生物活性化合物对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠氧化应激及肝细胞线粒体功能障碍的改善作用——源自Galega officinalis的研究

《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Amelioration of oxidative stress and hepatocellular mitochondrial dysfunction by bioactive compounds isolated from Galega officinalis in streptozotocin-induced diabetic rats

　　

摘要：研究人员研究了从Galega officinalis分离的生物活性化合物对实验性糖尿病大鼠肝细胞线粒体生物能量学特征和氧化应激的影响。将32只雄性Wistar大鼠随机分为四组（每组n=8）：非糖尿病对照组；非糖尿病但给予无生物碱Galega officinalis提取物组分（AFF GOE）组（每日口服剂量600 mg/kg，持续14天）；糖尿病组（通过单次腹腔注射60 mg/kg链脲佐菌素诱导糖尿病）；以及给予AFF GOE的糖尿病组（剂量同上）。使用超高效液相色谱-电喷雾电离质谱联用（UHPLC-ESI-MS）分析了AFF GOE的酚类成分。在糖尿病条件下，氧化NAD-和FAD-依赖性底物时，确认了来自G. officinalis的生物活性化合物对线粒体呼吸、氧化磷酸化以及呼吸链复合物I、II和III（NADH-CoQ氧化还原酶、琥珀酸-CoQ氧化还原酶、细胞色素c氧化还原酶）活性的纠正作用。通过氧化应激标志物的变化，包括硫代巴比妥酸反应物（TBARS）水平、还原型谷胱甘肽含量和抗氧化酶（超氧化物歧化酶和过氧化氢酶）活性，证明了AFF GOE在糖尿病中的抗氧化作用。这些结果突显了G. officinalis作为天然生物活性化合物来源的潜力，可用于开发植物药物和功能性食品，以预防和纠正与高血糖相关的代谢紊乱。其支持线粒体功能和发挥抗氧化作用的能力对于功能性食品应用尤为重要。

一、 研究背景与目的

糖尿病（DM）是全球范围内重大的医学与社会挑战，与高发病率和死亡率相关。慢性高血糖会导致广泛的氧化应激和细胞损伤，其中线粒体功能障碍被认为是糖尿病发生与发展中的关键病理机制之一，特别是在维持葡萄糖稳态中起核心作用的肝细胞中。线粒体功能受损不仅影响能量（ATP）生成，还会加剧活性氧（ROS）产生，形成恶性循环。因此，旨在恢复线粒体功能的策略被视为改善代谢紊乱的重要工具。

Galega officinalis（山羊豆）是一种具有降血糖作用的药用植物，但其传统有效成分——生物碱（如galegine）存在毒性问题，限制了其治疗应用。为解决此问题，研究人员先前已制备了不含生物碱的Galega officinalis提取物组分（AFF GOE），并证实其在糖尿病条件下具有降血糖和抗氧化（在血液细胞中）作用。然而，该提取物对肝细胞功能，特别是线粒体生物能量学和氧化应激状态的影响尚不明确。

基于此，本研究的目的是探究AFF GOE在实验性糖尿病条件下，对大鼠肝细胞线粒体生物能量学特征和氧化应激标志物的调节作用。同时，对AFF GOE进行化学表征，以阐明其生物活性成分在纠正糖尿病诱导的代谢紊乱中的潜在机制。本研究旨在为开发基于G. officinalis的功能性食品或植物药物提供科学依据，以预防和辅助管理糖尿病及其并发症。

