图1）。最大细胞密度大约在8小时时达到，之后培养物进入并保持在一个稳定阶段。利用指数增长期间的活菌计数计算得出的世代时间为34.1分钟，表明在测试条件下生长迅速。

**生物膜形成能力**
与这种生长特性一致，EL-A150表现出强烈的生物膜形成能力，因此被归类为高生物膜产生菌（图2A）。此外，生物膜的形成遵循一个明确的时间依赖性动力学模式。在早期培养时间，检测到较低的附着生物量，这对应于初始粘附阶段。随后在中等时间点观察到生物膜生物量的显著增加，表明生物膜正在活跃发展。在后期阶段，观察到最高的生物量水平，这与成熟生物膜的形成相符（图2B）。

**牛奶成分对生物膜形成的影响**
在含有葡萄糖（0.5% w/v）、乳糖（0.5% w/v）或酪蛋白（3 mg/mL）的TSB培养基中培养24小时后，牛奶成分对生物膜形成的影响进行了研究。条形图表示平均值±标准误（SEM）。呈现了三次独立实验的平均值。统计学上显著的差异用不同的字母表示（p < 0.05）。值得注意的是，在酪蛋白存在下，生物膜形成得到增强，其吸光度值超过了对照组（p < 0.05）。相比之下，添加乳糖或葡萄糖会导致生物膜生物量减少（p < 0.05）（图2C）。

**与MAC-T细胞的相互作用**
在MAC-T细胞相互作用实验中，EL-A150表现出较高的粘附能力（8.7 × 10^6 CFU/孔），但内化率较低（0.65%）。该菌株在细胞内存活时间可达24小时，之后活菌计数逐渐下降。72小时后未检测到存活细菌，表明其在MAC-T细胞内的长期存活能力有限（图3）。

**基因组组装与关键特征**
EL-A150的基因组由一个2,486,471 bp的环状染色体组成，G+C含量为38.60%。基因组注释预测有2480个编码序列（CDSs），包括67个假想蛋白，以及一个完整的rRNA操纵子和21个tRNA基因。使用busCO v5.1.1评估基因组完整性，使用bacteria_odb10数据集时完整性为98.4%（121/124个完整的BUSCOs），使用Lactobacillales_odb10数据集时完整性为99.0%（398/402个完整的BUSCOs），确认了该草图基因组的高质量（图4）。EL-A150的完整基因组序列已存入GenBank，登录号为GCA_054404755.1（WGS项目JBTIZM01）。

**系统发育分析**
全基因组测序为EL-A150的分类提供了强有力的证据。如表1所示，EL-A150与乳酸菌参考菌株的平均核苷酸身份（ANI）值最高，达到99.50%，与BT159菌株相吻合。这一值远高于通常接受的95–96%的物种边界，支持其被归类为乳酸菌。相比之下，与其他乳酸菌物种（如粪肠球菌（95.37%）和持久肠球菌（77.38%）的ANI值明显较低。

**结论**
综上所述，基因组分析和系统发育分析均支持将EL-A150归类为乳酸菌。此外，比较基因组分析、dDDH分析和抗菌素抗性分析的结果也进一步证实了这一分类。这些发现共同表明EL-A150具有乳酸菌的特性，强调了其在牛乳腺炎中的重要作用。这种差异突显了生态背景的决定性作用，表明临床环境可能会激活核心基因组中编码的潜在致病性特征，并强调乳酸乳杆菌（E. lactis）的风险本质上依赖于具体环境。尽管它携带具有临床相关性的抗性基因（例如 ermB、aac(6′)-Ii），但其抗性基因组不如适应医院环境的粪肠球菌（E. faecium）克隆那么丰富，这与其起源于动物环境的特性相符。重要的是，其移动基因组（mobilome）结构与其他乳腺炎分离株存在明显差异。与携带大型质粒的 SU-B46 菌株不同，EL-A150 缺乏可检测到的自主质粒，且其噬菌体区域的转座活动迹象也不明显。然而，CRISPR-Cas 系统和整合噬菌体区域的检测证实了其曾暴露于移动遗传元素，而这些元素中缺乏插入序列进一步支持了其基因组的稳定性。这一观察结果与群体基因组学研究一致，后者表明乳酸乳杆菌通常具有较低的水平基因转移率，并且其基因组比致病性粪肠球菌谱系更为稳定 [21,22]。EL-A150 中缺乏可检测到的质粒和可转移的抗性基因，这与 Ahmed [25] 的研究结果一致，后者认为来源于肠道的乳酸乳杆菌菌株具有较高的安全性。然而，从临床环境中分离出 EL-A150，以及 SU-B46 菌株（该菌株确实携带质粒 [6]）的存在，凸显了与乳腺炎相关乳酸乳杆菌在基因组和生态学上的显著异质性。这些发现表明，该物种的乳腺内致病性可能通过不同的基因组策略实现：要么通过利用宿主染色体上的毒力基因库（如 EL-A150 所示），要么通过质粒介导的基因获取（如 SU-B46 所示）。

