一种坚韧且具有层级结构的丝质水凝胶，可用于制造人工肌腱

《Biomaterials》：Tough and Hierarchically-Structured Silk Hydrogel for Artificial Tendons

　　

周思成|聂克鑫|吴博轩|秦成聪|田静怡|李乐乐|范张|尹子衿|欧阳宏伟|陈晓|沈伟良|黄文雯

浙江大学医学院附属第二医院骨科及梁祝实验室，杭州310058，中国

摘要

肌腱损伤在运动人群和普通人群中都非常普遍，导致严重的疼痛、生产力下降和残疾。然而，断裂肌腱的外科重建仍然是一个临床挑战，需要坚韧且具有再生能力的人工肌腱来促进功能恢复。在这里，我们受到天然肌腱结构的启发，提出了一种简便的方法，结合定向冷冻和热拉伸技术，制备出一种名为DFHS水凝胶的坚韧且具有层次结构的人工肌腱材料。当水的含量达到约70%时，DFHS水凝胶的极限抗拉强度为13.9 MPa，与人类前交叉韧带相当；其断裂韧性达到45.5 kJ m^-2，是天然橡胶的5倍。此外，其高结晶度和排列有序的多层结构延长了降解时间，从而在体外和体内环境中都能提高长期完整性和机械稳定性。DFHS水凝胶表现出多层次各向异性，具有微米级的蜂窝状孔壁，并含有纳米级的β-折叠片。这些仿生拓扑结构能够显著引导细胞排列，促进新生肌腱的生长，上调与细胞外基质相关的基因通路，促进成熟肌腱的形成，从而加速肌腱愈合。这一策略可应用于其他半结晶聚合物，为开发具有临床应用价值的坚韧水凝胶提供了基于水的制备方法。

引言

肌腱是高度有序的结缔组织，其结构在多个尺度上均保持排列。特别是肌腱中的胶原蛋白，从胶原分子（直径1.5纳米）开始，依次组装成纤维（直径10-350纳米）、纤维束（直径1-20微米）和肌腱束（直径50-500微米）[1]，[2]。胶原纤维与柔软的非胶原基质结合，形成了坚韧的肌腱组织，使它们能够有效地分散能量并将肌肉力量传递给骨骼[3]。这些重要结缔组织的损伤可能导致严重的健康问题，引发剧烈疼痛和残疾。

尽管肌腱组织具有较高的强度和韧性，但肌腱损伤十分常见，占普通门诊中肌肉骨骼损伤咨询的大约30%[4]，[5]。目前，生物移植、假体和组织工程是修复和增强肌腱及韧带损伤的主要方法。自体或异体移植是肌腱修复的黄金标准临床材料，但它们仍存在一些缺点，如供体部位的并发症[6]，[7]和免疫排斥反应[8]。不可降解的合成假体（如PET基植入物）虽然初期能提供可靠的机械支撑，但存在传播疾病的风险[9]，[10]。尽管这些PET假体在短期内能快速实现坚强的康复效果，但由于机械性能的流失[11]，[12]以及组织亲和力低[13]，[14]，长期效果不佳。可生物降解的支架材料（如胶原蛋白[15]或PLLA[16]支架）被认为是很有前景的临床选择，因为它们能提供临时机械支撑，并逐渐将负荷转移给再生组织以实现功能恢复。然而，提高胶原支架的机械性能并避免PLLA降解过程中的炎症副产物仍是一个挑战[17]，[18]。最近的进展集中在开发兼具生物相容性、机械强度和可调节降解性的混合支架上[2]，[20]。因此，迫切需要开发出具有理想生物力学和生物学特性的可规模化“现成”可降解移植材料，以促进受损肌腱和韧带的修复。

家蚕丝（Bombyx mori）产生的天然聚合物在组织工程中具有显著优势，包括优异的生物相容性、可调的生物降解性、低免疫原性和高加工性[21]，[22]。特别是脱胶后的天然丝纤维保留了原始茧丝的层次结构和各向异性，使其具有出色的机械性能（硬度：5–12 GPa；强度：约500 MPa）[21]，并且已在多项体内研究中证明是肌腱和韧带修复的有效支架[23]，[24]，[25]，[26]，[27]，[28]。从蚕丝中提取的再生丝蛋白（RSF）具有优异的溶解性和加工性，可以灵活设计复杂结构，使其成为模拟肌腱和韧带架构的理想材料[29]，[30]，[31]。然而，由于提取和凝胶化过程中分子有序性的丧失以及高含水量[21]，[32]，[33]，[34]，[35]，RSF水凝胶的机械性能（硬度：3–250 kPa；强度：56–1048 kPa）通常明显低于天然丝纤维。这种机械性能的差异限制了RSF水凝胶单独用于肌腱修复的应用。因此，在RSF材料中重建肌腱/韧带的多层次有序结构是一个关键挑战，同时也是开发坚固、可承重的肌腱和韧带再生支架的一个有前景的方向。

