膳食中的乳酸通过促进乳酸转运并激活由GPR81介导的产热作用，从而改善高脂饮食引起的肥胖

《Food Innovation and Advances》：Dietary lactic acid ameliorates high-fat diet-induced obesity by promoting lactate transport and activating GPR81-mediated thermogenesis

　　肥胖及其相关的代谢疾病对人类健康构成了严重威胁，因此需要确定安全有效的营养干预机制。乳酸是酸奶、酸菜和发酵肉类等产品中的关键风味和功能性成分，在日常饮食中普遍存在。除了赋予这些食物特有的酸味和防腐效果外，最近的研究表明，乳酸在体内作为能量底物和信号分子，在代谢调节中起着关键作用。然而，其背后的机制仍不清楚。本研究旨在探讨膳食中的乳酸如何帮助减轻肥胖。通过使用高脂肪饮食诱导的肥胖小鼠模型，研究了乳酸对体重、葡萄糖耐受性、胰岛素敏感性和脂质代谢的影响。结果表明，外源性乳酸干预有效降低了高脂肪饮食诱导的肥胖小鼠的体重，同时改善了葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性。乳酸灌胃显著增加了组织中的乳酸积累，并通过激活单羧酸转运蛋白1（MCT1）和单羧酸转运蛋白4（MCT4）以及乳酸特异性受体G蛋白偶联受体81（GPR81）来改善肝脏脂质沉积。这些效应增强了脂肪组织中的脂质代谢和产热作用，从而减轻了肥胖及其代谢综合征。本研究为膳食乳酸作为肥胖干预策略提供了新的理论证据。

引言
肥胖及其相关的代谢综合征已成为全球日益严重的公共卫生问题。2021年，估计有21.1亿成年人超重或肥胖，占全球人口的一半[1]。肥胖也是非传染性疾病负担增加的主要原因，2型糖尿病、心血管疾病和脂肪肝与肥胖密切相关。研究表明，肥胖是一种由遗传、代谢、行为和环境因素复杂交互作用引起的慢性疾病。然而，其本质仍然是能量摄入与能量消耗之间的不平衡，多余的能量转化为甘油三酯并积累，导致脂质沉积。目前，除了生活方式干预（如饮食控制和增加体力活动）外，还出现了针对BMI严重升高患者的医疗干预措施，包括药物治疗、医疗设备和减肥手术[2]。然而，在实际应用中，高强度的生活方式干预往往难以持续，而医疗干预则存在显著的缺点，包括体重反弹、副作用和严重并发症。因此，探索减肥机制并找到安全可靠的治疗策略已成为当前减重研究的关键领域。哺乳动物的脂肪组织主要分为三种类型：白色脂肪组织（WAT）、棕色脂肪组织（BAT）和米色脂肪组织（beige adipose tissue）。WAT主要负责能量储存，而BAT和米色脂肪组织则参与产热作用，在维持体温和调节能量代谢中起关键作用。在寒冷刺激下，BAT中的交感神经末梢分泌去乙酰化蛋白1（UCP1），促进能量以热量的形式释放[3]。此外，在寒冷等条件下，白色脂肪细胞也可以转变为米色脂肪细胞表型，其特点是产热相关基因的表达增加。动物研究表明，激活BAT可以显著提高基础代谢率，减少脂肪积累，并改善葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性[4]，为肥胖及其代谢疾病的干预提供了新的见解。以往的研究通常将乳酸视为无氧代谢的副产物，但最近的研究表明，乳酸在身体能量代谢中起着关键作用。乳酸通过在生产细胞和消耗细胞之间穿梭，作为能量来源、信号分子和糖异生前体[5]，并且在肥胖、非酒精性脂肪肝疾病和癌症等各种病理生理过程中发挥作用。乳酸是TCA循环的主要碳源。模拟循环中乳酸增加的研究表明，乳酸进入线粒体基质并刺激线粒体电子传递链（ETC）的活性，从而增强线粒体ATP合成[6]。同样，膳食中的乳酸摄入可以激活G蛋白偶联受体，促进脂肪组织的褐色化，并减少高脂肪饮食喂养小鼠的肥胖[7,8]。肝脏中的乳酸积累可以通过乳酸化抑制脂肪酸合酶的活性，从而减少脂肪肝模型中的脂质积累[9]。此外，大量研究已将乳酸确定为运动诱导的食欲抑制的重要介质[10]。因此，乳酸可以通过多种机制减轻肥胖，包括促进代谢、增强产热和抑制食欲。乳酸特异性受体GPR81通过调节Gi信号通路及其相关信号分子参与组织和细胞的代谢过程。GPR81主要表达在脂肪组织中[11]，但也广泛存在于其他组织和器官中，如肝脏、肾脏和大脑[12]。研究表明，循环乳酸水平的升高可以激活GPR81，导致下游蛋白质的磷酸化，并诱导脂肪组织的产热和褐色化[12]。饮食中添加乳酸还可以激活GPR81，促进白色脂肪组织的褐色化[13]。乳酸的跨膜转运对哺乳动物细胞至关重要[14]。MCT1–4是双向质子耦合的单羧酸转运蛋白，位于线粒体和血浆膜上。它们的转运驱动力包括跨膜底物浓度梯度和局部质子可用性[15]。其中，MCT1和MCT4介导细胞内外的乳酸穿梭[16]，是脂肪细胞和肝细胞中乳酸吸收和释放的主要途径[17]。除了已知的乳酸穿梭作用外，研究表明MCT1和MCT4在代谢疾病中也具有功能作用。删除肝脏中的MCT1基因会加剧高脂肪饮食诱导的肥胖和肝脂肪变性[18]。此外，增加MCT4表达可以通过抑制脂质合成和促进脂质代谢来减少脂质积累。相反，抑制MCT4会导致细胞内脂质和葡萄糖代谢物的积累，引起肝脂肪变性[19]。在脂肪细胞中，MCT4敲除引起的细胞内乳酸积累也会促进白色脂肪组织的褐色化[20]。值得注意的是，以往关于乳酸介导的代谢调节的研究主要使用了乳酸钠或乳酸钙等盐形式，主要是为了中和酸度并便于给药。然而，在生理条件下，乳酸（pKa 3.86）及其盐形式在解离状态、跨膜转运途径和生物利用度方面存在根本差异。研究表明，高浓度乳酸钠（即乳酸离子）的暴露会导致细胞肿胀。由于H+离子有助于中和细胞内的负电荷，乳酸或乳酸离子和H+的同时增加可以稳定细胞体积[21]。到目前为止，尚缺乏系统研究外源性乳酸分子（而非其盐形式）对脂肪代谢的影响。虽然一些研究表明，外源性和内源性乳酸水平可以通过作用于转运蛋白和受体来影响身体的脂质代谢，但尚未研究外源性乳酸对乳酸转运蛋白和细胞内乳酸的影响，以及这一过程如何影响肥胖小鼠的脂肪组织代谢。因此，我们将乳酸灌胃给高脂肪饮食诱导的肥胖小鼠，评估了它们的肥胖程度变化，并测量了其组织和器官中相关的基因和蛋白质。为了区分乳酸阴离子和质子（H+）的不同贡献，还包括了一个等摩尔的乳酸钠处理组。我们发现，乳酸灌胃可以增加体内的乳酸水平，促进MCT1、MCT4和GPR81的表达，从而刺激棕色脂肪组织中的脂质代谢和产热作用，从而减轻小鼠的肥胖。相比之下，乳酸钠的减肥效果相对较弱。

