地塞米松在转录水平上影响胎鼠视交叉上核生物钟

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Dexamethasone affects the circadian clock in the fetal mouse suprachiasmatic nucleus at the transcriptional level

　　

摘要 地塞米松（DEX）在临床实践中被用于治疗有早产风险的病例，是一种挽救生命的疗法；然而，这种治疗也是一种强大的信号，可以重新编程胎儿生理机能，包括生物钟系统。DEX对胎儿视交叉上核（SCN）生物钟的影响已被证实，但其潜在机制尚不明确。本研究的目的是深入了解DEX在mPer2Luc胎鼠SCN中诱导的转录效应。研究人员使用三标免疫荧光定位胎儿SCN中的糖皮质激素受体（GR），培养体外胎儿SCN外植体以监测PER2驱动的生物发光（PER2::LUC）节律，并使用RNA测序（RNA-seq）和RT qPCR分析来识别DEX和溶剂（VEH）处理后的差异表达基因。研究表明，GR在胎儿SCN的所有细胞（神经元和胶质细胞核以及胶质细胞突起）中均有均匀表达。对胎儿SCN外植体中PER2::LUC的监测证实，大多数细胞对DEX的反应是节律的振幅和中值增加。RNA-seq和RT-qPCR数据显示，DEX增加了GR敏感的生物钟基因Per1的表达，并改变了其他可能影响生物钟的基因（例如Hif3a、Klf9、Zbtb16、Mt1-3）的表达。当处理时间与SCN生物钟对DEX敏感性最高的时间窗口相匹配时，这些效应更为显著。本研究结果推动了尚待探索的时间发生学领域，并明确了DEX对胎儿大脑转录景观的影响，特别是对生物钟的具体意义。

1. 研究背景、问题与目的

在妊娠期间，母体向发育中的胎儿提供各种信号以支持其营养和发育。其中大部分信号受内源性生物钟调控，具有时间节律性，以适应母体行为和代谢状态在24小时内的变化。在哺乳动物中，此系统由下丘脑视交叉上核（SCN）内的生物钟进行中枢调控。生物钟的核心机制基于包括Per1/Per2、Cry1/Cry2、Clock/Npas2、Bmal1/Bmal2和Nr1d1/Nr1d2（又称Rev-erbα/β）在内的多个生物钟基因及其蛋白质产物构成的转录/翻译反馈环路。然而，在大鼠和小鼠SCN的早期胎儿阶段，这些节律尚无法检测到，其发育是渐进的。此前研究发现，在经典生物钟基因尚无节律性表达的胎儿发育阶段，胎儿大鼠SCN中已有约1500个基因呈现节律性表达，这些基因与神经元发育和细胞间通讯相关。这表明胎儿SCN的发育可能受到来自母体的节律性信号调控，而母体生物钟系统的紊乱已被证明与后代健康不良相关，因此探究这些信号的来源至关重要。

在众多可能的信号中，糖皮质激素（GCs）作为一种由母体SCN控制分泌、本身具有显著昼夜节律的激素，被认为是向胎儿SCN传递节律信号的可能媒介。GCs通过与细胞内的糖皮质激素受体（GR）结合，调控包括生物钟基因Per1在内的众多基因的转录，从而在多数外周组织中影响和同步昼夜节律。然而，在成年动物中，SCN对GCs具有抵抗性。与之形成鲜明对比的是，合成类似物地塞米松（DEX）已被证明可以在体外实验中同步胎儿SCN的节律。尽管DEX对胎儿SCN生物钟的影响已被证实，但其潜在的作用机制，特别是在转录水平上的具体效应，仍未得到阐明。为了规避体内注射或操作引起的内源性GC水平升高等混杂效应，本研究采用mPer2^Luc小鼠的胎儿SCN器官型外植体作为模型，直接应用低浓度DEX，旨在通过RNA测序等技术，探究DEX影响胎儿SCN生物钟的分子机制，特别是其对胎儿SCN转录组的全局性影响，从而填补该领域的知识空白。本研究发表在《Biomedicine》期刊上。

