《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Two novel indigenous Levilactobacillus brevis probiotic strains MKMB04 and MKMB05 enhance longevity and protect intestinal barrier function through antioxidant and anti-inflammatory mechanisms
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衰老以进行性氧化应激、线粒体功能障碍、慢性炎症和肠道屏障损伤为特征，导致对年龄相关疾病的易感性增加。靶向氧化还原失衡和上皮功能障碍是促进健康衰老的一种有前景的治疗策略。在本研究中，研究人员利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和肠道细
衰老以进行性氧化应激、线粒体功能障碍、慢性炎症和肠道屏障损伤为特征，导致对年龄相关疾病的易感性增加。靶向氧化还原失衡和上皮功能障碍是促进健康衰老的一种有前景的治疗策略。在本研究中，研究人员利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和肠道细胞模型，评估了两种新型本土短乳杆菌（Levilactobacillus brevis）益生菌菌株MKMB04和MKMB05的寿命促进和屏障保护潜力。膳食补充MKMB04和MKMB05分别将野生型N2线虫的平均寿命显著延长了28.6%和17.9%，在daf-2突变体中观察到效应减弱，提示涉及胰岛素/胰岛素样生长因子-1（insulin/IGF-1）信号通路。MKMB04显著增强了内源性抗氧化防御，表现为过氧化氢酶（catalase, CAT）活性升高、谷胱甘肽（glutathione, GSH）水平增加，同时关键抗氧化和应激反应基因（ctl、gst、trx、skn-1、jnk-1和pmk-1）上调，脂质代谢和凋亡标志物受到抑制。在沙门氏菌（Salmonella）刺激的肠上皮和免疫细胞模型中，两种菌株均显著降低了细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）和一氧化氮（nitric oxide, NO）的产生，恢复了紧密连接蛋白（Claudin-1和ZO-1），改善了跨上皮电阻（transepithelial electrical resistance, TEER）并增强了线粒体呼吸。此外，促炎细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1）被抑制，而抗炎介质升高。虽然先前关于短乳杆菌的研究主要关注传统益生菌特性，且仅有限的研究利用了线虫模型，但本研究整合了基于线虫的验证、细胞培养和基因组分析，以提供对菌株特异性功能的全面评估。总之，这些发现突出了MKMB04和MKMB05作为促进健康衰老和肠道功能的潜在益生菌候选者。
一、 研究背景、问题与目的
衰老是一种不可避免的生物学过程，伴随着生理功能逐渐衰退、对慢性疾病易感性增加以及对应激源恢复力降低。随着全球60岁以上人口预计从2020年的11亿增至2050年的21亿，老龄化已成为主要的生物医学和公共卫生挑战。衰老的特征包括氧化应激、线粒体功能障碍、慢性炎症和肠道屏障损伤等，这些过程相互关联，驱动功能衰退并导致年龄相关疾病的发生。因此，针对这些衰老标志，特别是氧化还原失衡和上皮功能障碍，寻找促进健康衰老的策略具有重要意义。
近年来，肠道微生物群在调节免疫稳态、代谢完整性和氧化应激反应等衰老特征中的关键作用日益受到重视。益生菌因其支持肠道稳态、减轻炎症和增强屏障功能的能力而被广泛认可。除了胃肠道益处，特定的益生菌菌株显示出调节与衰老和长寿相关的系统途径的潜力，包括氧化应激反应、线粒体完整性、免疫调节和肠道屏障完整性。然而，这些益处具有高度的菌株特异性，需要对新益生菌候选株进行针对性评估。此外，来自未充分开发地区（如印度东北部）的新型菌株的发现和评估仍存在空白。该地区拥有丰富的传统发酵食品，但在益生菌研究方面尚未得到充分开发。