材料与方法
**动物实验设计**
从Spf（北京）生物技术有限公司（北京，中国）购买了6周大的雄性SPF级C57BL/6J小鼠。这些小鼠被喂食来自Research Diets, Inc.的高脂肪饮食（60%脂肪+20%碳水化合物+20%蛋白质，5.24 kcal/g），并给予蒸馏水。小鼠被饲养在SPF动物设施中，环境温度为25 ± 2 °C，湿度为55% ± 10%，光照/黑暗周期为12小时。适应一周后，开始喂食高脂肪饮食以诱导肥胖。在适应期和实验期间，小鼠可以自由摄取水和食物。7周后，平均体重约为35克，相比对照组增加了超过20%，表明肥胖模型建立成功。根据体重将小鼠随机分为三组，每笼3-4只小鼠，每组10只小鼠。组别如下：高脂肪模型组（MOD）、乳酸（LA）处理组（Adamas-beta Reagent Co., Ltd，上海，中国）和乳酸钠（SLA）处理组（Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd，上海，中国）。每天给小鼠分别灌胃相应的处理剂。乳酸和乳酸钠的剂量均为1 × 10?3 mol/kg，乳酸以7.5 μL/mL的溶液制备，乳酸钠以11.2 mg/mL的溶液新鲜制备。高脂肪模型组同时给予等体积的蒸馏水。每周测量一次体重，每3天测量一次食物摄入量。实验结束时，小鼠禁食12小时，然后通过眼球抽取和颈椎脱位处死小鼠。收集血清、肝脏、肾脏、BAT、腹股沟白色脂肪组织（iWAT）、附睾白色脂肪组织（eWAT）、回肠、结肠和其他组织和器官进行进一步分析。

**葡萄糖耐受性测试**
在实验第12周进行葡萄糖耐受性测试（GTT）。禁食16小时后，以1.5 g/kg体重的剂量腹腔注射葡萄糖。在以下时间点从尾静脉采集血样：0、15、30、45、60、75和90分钟，测量血糖水平。以时间为x轴，血糖值为y轴绘制葡萄糖耐受性曲线，并计算曲线下面积（AUC）。