通过引入各向异性结构（如复合、冷冻铸造、盐析、机械训练和限域干燥[31]，[36]，[37]，[38]，[39]，[40]，[41]），水凝胶的强度和韧性得到了显著提升。例如，使用定向冷冻和盐析技术制备出了具有多尺度各向异性结构的超强坚韧聚乙烯醇水凝胶[36]。通过持续的机械训练，制备出了具有完美排列纤维结构的各向异性聚合物水凝胶[39]。尽管机械性能有了显著提高，但要开发出高性能水凝胶仍然面临挑战，因为这可能需要使用生物不相容的盐或耗时的循环训练，而这些方法不利于大规模工业生产。最近的研究表明，丝蛋白作为一种半结晶材料具有热塑性[42]。当温度高于水塑化玻璃转变温度（T’_g）时，非晶态基质中的氢键会发生重组[43]，[44]，从而促进丝蛋白基质中β-折叠片纳米晶体的分子位移和重新定向[45]。通过在T’_g以上温度对丝蛋白进行热重塑，可以显著增强其机械性能[42]，[46]。受上述加工方法的启发，结合生物相容性和分子工程方法，可以协同构建多尺度各向异性结构，为制备类似天然组织的坚韧再生水凝胶提供新的途径。

本文借鉴了天然肌腱的层次结构以及丝蛋白热塑性加工的最新进展，提出了一种集成的、生物相容的物理加工方法，用于制备坚韧且具有层次各向异性的丝蛋白水凝胶（DFHS水凝胶）作为人工肌腱材料。通过结合定向冷冻（实现微米级排列）和T’_g以上的热拉伸（促进分子重组），我们旨在协同构建多尺度各向异性结构，从而提高机械性能。这种方法利用丝蛋白的热塑性来增强机械性能，同时保持生物相容性，从而克服现有坚韧水凝胶制造技术的局限性。通过这一策略，我们希望能够弥合肌腱组织的结构和机械需求与现有水凝胶支架的差距，增进对仿生材料中结构-功能关系的理解，并激发新的机械性能强大的水凝胶制造方法，以实现临床应用。

节片段

材料合成与加工

再生丝蛋白溶液的制备：按照先前发表的程序制备了再生丝蛋白溶液[47]。将家蚕丝切成小块，置于0.05 M Na₂CO₃水溶液中煮沸30分钟。脱胶后的丝纤维用蒸馏水冲洗后，在通风橱中过夜干燥。干燥后的丝纤维溶于9.3 M LiBr水溶液中，在60 °C下孵育4小时。然后通过透析去除丝蛋白中的LiBr。

坚韧丝蛋白水凝胶的设计与结构演变

通过定向冷冻和热拉伸的协同作用制备了具有层次结构的丝蛋白水凝胶（图1a）。定向冷冻使丝蛋白分子在微米尺度上排列整齐。具体方法如下：首先对家蚕丝进行脱胶，将其溶解在LiBr水溶液中，然后通过透析去除水分，所得即为再生丝蛋白（RSF）。

结论

我们开发了一种定向冷冻辅助热拉伸（DFHS）策略，用于制备坚韧且具有层次结构的丝蛋白水凝胶作为人工肌腱材料。在DFHS策略的结构演变过程中，定向冷冻确保了微米级排列的层状结构的形成，而热拉伸进一步赋予了这些层状结构高度定向的β-折叠片纳米晶体。通过优化关键工艺参数，制备出了具有优异机械性能的丝蛋白水凝胶。

CRediT作者贡献声明

范张：可视化、数据验证、数据管理。尹子衿：指导、资源协调、概念构思。欧阳宏伟：指导、资源协调。陈晓：指导、资源协调。沈伟良：指导、资源协调、概念构思。黄文雯：写作与编辑、初稿撰写、指导、资源协调、项目管理、资金获取、概念构思。周思成：写作与编辑、初稿撰写、方法设计、数据分析

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

利益冲突声明

? 作者声明以下可能构成利益冲突的财务利益和个人关系：黄文雯表示得到了浙江省自然科学基金华东医学联合基金的财务支持；沈伟良表示得到了浙江省凌岩项目的财务支持。

致谢

作者感谢浙江省重点研发计划（2024SSYS0028）、浙江省自然科学基金的华东医学联合基金（LHDMZ22H300004）、国家自然科学基金（52003233、82372376）以及浙江省凌岩项目（2024C03207）的财务支持。