基于以上背景，研究人员假设从该地区分离的菌株可能具有独特的、有益于健康衰老的健康促进特性。为此，研究人员从印度曼尼普尔邦的传统凝乳样品中分离出两种新型短乳杆菌菌株，命名为MKMB04和MKMB05，并旨在通过整合表型、分子和基因组分析，全面评估其在促进长寿和保护肠道屏障功能方面的潜力，特别是在抗氧化和抗炎机制方面。
二、 主要关键技术方法概述
本研究采用了多模型、多层次的研究策略。关键技术方法包括：1. 菌株分离与益生菌特性筛选：从印度曼尼普尔邦的凝乳样品中分离菌株，并依据ICMR-DBT指南评估其模拟胃肠道耐受性、抗生素敏感性、抗菌活性、粘附性、生物膜形成等基本益生菌属性。2. 线虫模型表型与分子分析：使用野生型秀丽隐杆线虫N2及daf-2突变体进行寿命、发育速率、脂肪积累等表型分析；通过实时定量PCR（qRT-PCR）分析抗氧化、应激、代谢、线粒体功能、免疫等相关基因表达；并测定过氧化氢酶（CAT）活性和谷胱甘肽（GSH）水平。3. 细胞模型功能评估：利用人肠道上皮细胞Caco-2、HT-29及巨噬细胞THP-1、RAW 264.7等细胞系，构建沙门氏菌感染模型。通过测定跨上皮电阻（TEER）评估屏障完整性；通过流式细胞术检测细胞凋亡和活性氧（ROS）水平；通过Griess法检测一氧化氮（NO）产生；通过Seahorse分析仪评估线粒体呼吸功能；通过免疫荧光、qRT-PCR和ELISA评估紧密连接蛋白表达、相关基因表达及细胞因子分泌。4. 全基因组测序与生物信息学分析：对MKMB04和MKMB05菌株进行Illumina MiSeq平台全基因组测序，通过de novo组装、基因预测和功能注释（RAST, Prokka, KEGG, GO等），鉴定与应激耐受、代谢、免疫调节及次级代谢产物合成相关的基因簇。
三、 研究结果
3.1. 益生菌筛选
MKMB04和MKMB05均表现出良好的益生菌特性，包括对模拟胃液、肠液和胆盐的高耐受性，对HT-29细胞的高粘附率，无溶血活性，以及对多种致病菌的抗菌活性，符合核心益生菌筛选标准。
3.2. MKMB04和MKMB05对线虫寿命、发育和脂质积累的影响
在野生型N2线虫中，MKMB04和MKMB05的膳食补充分别将平均寿命显著延长了28.6%和17.9%。在长寿命的daf-2胰岛素/IGF-1受体突变体中，寿命延长效应减弱，提示其作用部分依赖于该信号通路。两种菌株还延迟了线虫从卵到成体的发育时间，并显著减少了衰老相关的脂肪积累。
3.3. 基因表达谱分析揭示线虫中益生菌作用的分子机制
基因表达分析表明，MKMB04显著上调了多种抗氧化和应激反应基因，如ctl-1/2/3、gst-4/10/44、trx-1、skn-1、jnk-1和pmk-1。两种菌株均下调了胰岛素/IGF-1信号通路基因daf-2和age-1，以及脂质生成基因fat-5和fat-6。MKMB04还特异性上调了与发育、神经内分泌信号（如tph-1、ser-1、mod-1）和免疫调节相关的基因。在金黄色葡萄球菌（S. aureus）攻击后，两种菌株以不同的方式调节了多种先天免疫效应基因的表达，显示出菌株特异性的免疫调节能力。
3.4. MKMB04和MKMB05在线虫中的抗氧化活性
与基因表达结果一致，MKMB04处理的线虫其过氧化氢酶（CAT）活性显著高于对照组。更重要的是，两种菌株，尤其是MKMB04，都大幅提高了线虫体内的谷胱甘肽（GSH）水平，增强了内源性抗氧化防御能力。
3.5. 短乳杆菌菌株对沙门氏菌攻击的Caco-2细胞上皮紧密连接完整性的保护作用
沙门氏菌感染破坏了Caco-2单层细胞的紧密连接蛋白Claudin-1和ZO-1的表达与定位。预先用MKMB04或MKMB05处理，可以部分恢复这两种蛋白的表达，但对Occludin的恢复作用不显著。
3.6. 益生菌预处理增强了沙门氏菌感染的HT-29细胞中MUC-2基因表达
沙门氏菌感染降低了粘蛋白基因MUC-2的表达，而MKMB04和MKMB05预处理可逆转这种下调，有助于维持黏液层完整性。
3.7-3.10. 益生菌对炎症反应的调节
在沙门氏菌感染的Caco-2细胞和Caco-2/THP-1共培养模型中，MKMB04和MKMB05预处理能够：1) 下调促炎细胞因子基因（IL-1β、MCP-1、TNF-α、IL-6）的表达及其蛋白分泌；2) 上调抗炎细胞因子基因（IL-10、TGF-β）的表达；3) 恢复Toll样受体（TLR）负调节因子SIGIRR的表达。这些结果表明两种菌株具有抗炎和免疫调节特性。