**胰岛素耐受性测试**
在GTT一周后进行胰岛素耐受性测试（ITT）。小鼠禁食6小时，然后腹腔注射1 IU/kg体重的胰岛素（诺和诺德，中国）。在以下时间点从尾静脉采集血样：0、15、30、45、60和75分钟，测量血糖水平。以时间为x轴，血糖值为y轴绘制胰岛素耐受性曲线，并计算曲线下面积（AUC）。

**小鼠呼吸代谢分析**
在实验第15周对小鼠进行呼吸代谢测试。从每组随机选择6只小鼠并记录其体重。将这些小鼠放置在一个呼吸能量代谢装置（Animal Respiratory Metabolism Measurement System，SE Systems GmbH，德国）中，可自由摄取食物和水分。设备设置为保持25 °C的恒定温度，光照/黑暗周期为12小时，每10分钟收集一次数据。实验持续36小时，前12小时为适应期，随后24小时内测量氧气消耗和二氧化碳产生量。

**小鼠活动分析**
在实验第15周进行小鼠活动分析。从每组随机选择6只小鼠并放置在一个活动监测系统（Animal Activity Measurement System，Columbus Instruments，美国）中，允许自由移动、进食和饮水。每10秒测量一次小鼠的活动水平。实验持续36小时，前12小时为适应期，随后24小时内测量活动数据。

**耐寒测试**
首先测量小鼠在室温下的直肠温度。在移除 bedding 后，将小鼠置于 4°C 的环境中，并在冷刺激后 1、2、3、4 和 5 小时测量其直肠温度。测量完成后，使用手持式红外热成像相机（杭州 Microimage Software Co., Ltd，中国杭州）拍摄红外热成像图，重点关注小鼠肩胛区域周围棕色脂肪组织的温度。随后使用 HIKMICRO 分析软件对图像进行解析。

**乳酸含量测定**
切割适量的组织，加入 PBS 中，并使用组织研磨机进行匀浆。离心后收集上清液进行测量。根据制造商的说明，使用 L-lactate (L-LD) 测定试剂盒（南京 Jiancheng Bioengineering Institute，中国南京）测定组织中的乳酸含量。使用微孔板读取器在 530 nm 波长下测量每个孔的吸光度值。

**组织病理学分析**
**H&E 染色**
从同一位置切割组织样本，并将其固定在 4% 的多聚甲醛缓冲液中。固定后，用 70% 的乙醇脱水，然后包埋在石蜡中并切成薄片进行 H&E (Hematoxylin 和 Eosin) 染色。染色完成后，将切片脱水并装片。在显微镜（Nikon Eclipse E100，Nikon Corporation，日本）下观察和拍照。对于脂肪组织切片（BAT、iWAT 和 eWAT），评估脂肪细胞的形态以及棕色脂肪组织中白色化的程度。

**油红 O 染色**
将样本冷冻在 OCT 包埋介质中形成块状，然后用组织固定剂固定冷冻切片。根据制造商的说明，使用油红 O 工作液进行染色。染色后，用异丙醇去除背景。接着进行苏木精复染，然后用甘油明胶装片。在显微镜下观察和拍照。分析肝脏组织切片中的红色脂滴分布和积累情况，以评估肝脏中的脂质沉积。

**血清生化参数**
收集小鼠的动脉血样本，在室温下静置 1 小时，然后以 3,000 rpm 的转速离心 15 分钟以分离血清。使用南京 Jiancheng Bioengineering Institute（中国南京）的试剂盒检测四个参数——甘油三酯 (TG)、总胆固醇 (TC)、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 和高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C)，严格遵循制造商的说明。

**RT-qPCR**
使用 Total RNA Extraction Reagent（南京 Vazyme Biotechnology Co., Ltd，中国南京）从组织细胞中提取总 RNA。通过使用 M5 Super Plus qPCR RT Kit 和 gDNA Remover（北京 Mei5 Biotechnology Co., Ltd，中国北京）进行逆转录，合成 cDNA。根据制造商的说明，使用 Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（北京 Mei5 Biotechnology Co., Ltd，中国北京）进行实时定量 PCR (qPCR)。qPCR 反应使用 10 μL 反应混合物，在 LightCycler 480（Roche）仪器上进行。反应程序如下：95°C 10 分钟，然后是 40 个循环，每个循环 95°C 15 秒和 60°C 1 分钟。引物序列由 Bioengineering Co., Ltd.（上海，中国）合成，并列在补充表 S1 中。基因表达水平通过 2?ΔΔC? 方法归一化到内部参考基因 β-actin，并计算 ΔCT 差值。简要来说，先确定目标基因和 β-actin 之间的阈值循环 (CT) 值差异（ΔCT），然后计算实验组和对照组之间的 ΔΔCT 差值（ΔΔCT）。每个目标基因的相对表达量表示为 2?ΔΔC?。