对 EL-A150 抗性基因组的分析揭示了基因型与表型之间的混合相关性，从而更精确地评估其风险。虽然 ermB 基因能够准确预测红霉素抗性，但 aac(6)-Ii 基因并未赋予庆大霉素抗性，这表明该基因可能无效或未表达。同样，对糖肽的敏感性对应于一个被截短的、无功能的 vanY 基因片段以及其余 van 基因簇的缺失，这也表明该基因片段无效。这一片段可能是祖先 van 相关基因座的遗迹，或是基因获取不完全的结果。这些发现表明，EL-A150 拥有一个有限的、主要基于染色体的抗性基因组，且具有较低的抗性基因转移风险，这与其适应低抗生素压力环境（如奶牛群）的特性相符。MLST（多重序列型分析）进一步突显了与奶牛相关的乳酸乳杆菌的遗传多样性。EL-A150 被归类为 ST902 类型，而其他乳腺炎相关分离株则被归类为 ST296 [26]。这种多样性符合群体水平分析的结果，即乳酸乳杆菌是一个在遗传上高度异质性的物种，缺乏明显的克隆结构 [21,22]。乳腺炎相关分离株中存在多种序列类型，表明存在多次独立的生态适应事件，而非单一致病谱系的克隆扩张。因此，我们的研究结果共同表明，不应将乳酸乳杆菌简单地视为偶尔出现的乳腺炎分离株，而应将其视为一个在生态上多才多艺的物种，具有潜在的机会性致病性。EL-A150 的案例表明，即使没有主要的移动遗传元素，仅凭核心染色体上的黏附、生物膜形成和抗微生物能力也足以引起乳腺内感染。

分析还显示，乳酸乳杆菌的抗性基因组具有复杂的基因型-表型关联，这有助于更准确地评估其风险。尽管 ermB 基因能完美预测红霉素抗性，但 aac(6)-Ii 基因并未赋予庆大霉素抗性，表明该基因可能无效或未表达。同样，对糖肽的敏感性也与一个被截短的、无功能的 vanY 基因片段及其相关基因簇的缺失有关，这进一步证实了这些基因的无效性。这些发现表明，EL-A150 的抗性基因组主要基于染色体，且转移风险较低，这与其适应低抗生素压力环境（如奶牛群）的特性相符。通过对 EL-A150 抗性基因组的分析，我们可以看到其抗性特征的多样性和复杂性。

总体而言，我们的研究结果强调了将功能基因组学分析纳入监测程序的必要性，将重点从描述性检测转向可操作的风险分层。未来的监测工作应优先识别关键的适应性特征（无论是染色体上的还是移动的），以便更好地预测和管理乳酸乳杆菌在奶牛群中的出现。这种方法对于保护动物健康以及减轻潜在的人畜共患病和抗生素抗性风险至关重要，符合“同一健康”（One Health）框架的要求。最后，EL-A150 的致病性特征——包括染色体上的毒力因子和缺乏移动抗性基因——展示了肠球菌属（Enterococcus）中存在的风险潜力范围。肠球菌因其同时具有机会性病原体和潜在益生菌的双重角色而常被称为“双刃剑”[27]。通过采用整合的基因组和表型分析方法，本研究不仅局限于毒力基因的检测，还功能性地验证了这些基因在宿主相互作用中的作用。这种方法为区分无害共生菌和新兴病原体提供了实用的模型，有助于在动物健康等领域进行明智的风险评估。从实际应用的角度来看，这些发现支持将乳酸乳杆菌纳入常规的 PCR 基础乳腺炎筛查方案。鉴于此处发现的乳酸乳杆菌菌株间的异质性，进行菌株水平的评估和常规表型敏感性测试对于指导治疗决策和防止耐药菌株的出现至关重要。

**结论**
本研究对乳酸乳杆菌 EL-A150 进行了综合的基因组和功能分析，确认了其在牛乳腺炎中的机会性致病作用。我们的发现表明，乳酸乳杆菌具有稳定的基因组结构，并具备适应特定生态环境的特征，可用于实现乳腺内的定植。通过将基因组特征与实验验证的表型联系起来，本研究建立了针对新兴乳腺炎相关肠球菌的菌株水平风险评估框架。未来的监测工作应结合基因组分析和功能验证，以改进乳腺炎管理，并为动物-环境界面上的“同一健康”策略提供依据。