2. 主要技术方法

研究人员主要应用了以下关键技术：

1. 1.
   免疫荧光定位：对孕17-17.5天（E17-17.5）胎鼠脑切片进行三标免疫荧光染色，结合共聚焦显微镜成像，确定GR蛋白在胎儿SCN神经元和未成熟胶质细胞中的表达与分布。
2. 2.
   体外生物发光节律监测：制备E17胎鼠SCN外植体，利用携带PER2::LUC报告基因的小鼠模型，在Luminoview LV200显微镜下长时间连续记录PER2驱动的生物发光信号，以近乎单细胞的分辨率分析DEX对胎儿SCN生物钟节律参数（如周期、振幅、中值和节律性）及相位的影响。
3. 3.
   转录组学与基因表达分析：在确定的DEX敏感时间窗处理SCN外植体，并在处理后不同时间点收集样本。通过RNA测序（RNA-seq）进行全转录组分析，并使用DESeq2等工具鉴定差异表达基因。同时，在独立的外植体样本集中，通过RT qPCR对RNA-seq鉴定的关键差异表达基因（如Per1、Hif3a、Klf9等）的表达变化进行验证，并考察处理时间点（PER2::LUC信号的上升期与下降期）对基因表达影响的差异。

3. 研究结果

3.1. GRs在胎儿SCN的神经元和胶质细胞中均有定位

通过免疫荧光分析发现，在孕17天胎鼠的SCN中，GR免疫阳性细胞均匀分布在整个SCN区域，无空间选择性。GR存在于神经元和未成熟胶质细胞中。在神经元中共定位于细胞核，在胶质细胞中不仅存在于细胞核，也存在于部分突起中。这表明胎儿SCN中大多数细胞类型都有可能对GCs产生应答。

3.2. DEX影响外植胎儿SCN中PER2::LUC的昼夜节律

利用PER2::LUC成像分析发现，与VEH处理相比，DEX处理能引起PER2::LUC节律的相位偏移，且在PER2::LUC信号下降期或谷期处理时偏移更为明显。对数百个细胞大小区域的节律参数分析表明，DEX对节律周期和节律性无显著影响，但显著增加了节律的振幅和中值。这证实了GR的瞬时激活在细胞水平上影响了外植胎儿SCN的PER2::LUC节律。

3.3. DEX在胎儿SCN中的全基因组效应及特异性生物钟相关效应

通过RNA-seq分析DEX处理对胎儿SCN转录组的影响。主成分分析和层次聚类显示，DEX处理1小时后，处理组与对照组的样本分离最明显，表明大部分受影响的基因在DEX处理后1小时内表达即发生变化。对已知GC靶基因的分析证实，DEX显著上调了Fkbp5和Per1。在经典生物钟基因中，DEX主要影响了GR敏感的Per1，以及代谢敏感的Ppargc1a、Rora和Rorb，对其他核心生物钟基因无显著影响。此外，研究发现多个与生物钟相关或SCN富集的基因表达也发生改变，例如Gpr176、Adcy2、Skp1等基因上调，而精氨酸加压素基因Avp和Trp53i11则在不同时间点均被显著下调。

进一步分析所有差异表达基因发现，DEX处理后共有24个基因显著下调，9个基因显著上调。下调基因显著富集于发育过程、细胞外区域、细胞外基质组织等通路。上调基因中包括转录因子Hif3a、Klf9、Zbtb16，以及三个金属硫蛋白基因Mt1-3。值得注意的是，在DEX处理后1小时，差异表达基因数量最多（101个上调，58个下调），这些基因涉及氨基酸转运、氨酰基-tRNA合成、电子传递链等过程，表明DEX引发了快速而广泛的转录应答。