**Western blotting**
切割适量的 BAT 组织，加入含有蛋白酶抑制剂（Shanghai Beyotime Institute of Biotechnology，中国上海）的 RIPA 溶液。使用组织研磨机进行匀浆，然后离心收集上清液作为蛋白质裂解液。根据制造商的说明，使用 BCA Protein Assay Kit（Shanghai Beyotime Institute of Biotechnology，中国上海）测量蛋白质浓度。向样品中加入适量的加载缓冲液（Shanghai Beyotime Institute of Biotechnology，中国上海），并将混合物在 95°C 下煮沸 10 分钟。将大约 10 μg 的蛋白质加载到 10% 的 PAGE 凝胶上进行分离，然后转移到 PVDF 膜上。用缓冲液清洗膜三次后，在室温下用封闭液孵育 1 小时。随后在 4°C 下用针对目标蛋白质的一抗溶液孵育膜过夜。用缓冲液清洗膜三次后，在室温下用相应二抗溶液孵育 1 小时。孵育完成后，洗去二抗，使用 ECL 试剂（Shanghai Beyotime Institute of Biotechnology，中国上海）在化学发光成像仪中曝光并分析蛋白质条带。使用 ImageJ 软件进行图像分析。将图像转换为 8 位灰度模式，并手动减去背景。计算积分光密度 (IOD) 值。目标蛋白质的相对表达量归一化到内部对照 (Tubulin/HSP90)，相对比率表示为目标蛋白质 IOD 值/内部对照 IOD 值。

**数据分析**
使用 GraphPad Prism 10.0 分析数据。所有数据以平均值 ± 均值标准误差 (SEM) 的形式呈现。对于组间比较，首先进行单因素方差分析 (ANOVA)。如果 ANOVA 结果显著，则进行 Tukey 的 post hoc 检验以进行多组间的成对比较。p 值小于 0.05 被认为具有统计学意义。图表使用 GraphPad Prism 10.0 软件生成。

**结果**
**乳酸处理缓解小鼠肥胖**
在这项研究中，我们每天给高脂饮食诱导的肥胖小鼠喂食等摩尔剂量的乳酸和乳酸钠（图 1a），以评估乳酸及其钠盐对缓解肥胖的效果。与高脂模型组相比，乳酸处理显著降低了小鼠的肥胖程度（图 1b），iWAT 和肝脏的重量也显著减少（图 1c）。乳酸和乳酸钠组的饮食摄入量相对低于模型组（图 1d），但乳酸钠组的体重没有下降。这表明乳酸阴离子的摄入可能抑制食欲，但它不是观察到的乳酸喂食导致体重减轻的关键因素。

**乳酸处理改善小鼠的代谢和产热**
接下来，我们研究了乳酸喂食通过哪些具体机制缓解小鼠肥胖，重点关注产热和代谢。我们发现，乳酸和乳酸钠喂食都减少了小鼠在冷刺激下的体温下降（图 2a, b），并增强了肩胛区域 BAT 的产热能力（图 2c）。此外，与高脂饮食小鼠相比，乳酸处理的小鼠在白天和夜晚的氧气和二氧化碳消耗量都更高（图 2d, f, h, i），而乳酸钠处理对小鼠的呼吸代谢没有显著影响（图 2e, g, h, i）。这些结果表明，乳酸可以通过激活棕色脂肪组织来促进代谢和产热，从而缓解肥胖，而乳酸钠作为乳酸的中性盐，对脂肪减少没有显著效果。

**乳酸处理改善高脂饮食小鼠的脂肪组织代谢紊乱**
组织切片图像的分析显示，乳酸处理改善了 BAT 的白色化，并减少了高脂饮食引起的 iWAT 和 eWAT 中细胞大小的增加（图 3a）。虽然乳酸钠处理也对脂肪组织有一定影响，但其效果不如乳酸处理明显（图 3a）。测量脂肪组织中与脂质代谢相关的基因表达水平显示，乳酸处理显著上调了白色脂肪组织（iWAT 和 eWAT）中的脂肪甘油三酯脂肪酶 (Atgl) 的表达（图 3b, c），并增加了 iWAT 中过氧化物酶体增殖激活受体α (Pparα) 的表达（图 3b）。相比之下，乳酸钠处理对白色脂肪组织中的脂质代谢基因表达没有显著影响（图 3b, c）。在 BAT 中，乳酸处理显著上调了肉碱棕榈酰转移酶 1A (Cpt1A)、中链酰基辅酶 A 脱氢酶 (Mcad) 和 Atgl 的表达，而乳酸钠处理也增加了 Cpt1A 和 Mcad 的表达（图 3d）。在蛋白质水平上，与模型组相比，乳酸处理组中棕色脂肪组织中 β-氧化的关键酶 CPT1A 的表达显著增加，而乳酸钠处理组没有显著变化（图 3e, f；补充图 S1）。这些发现表明，膳食乳酸可以通过促进脂质代谢相关基因和蛋白质的表达，显著改善肥胖小鼠的脂肪组织代谢紊乱。然而，与乳酸相比，乳酸钠对脂质代谢的影响不那么显著，这与你之前提到的两种处理方法在体重和呼吸代谢水平上的差异相一致。图3显示，乳酸处理改善了高脂饮食小鼠脂肪组织的代谢失调[(b)–(d)，n = 5；(e), (f)，n = 3)。(a) 图1中小鼠的BAT、iWAT和eWAT的代表性H&E染色图像。比例尺：25 μm。(b) iWAT、(c) eWAT和(d) BAT中脂质代谢相关基因的表达。(e) BAT中CPT1A蛋白的表达。(f) Cpt1A蛋白水平的量化。数据以平均值±SEM表示。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001，与对照组相比。统计分析使用单因素ANOVA后进行Tukey的事后检验。