3.11. TEER测定评估沙门氏菌感染的Caco-2细胞肠道屏障完整性
沙门氏菌感染导致Caco-2单层细胞的跨上皮电阻（TEER）值急剧下降，表明屏障完整性受损。MKMB04和MKMB05预处理显著减缓了TEER的下降，保护了上皮屏障功能。
3.12. 益生菌处理降低了沙门氏菌攻击的RAW 264.7细胞中NO的产生
沙门氏菌感染诱导RAW 264.7巨噬细胞产生大量一氧化氮（NO）。MKMB04和MKMB05预处理显著抑制了NO的产生。
3.13. 益生菌菌株减少了沙门氏菌诱导的Caco-2细胞凋亡
流式细胞术分析显示，沙门氏菌感染显著增加了Caco-2细胞的凋亡率。MKMB04和MKMB05预处理有效降低了细胞凋亡，恢复了细胞活力。
3.14. 益生菌菌株MKMB04和MKMB05减少了沙门氏菌诱导的Caco-2细胞ROS生成
沙门氏菌感染大幅提高了Caco-2细胞内的活性氧（ROS）水平。两种益生菌预处理均能显著抑制ROS的过量产生。
3.15. MKMB04和MKMB05减轻了沙门氏菌诱导的Caco-2细胞线粒体功能障碍
沙门氏菌感染损害了Caco-2细胞的线粒体功能，表现为基础呼吸、最大呼吸、ATP产生和备用呼吸容量（spare respiratory capacity）下降。MKMB04和MKMB05预处理，特别是MKMB05，部分恢复了这些线粒体呼吸参数。
3.16. 短乳杆菌菌株MKMB04和MKMB05的全基因组测序及功能分析
全基因组测序揭示了两株菌的基因组特征。功能注释发现它们拥有丰富的与碳水化合物代谢、应激适应（酸、胆汁、氧化应激）、细胞壁生物合成、肽聚糖合成以及免疫调节（如dlt操纵子）相关的基因。此外，基因组中预测了与萜类、羊毛硫肽（lanthipeptide）和III型聚酮合酶（T3PKS）生物合成相关的基因簇，可能与其益生功能相关。
四、 讨论与结论
讨论部分总结：
本研究表明，短乳杆菌MKMB04和MKMB05表现出多种益生菌相关效应，包括改善上皮屏障完整性、减少氧化应激和调节免疫反应。这些功能结果，连同观察到的寿命延长和代谢调节，表明两种菌株影响了与健康衰老相关的宿主生理过程。值得注意的是，MKMB04在多项实验中 consistently 表现出更强的效应，突出了益生菌作用的菌株特异性。
在线虫模型中的发现提示这些菌株可能通过调节保守的长寿相关通路发挥作用。观察到的表型改善，包括寿命延长、发育延迟和脂肪积累减少，与先前关于益生菌介导效应的报道一致。同时，体外细胞实验为增强屏障功能和免疫调节活性提供了互补证据和机制见解。
益生菌发挥功效的前提是能够耐受胃肠道的恶劣环境。MKMB04和MKMB05对低pH和胆盐的强劲耐受性表明它们能够存活并到达肠道发挥作用。它们显著的自动聚集能力和适度的表面疏水性，以及对HT-29上皮细胞的高粘附率，为其在肠道黏膜的定植和暂时存留提供了可能。
MKMB04和MKMB05的长寿潜力在线虫寿命实验中得到明确体现。与之前报道的其他短乳杆菌菌株相比，MKMB04的延寿效果更为突出。本研究将益生菌表征、线虫功能实验、细胞培养和基因组分析相结合，提供了对菌株特异性益生潜力的更全面评估。
基因表达分析进一步揭示了其分子机制。MKMB04强烈上调了抗氧化防御基因，并与skn-1/Nrf2通路的激活相关。两种菌株都下调了胰岛素/IGF-1信号通路基因，并在daf-2突变体中观察到的延寿效应减弱，支持了该通路的参与。它们还下调了脂肪生成基因，与观察到的脂肪减少一致。线粒体功能相关基因的表达变化提示可能存在代谢重编程或轻度线粒体应激（线粒体激素效应），这可能有助于增强细胞恢复力和寿命。此外，两种菌株以不同的方式调节了先天免疫基因，显示出菌株特异性的免疫调节模式。
在细胞模型中，两种菌株通过恢复紧密连接蛋白、降低促炎因子、提高抗炎因子、减少ROS和NO产生、抑制细胞凋亡以及改善线粒体功能，全面保护了肠道上皮屏障，并展现了抗炎和抗氧化作用。全基因组分析则从遗传基础上揭示了它们具备应对胃肠道压力、与宿主相互作用以及产生潜在生物活性物质的潜能。
结论翻译：
总之，这些发现突出了MKMB04和MKMB05作为通过抗氧化和抗炎机制促进健康衰老和肠道功能的潜在益生菌候选者。