3.4. DEX以节律依赖性方式影响胎儿SCN的基因表达

为验证RNA-seq结果并探究处理时相的影响，研究人员在独立的SCN外植体样本中，分别在PER2::LUC信号的上升期和下降期施加DEX或VEH处理，并通过RT qPCR检测关键基因的表达。结果证实了Per1的上调，并发现Per2在PER2::LUC下降期处理后特异性上调。Hif3a、Klf9、Fkbp5等基因的表达也发生显著变化。总体而言，DEX对基因表达的影响在PER2::LUC下降期处理时更为显著，特别是对Per2、Slc7a5、Gpr176和Nr3c1等基因的影响，这些差异在处理后24小时仍可检测到，表明DEX对SCN外植体具有持久效应。

4. 讨论与结论

讨论部分总结：研究人员探讨了DEX影响胎儿SCN生物钟的潜在机制。与成年SCN对DEX无反应不同，胎儿SCN由于广泛表达的GR而对其敏感。机制可能包括：1）直接基因组机制：DEX通过GR直接作用于生物钟基因Per1（其启动子含有糖皮质激素反应元件GRE），并可能通过GE2区域影响Per2。2）间接转录调控：DEX强烈且持久地上调Klf9表达，该转录因子已知能与多个生物钟基因的染色质结合并负调控其表达（如Dbp），从而可能改变振荡行为。3）代谢与信号通路改变：DEX快速上调Hif3a（最显著的应答基因），其可能通过下调TGF-β1等途径影响细胞间耦合；同时，DEX广泛影响氨基酸转运、翻译、电子传递链相关基因，改变了能量代谢和蛋白质合成状态，这可能通过代谢反馈影响生物钟。4）SCN特异性神经调质与离子通道：DEX下调了SCN关键神经肽Avp和孤儿受体Gpr176的表达，并改变了多个钾离子通道基因的表达，这些都可能调制SCN对DEX的反应。5）金属硫蛋白系统：所有表达的Mt1-3基因均被DEX上调，可能通过调节锌离子水平影响锌指转录因子（如Zbtb16、Klf9）的活性，从而与生物钟产生联系。许多差异表达基因在成年SCN特定细胞类型中呈节律性表达，提示DEX可能干扰了胎儿SCN中正在建立的细胞特异性节律程序。

结论部分翻译：

总而言之，数据显示DEX改变了胎儿SCN的转录景观，并对胎儿SCN生物钟产生了直接和间接的影响。胎儿SCN生物钟对DEX有明确反应，表现为PER2生物发光节律的昼夜节律参数发生变化，以及GC敏感的核心生物钟基因Per1被诱导。然而，实验设计侧重于急性变化且长期时间分辨率较低，可能妨碍了检测对其他生物钟基因的影响。转录变化与分子生物钟之间的机制联系尚未研究，但这些结果表明了一种机制，即母体内GCs水平升高可以重新编程胎儿SCN的基因表达并重置其生物钟。研究人员证明，由于广泛分布的GR，胎儿SCN中单个细胞的生物钟对DEX敏感，这导致了细胞PER2::LUC节律的改变。其潜在机制涉及GR敏感的生物钟基因Per1表达的增加，以及DEX对其他生物钟和生物钟相关基因的影响。值得注意的是，研究人员鉴定出多个SCN特异性基因，包括转录因子Hif3a、Klf9和Zbtb16，金属硫蛋白，受体，氨基酸转运蛋白和钾离子通道，它们的表达受到DEX的显著影响，并可能参与母体对发育中昼夜节律的导引。

我们的研究结果与人类健康相关，因为DEX在产前临床实践中已被用作挽救生命的疗法，以在因呼吸窘迫综合征而面临早产威胁的情况下加速胎儿器官成熟。尽管该疗法被普遍使用，但其对胎儿大脑和发育中生物钟的影响研究甚少，其潜在机制完全未被阐明。此外，现代社会对孕妇施加社会经济压力，影响她们的日常生活规律，并使她们暴露于压力情境，这可能导致内源性GCs激增并可能到达胎儿。这种生活方式对发育中胎儿及其大脑结构（负责成年后基本功能）的影响值得仔细研究。