乳酸处理还改善了高脂饮食引起的肥胖小鼠的肝功能障碍。肝脏是体内参与脂肪代谢的关键器官之一。组织学分析（HE染色）显示，乳酸处理显著减小了肝细胞和肝脂肪细胞的体积。Oil Red O染色也显示肝脂沉积显著减少（图4a）。此外，尽管效果不如乳酸显著，乳酸钠也有一定的减少肝脂沉积的作用（图4a）。进一步的相关基因表达分析显示，乳酸处理显著降低了单核细胞趋化因子蛋白-1 (Mcp-1) 的表达，从而减轻了肥胖引起的肝炎症（图4b）。此外，参与肝脏中脂质摄取、运输和储存的基因（如分化簇36 (Cd36)和脂肪酸结合蛋白4 (Fabp4)）在乳酸处理后的表达也显著降低（图4c）。乳酸钠通过抑制过氧化物酶体增殖激活受体γ (Pparγ)来抑制肝脂生成（图4c）。因此，饮食中的乳酸可以通过抑制肝炎症和脂质储存来改善肥胖引起的肝代谢紊乱。乳酸钠还在一定程度上可以通过不同的机制减少肝脂生成。图4显示，乳酸处理改善了高脂饮食引起的肥胖小鼠的肝功能障碍[(b)，(c)，n = 5)。(a) 图1中小鼠的肝脏的代表性H&E和Oil Red O染色图像。H&E比例尺：25 μm，Oil red O比例尺：10 μm。(b) 肝脏中的炎症相关基因，(c) 脂质储存相关基因的表达。数据以平均值±SEM表示。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001，与对照组相比。统计分析使用单因素ANOVA后进行Tukey的事后检验。

乳酸处理增加了组织和器官中的乳酸水平。乳酸是体内高通量循环的代谢物之一，身体通过代谢调节来维持乳酸的稳态。我们测量了血清和组织器官中的乳酸水平，发现长期摄入乳酸和乳酸钠并没有改变血清中的乳酸水平（图5a），但显著增加了BAT、iWAT和肝脏中的乳酸含量（图5b、c和e）。长期摄入乳酸钠也增加了eWAT中的乳酸含量（图5d）。这些结果表明，通过消化和吸收，灌胃给予的乳酸和乳酸钠可以进入血液循环。图5显示，乳酸处理增加了组织和器官中的乳酸水平[(a)–(e)，n = 6；(f)–(j)，n = 5]。乳酸在(a)血清、(b) BAT、(c) iWAT、(d) eWAT和(e)肝脏中的水平。乳酸相关基因在(f) BAT、(g) iWAT、(h) eWAT和(i), (j)肝脏中的表达。数据以平均值±SEM表示。*p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001，与对照组相比。统计分析使用单因素ANOVA后进行Tukey的事后检验。

乳酸转运蛋白相关基因的表达测量显示，在BAT中，乳酸和乳酸钠处理都增加了Mct4的表达，而仅乳酸处理增加了Mct1的表达（图5f）。在iWAT中，乳酸和乳酸钠处理都增加了Mct1的表达（图5g）。在eWAT中，只有乳酸钠增加了Mct4的表达（图5h），这与脂肪组织中乳酸水平的增加相符合。在肝脏中，只有乳酸处理后Mct4的表达显著增加（图5i），而在乳酸和乳酸钠处理后肝脏中的乳酸水平都明显升高。鉴于肝脏是调节体内乳酸稳态的主要器官，我们进一步测量了与肝脏中乳酸生成和消耗相关的基因的表达。我们发现，与乳酸生成相关的乳酸脱氢酶A (Ldha)的活性在乳酸和乳酸钠处理后显著增加，而催化乳酸转化为丙酮酸的乳酸脱氢酶B (Ldhb)的活性没有显著变化（图5j）。有趣的是，抑制乳酸进入三羧酸循环 (TCA) 的丙酮酸脱氢酶激酶4 (Pdk4)的活性在乳酸处理后显著降低（图5j），这表明在外源性乳酸增加的条件下，肝脏加速了内部的乳酸代谢循环。此外，与对照组相比，乳酸处理增加了BAT和肝脏中乳酸特异性受体Gpr81的表达（图5f，i）。已知乳酸可以通过激活GPR81来减少肝炎症，从而通过增加Gpr81的表达来减轻肝炎症（图4b），从而抑制肝脂积累。上述发现表明，外源性乳酸和乳酸钠处理可以通过促进乳酸的运输和合成来增加组织中的乳酸水平，并且还可以通过激活下游信号通路来影响组织代谢。乳酸处理激活GPR81以促进产热。

