具有抗氧化应激、抗炎和抗钙化功能的硫化铜纳米酶，用于血管再生

《Biomaterials Advances》：Copper sulfide nanozyme with antioxidative stress, anti-inflammation, and anti-calcification for vascular regeneration

　　``

梁福邦|王丽娟|金大伟|孙宇|袁江|潘彦军|尹萌

上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心心胸外科，中国上海市东方路1678号，200127

摘要

小直径血管移植物不可避免地会受到氧化应激和炎症反应的影响，这些因素会延缓移植物内皮的生成，最终导致内膜增生和血管钙化。在这项研究中，我们开发出了具有过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性的硫化铜（CuS）纳米酶，这类纳米酶能够同时产生一氧化氮（NO）和硫化氢（H₂S）。将CuS纳米酶与聚合物混合后通过电纺技术制备出血管移植物。这些移植物能够降低活性氧的水平，抑制炎症反应，增强内皮细胞功能，同时抑制平滑肌细胞的过度增殖。此外，这些移植物具有优异的生物相容性、机械性能和抗钙化能力。移植后一个月内，它们保持了通畅性，并通过上调磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-AKT）信号通路和下调肿瘤坏死因子（TNF）通路，表现出良好的内皮生成和抗钙化特性。

引言

心血管疾病是全球主要的死亡原因，2019年导致1790万人死亡，其中冠心病最为常见[1]。冠状动脉旁路移植（CABG）是治疗严重冠状动脉疾病的优选方法。自体血管，包括大隐静脉（GSV）、乳内动脉（IMA）和桡动脉，是CABG中理想的移植物来源[2]。由于自体血管疾病或手术切除等原因，大约三分之一的患者缺乏合适的自体血管[3]。人工血管移植物在大型血管移植中取得了良好的效果。然而，小直径血管移植物（SDVGs）面临着较高的血流阻力、缓慢的血流速度、强烈的氧化应激和慢性炎症等挑战。这些因素会延缓血管内皮的再生，导致血管平滑肌细胞（VSMCs）过度增殖，从而引起小直径人工血管移植物的长期阻塞[4],[5],[6]。

近年来，一氧化氮（NO）和硫化氢（H₂S）在血管重建中的协同作用受到了越来越多的关注[7],[8],[9],[10],[11],[12]。NO和H₂S能够协同促进血管再生，调节炎症，并防止狭窄。H₂S和NO在体内可以相互增强各自的生物合成。已知H₂S可以增强NO松弛平滑肌的能力[13]。此外，H₂S还能促进内皮细胞中的一氧化氮合酶（eNOS）的表达，从而增加NO的产生和释放[14],[15],[16]。NO可以通过提高血管平滑肌细胞（VSMCs）中半胱氨酸β-合成酶（CBS）和半胱氨酸γ-裂解酶（CSE）的表达来上调内源性H₂S的水平[17]。

除了炎症反应外，血管移植过程中的血流阻塞和再灌注还会产生大量的活性氧（ROS），损害内皮细胞功能，导致血栓形成和动脉粥样硬化[18]。天然的抗氧化酶，如过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD），有助于体内的ROS清除[19]。CAT是一种高效的自然催化剂，可将过氧化氢（H₂O₂）分解为氧气，安全有效地减轻ROS积累和组织缺氧。它具有高特异性、温和的反应条件和高活性[20],[21]。然而，其高昂的生产和储存成本、较低的稳定性和潜在的免疫原性限制了其临床应用。具有内在CAT活性的纳米酶（称为CAT模拟酶）具有高稳定性和低成本，可以通过改变其大小和形态来调节酶活性[21]。

已经报道了多种具有CAT活性的纳米酶，包括金属[22]、金属氧化物[23]和金属有机框架纳米材料。铜是人体中一种必需的微量元素，在酪氨酸酶和铜锌超氧化物歧化酶等酶中起着重要作用。因此，基于铜的纳米材料可用于清除ROS[24],[25]。邓等人开发了基于铜的Cu_5.4O纳米颗粒，这些颗粒具有CAT活性，在急性肾损伤、急性肝损伤和伤口愈合过程中能够显著降低ROS水平[26]。周等人设计并应用了一种具有CAT活性的Cu-MOF纳米酶，显著降低了滑膜巨噬细胞内的ROS水平，并改善了缺氧微环境[27]。

在这项研究中，我们制备了具有CAT和GPx活性的硫化铜（CuS）纳米酶。CAT活性可以减少移植后血管组织因ROS引起的损伤，而GPx活性则能在植入后持续稳定地产生内源性NO。与释放供体相比，这种催化产生NO的方法更为优越，因为供体的释放量有限且释放时间较短。此外，CuS纳米酶在谷胱甘肽（GSH）存在下还有释放H₂S的能力。随后，这些纳米酶与聚（L-乳酸-共-己内酯）（PLCL）一起通过电纺技术制备出内径为2毫米的血管移植物。NO和H₂S的作用在于减轻炎症和血栓形成，抑制VSMC的增殖，促进内皮细胞的增殖和迁移，从而实现理想的血管再生（示意图1）。

章节片段

CuS纳米酶的合成与表征

通过SEM（图1a）对合成的CuS纳米酶的形态进行了表征，显示出均匀的大小、形状和良好的分散性。TEM（图1b）显示该纳米酶呈六边形，平均直径为615.0±15.3纳米（图1c）。XRD分析结果如图1d所示，观察到硫化铜在2θ值为28、30、32、33、43、53和59°处的衍射峰，这些峰与铜的（101）、（102）、（103）、（006）、（110）、（108）和（116）晶面相匹配

讨论

由氧化应激、内皮功能受损和慢性炎症引起的血栓形成、内膜增生和钙化，对SDVGs的临床应用构成了重大挑战。例如，在我们之前的猪体内研究中，使用临床广泛用于大型血管重建的市售扩张型聚四氟乙烯（ePTFE）移植物，所有3.5毫米的ePTFE移植物在植入后12周内均发生了阻塞

结论

在本研究中，首次合成了具有CAT和GPx活性的CuS纳米酶，然后通过共电纺技术制备了血管移植物。这些移植物由于同时释放NO和H₂S，能够有效减少氧化应激。这种复合移植物可以促进快速的内皮生成，抑制内膜增生，并降低炎症反应。移植物具有优异的生物相容性、机械性能和抗钙化能力。体内实验表明

梁福邦：撰写——原始草案、方法学研究。王丽娟：软件处理、方法学研究、数据验证。金大伟：数据可视化、结果验证。孙宇：结果验证、软件使用、资源协调、方法学研究。袁江：撰写——审稿与编辑、项目监督、资金获取。潘彦军：项目监督、资源协调。尹萌：撰写——审稿与编辑、项目监督、资金获取。

利益冲突声明

作者声明没有任何已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究工作。

致谢

本研究得到了上海科学技术委员会医学创新研究专项（23Y11907200）、上海市卫生健康委员会卓越项目（20234Z0003）、江苏省生物医学功能材料协同创新中心以及江苏省高等教育机构（19KJA310001和PAPD）的支持。示意图1使用BioRender.com制作。

``