先前的研究表明，饮食中的乳酸可以增强肥胖小鼠的产热能力和代谢能力。因此，我们评估了脂肪组织中与产热相关的基因的表达，发现乳酸处理显著增加了BAT中Ucp1、增殖激活受体γ共激活剂1β (Pgc1β)、细胞死亡诱导DNA片段化因子α样效应物A (Cidea)和肌酸激酶B (Ckb)基因的表达。乳酸钠处理也显著增加了BAT中Ucp1的表达（图6a）。在iWAT中，乳酸处理显著增加了Ucp1和Ckb的表达，而乳酸钠处理显著降低了Ucp1和Cidea的表达（图6b）。在eWAT中，乳酸处理增加了Ckb的表达，但对Ucp1的表达没有显著影响（图6c）。这些发现表明，乳酸可以在不同的脂肪组织中促进产热，但机制可能不同。图6显示，乳酸处理激活GPR81以促进产热[(a)–(c)，n = 5；(d)–(g)，n = 3]。脂肪组织中与产热相关基因的表达。(d) BAT中UCP1的蛋白质表达，(f) GPR81的蛋白质表达，以及(e) UCP1和(g) GPR81蛋白水平的量化。数据以平均值±SEM表示。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，**** p < 0.0001，与对照组相比。统计分析使用单因素ANOVA后进行Tukey的事后检验。

为了探索乳酸是否通过激活GPR81来增加UCP1的表达，我们测量了BAT中GPR81和UCP1的蛋白质水平，这两种基因在乳酸处理后都显著上调。与对照组相比，BAT中的GPR81和UCP1的蛋白质水平显著增加（图6d–g；补充图S2，S3）。这些结果表明，乳酸处理通过涉及UCP1和CKB的两个平行途径促进脂肪组织的褐色化。此外，在主要的产热器官BAT中，与先前的研究一致，乳酸处理可以通过激活GPR81来促进UCP1的表达。相比之下，乳酸钠处理对这一产热途径没有显著影响。

首先，我们的研究表明，外源性乳酸干预不仅可以减轻小鼠的体重，还可以显著改善它们的葡萄糖代谢并增强胰岛素敏感性。这种效果可能与乳酸增加体内乳酸水平以及激活乳酸转运蛋白Mct1和Mct4和乳酸受体GPR81的表达有关。通过这些途径，乳酸促进了脂肪组织中的能量消耗和产热，从而减轻了肥胖及相关代谢异常。这一机制与先前关于乳酸参与代谢调节的研究一致，证实乳酸不仅作为能量底物，还通过其信号功能影响脂肪代谢和能量平衡。在这项研究中，首次系统地比较了弱酸形式的乳酸与其盐形式的抗肥胖效果，包括了等摩尔浓度的乳酸钠作为对照。这种实验设计与大多数使用乳酸盐的先前研究不同，有助于阐明乳酸分子本身的独特作用，而不仅仅是乳酸阴离子在代谢调节中的作用。在之前的研究中，乳酸通常以盐的形式（如乳酸钠、乳酸钙）使用，以中和其酸性，使其更易于和安全给药。然而，大多数研究没有控制注射溶液的渗透压和钠离子的共注射效应。先前的研究表明，注射高渗氯化钠溶液（2 g/kg NaCl）可以模拟乳酸钠的外源性效应，包括抑制食欲和产热效应，但两者都会导致高钠负荷症状，如活动减少和水分摄入增加[23]。这些共注射离子可能会超出乳酸本身的药理作用范围。这些发现强调了在实验设计中控制渗透负荷和共注射离子的重要性。在这项研究中，我们选择了1 × 10?3 mol/kg的乳酸及其钠盐（乳酸：90 mg/kg，乳酸钠：112 mg/kg）。考虑到小鼠的灌胃体积为10 mL/kg，乳酸溶液的浓度为0.75%（v/v），pH值约为2.5，与 Sprite等碳酸饮料相似；而乳酸钠溶液的浓度为11.2 mg/mL，pH值约为8.4，类似于苏打水。此外，乳酸溶液的渗透压约为165 mosm/L，乳酸钠溶液的渗透压约为190 mosm/L，都低于生理渗透压（0.9% NaCl：308 mosm/L），相差不到15%。这些剂量远低于先前研究中通常使用的剂量（200–2,000 mg/kg），允许安全地比较乳酸与其盐的效果。这种设计更接近于饮食中乳酸和乳酸盐的共同存在，并提供了关于乳酸弱酸形式的生理相关性的重要见解。我们发现，乳酸和乳酸钠在抗肥胖效果方面存在显著差异。尽管两者在等摩尔浓度下都增加了某些组织中的乳酸积累并减少了食物摄入，但只有乳酸本身在体重减轻、增强产热和代谢改善方面表现出显著效果。这一结果表明，乳酸的生理活性不仅取决于乳酸离子（lactate?），还取决于它携带的质子（H+）。从生物学角度来看，在从食道到胃再到肠道的口服灌胃过程中，乳酸（pKa 3.86）主要以其未 dissociated 形式存在于胃的高酸性环境（pH 1.5–3.5）中。这使乳酸具有类似于亲脂分子的特性，能够通过胃黏膜上皮细胞快速吸收。相比之下，乳酸钠在胃中完全 dissociated 为乳酸阴离子和钠离子，其吸收主要依赖于小肠中的单羧酸转运蛋白 (MCTs) 驱动的主动运输[24]，导致生物利用度显著降低。质子本身的代谢信号效应也可能是一个促成因素，因为细胞内pH值的变化会直接影响线粒体电子传递链的活性，激活AMP-激活的蛋白激酶（AMPK）能量感应通路，并调节离子通道的功能。虽然乳酸钠在减肥方面的效果有限，但它对产热标志物和基因表达有显著影响。这些发现表明，乳酸阴离子作为信号分子和底物时仍保留某些代谢调节特性；然而，质子的存在进一步增强了这一效应，提供了关键的辅助作用。这一假设为功能性乳酸基食品的未来发展提供了重要方向：乳酸的酸性形式可能比其中性盐形式具有更优的生物活性。乳酸不仅是体内重要的代谢中间体，还是日常饮食中广泛存在的一种天然功能性成分。作为发酵的关键代谢产物，乳酸在酸奶、泡菜、发酵肉制品和葡萄酒等传统发酵食品中含量丰富。例如，酸奶中的乳酸含量通常在0.7%–1.1%（w/w）之间，而泡菜等发酵蔬菜中的乳酸含量则在0.6%–2.3%（w/w）之间[25]。在发酵肉制品中，乳酸含量一般在0.5%–1.0%（w/w）之间。在葡萄酒发酵过程中，由苹果酸-乳酸发酵产生的乳酸含量通常在1–5 g/L之间[26]。这些日常饮食中的乳酸摄入是人体外源性乳酸的重要来源。一项涉及8000多人的队列研究表明，每周食用酸奶超过7次的人比很少或不吃酸奶的人超重/肥胖的发生率显著降低。流行病学研究也表明，增加酸奶的消费（每周≥4份）与中年和老年人代谢综合征的发生率降低密切相关。传统观点将这些健康益处主要归因于益生菌、钙或蛋白质含量。然而，这项研究表明，乳酸本身作为发酵乳制品的特征成分，可能通过促进脂肪组织产热等机制独立发挥代谢调节作用。根据本研究使用的有效剂量（90 mg/kg，相当于每60公斤成人体重每天约5.4克乳酸）[27]，每天摄入大约550克酸奶（含有4–6克乳酸）可以提供类似的乳酸暴露水平。这与中国居民《2022年膳食指南》推荐的每日300–500毫升乳制品摄入量相符。商业酸奶通常以150–250克包装销售，这意味着每天食用2–3份酸奶可以达到有效剂量，在典型饮食习惯下是可行的。然而，许多市售的调味酸奶含有大量添加糖分，长期过量摄入可能会增加热量负担。因此，建议选择低糖或无糖选项以避免抵消潜在的减肥效果。其他传统发酵食品也可以提供相当数量的乳酸摄入。例如，每天食用50克泡菜可提供约0.35–1.15克乳酸，100克发酵肉制品可提供约0.5–1克乳酸，适量饮用葡萄酒（约100毫升）可提供0.1–0.5克乳酸。这些发酵食品通常作为多样化饮食的一部分被食用，从而在不依赖单一食物来源长期高摄入的情况下实现有效的乳酸暴露。此外，虽然工业添加的乳酸盐可以提供乳酸离子，但它们可能缺乏与质子相关的信号效应。因此，选择使用传统发酵方法生产的天然酸性发酵食品可能比单纯补充乳酸盐具有更显著的代谢健康效果。需要注意的是，灌胃给药的代谢过程与日常饮食摄入不同。此外，上述基于体表面积标准化的剂量转换仅是理论估计，实际的有效剂量仍需通过临床研究来验证。本研究发现在棕色脂肪组织（BAT）中乳酸处理显著上调了Mct1和Mct4的表达，在白色脂肪组织中上调了Mct1，在肝脏中上调了Mct4的表达。这种组织特异性的转运蛋白调节形成了乳酸诱导的代谢变化的分子基础。MCT1和MCT4作为双向质子偶联转运蛋白，其上调不仅促进了外源性乳酸的摄取，还加速了细胞内乳酸的转运和利用[28]。先前的研究表明，广谱MCT抑制剂α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHC）可以有效阻断大约90%的脂肪细胞乳酸摄取[29]，而BAT中MCT1的缺失会抑制小鼠体温升高和葡萄糖摄取[30]。进一步的研究发现，CHC和选择性MCT1/MCT2抑制剂AR-C155858都可以抑制分化脂肪细胞中的乳酸流动，从而抑制糖酵解和氧化代谢，影响脂肪组织的产热能力和褐色化[17]。因此，脂肪组织中Mct1和Mct4的协调上调可能促进了乳酸的摄取和氧化循环，使乳酸替代葡萄糖成为TCA循环中的主要能量底物，从而支持产热并促进相关基因和蛋白质的表达[31]。值得注意的是，肝脏中Mct4的选择性上调伴随着Pdk4活性的降低，表明升高的乳酸水平可能抑制丙酮酸脱氢酶复合物的磷酸化，从而使过量乳酸进入TCA循环作为碳源，并减少肝脏糖异生[32]。抑制PDK4可以增强肝脏中的胰岛素信号传导并激活脂质调节通路，促进葡萄糖和脂质代谢[33]。此外，虽然乳酸钠可以在某些组织中诱导Mct表达，但其下游效应不如乳酸明显，进一步支持了依赖于质子的调节机制的存在。本研究证明了GPR81（HCAR1）作为乳酸特异性受体在介导产热效应中的关键作用。乳酸处理显著上调了棕色脂肪组织（BAT）和肝脏中GPR81的表达，并进一步证实了BAT中GPR81和UCP1的蛋白质水平升高。GPR81作为一种Gi蛋白偶联受体，在激活后抑制腺苷酸环化酶产生cAMP，从而减少蛋白激酶A（PKA）的激活[34]。这似乎与传统的非颤抖产热过程相矛盾，在传统过程中，β-肾上腺素能受体激活Gs蛋白促进cAMP产生和PKA激活。然而，最近的研究表明，在GPR81缺陷小鼠中，β3-肾上腺素能刺激无法诱导白色脂肪组织的褐色化，其肩胛间表面温度显著下降[13]。GPR81敲除小鼠中乳酸诱导的WAT褐色化及相关产热效应完全消失。机制研究进一步揭示了乳酸通过GPR81-Gi-Gβγ-RhoA/ROCK1-p38信号级联促进UCP1表达[12]。此外，本研究中乳酸上调的Pgc1β和Cidea也支持慢性乳酸调节线粒体生物标志物以促进适应性产热的假设[35]。乳酸对肝脏的保护作用与肝脏中Gpr81的上调和乳酸水平的升高密切相关。组织学上，乳酸显著减少了脂质沉积和肝细胞气球样变。在分子水平上，它抑制了Cd36介导的脂肪酸摄取，降低了Fabp4的脂质转运功能，并下调了Mcp-1驱动的炎症反应。先前的研究表明，乳酸处理通过GPR81依赖机制减轻了免疫性肝炎小鼠的炎症和器官损伤[36]。在本研究中，Mcp-1的减少表明乳酸可能通过抑制巨噬细胞浸润来改善肝脏免疫微环境，从而调节肝脏脂质代谢异常。未来的研究可以进一步探讨以下几个方面：首先，虽然口服灌胃可以精确控制剂量，但它不能完全模拟自然饮食中的乳酸摄入过程。未来的研究可以探讨在食品或饮用水中添加乳酸的长期喂养试验，以模拟更自然的摄入方式。其次，本研究主要使用的是长期口服乳酸和乳酸钠。需要评估长期摄入的安全性、对肠道微生物群的影响以及潜在的耐受性。已知小鼠急性口服乳酸的半数致死剂量（LD50）约为4–5 g/kg，而本研究使用的剂量（100 mg/kg）远低于此水平。此外，在肝脏、肾脏和结肠的组织切片中未观察到病理差异。美国食品药品监督管理局（FDA）将乳酸列为公认安全（GRAS）物质，允许其在食品中使用，但在不同食品中的使用量有一定的限制。此外，美国农业部食品安全检验局（USDA-FSIS）允许加工肉制品中的乳酸钠含量最高为4.8%（USDA-FSIS，2000）[37]。然而，这些物质的具体安全摄入量仍需要慢性毒性数据。第三，本研究仅调查了采集时血清和组织样本中的乳酸水平。未来需要明确乳酸的组织药代动力学，如不同时间点的分布、循环乳酸以及细胞内乳酸平衡的动态变化。最后，未来的研究可以使用特定的MCT或GPR81抑制剂和激活剂来进一步验证这些机制。在细胞和小鼠中敲除或过表达相应基因将是验证乳酸效应具体靶点的重要方法。