二、 关键技术与方法

本研究主要运用了以下几种关键技术方法：

1. 1.
   动物模型与处理：使用雄性Wistar大鼠，通过单次腹腔注射链脲佐菌素（STZ，60 mg/kg）诱导1型糖尿病模型。动物分为四组：对照组、对照+AFF GOE组、糖尿病组、糖尿病+AFF GOE组。AFF GOE以600 mg/kg/天的剂量口服给药14天。
2. 2.
   提取物制备与表征：从G. officinalis地上部分制备乙醇提取物，并通过氯仿/酸水两相液液萃取去除生物碱，获得AFF GOE。利用超高效液相色谱-电喷雾电离质谱联用（UHPLC-ESI-MS）对其酚类成分进行定性与定量分析。
3. 3.
   线粒体功能评估：通过差速离心法从大鼠肝脏分离线粒体。使用克拉克型氧电极（Clark-type electrode）极谱法测量线粒体耗氧率，评估在不同底物（丙酮酸+苹果酸、琥珀酸）下的基础呼吸、底物刺激呼吸、ADP刺激呼吸等参数，并计算机呼吸控制比（RCR）和ADP/O比值以评价氧化磷酸化效率。
4. 4.
   酶活性测定：测定肝线粒体关键呼吸链复合物酶的活性，包括NADH-CoQ氧化还原酶（复合物I）、琥珀酸-CoQ氧化还原酶（复合物II，即琥珀酸脱氢酶SDH）和细胞色素c氧化酶（复合物IV）的活性。
5. 5.
   氧化应激指标检测：测定肝脏组织中以下指标：硫代巴比妥酸反应物（TBARS，反映脂质过氧化水平）、还原型谷胱甘肽（GSH）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性，以全面评估氧化应激状态和抗氧化防御体系。

三、 研究结果

3.1. AFF GOE的定量与定性组成

通过UHPLC-ESI-MS分析，在AFF GOE中鉴定出16种酚类化合物，主要分为三类：酚酸及其衍生物（如没食子酸己糖苷、对羟基苯甲酸己糖苷）、黄酮类及其衍生物（如槲皮素-3-O-葡萄糖苷、木犀草素）、以及花青素（如芍药素-3-O-葡萄糖苷）。这表明AFF GOE富含具有潜在抗氧化活性的多酚类物质。

3.2. AFF GOE对肝细胞线粒体生物能量学特征的影响

• •
  糖尿病导致线粒体功能全面受损：在糖尿病大鼠肝脏线粒体中，无论氧化NAD依赖性底物（丙酮酸+苹果酸）还是FAD依赖性底物（琥珀酸），其基础呼吸（V₁）、底物刺激呼吸（V₂）和ADP刺激呼吸（V₃）速率均显著下降。同时，反映氧化磷酸化效率的呼吸控制比（RCR）和ADP/O比值也显著降低，表明糖尿病条件下线粒体呼吸与磷酸化解偶联，ATP合成效率下降。此外，线粒体呼吸链关键酶——NADH-CoQ氧化还原酶、琥珀酸-CoQ氧化还原酶和细胞色素c氧化酶的活性在糖尿病组也急剧降低，证实了电子传递链的系统性抑制。
• •
  AFF GOE能部分改善线粒体功能：给予AFF GOE的糖尿病大鼠，其肝线粒体在氧化丙酮酸+苹果酸时，ADP刺激呼吸速率（V₃）和ADP/O比值显著提高，表明NAD依赖途径的氧化磷酸化效率得到改善。同时，NADH-CoQ氧化还原酶和细胞色素c氧化酶的活性也显著恢复。然而，在琥珀酸氧化途径中，AFF GOE的改善效果较弱，仅引起V₃的轻微上升，对RCR、ADP/O比值及琥珀酸-CoQ氧化还原酶活性无显著影响。

3.3. AFF GOE对糖尿病肝脏抗氧化系统的影响

• •
  糖尿病引发严重氧化应激：与对照组相比，糖尿病大鼠肝脏表现出明显的氧化应激，具体表现为：脂质过氧化终产物TBARS水平显著升高（增加106.3%），而关键抗氧化酶SOD和CAT的活性分别降低16.4%和20.7%，非酶抗氧化剂还原型谷胱甘肽（GSH）的含量也下降27.5%。
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  AFF GOE表现出显著的抗氧化作用：给予AFF GOE治疗后，糖尿病大鼠肝脏的氧化应激状态得到明显改善。具体表现为：TBARS水平较糖尿病组下降26.6%；GSH含量、SOD和CAT的活性分别较糖尿病组提高33.3%、34.9%和43.3%，使这些指标恢复至接近正常水平。

四、 讨论与结论

讨论部分总结：

研究人员在讨论中深入分析了本研究的发现。糖尿病导致的线粒体功能障碍涉及多个层面：电子传递链复合物活性降低、呼吸与磷酸化解偶联、以及由于高血糖高脂质状态下电子传递链过载和电子泄漏导致的ROS过量生成。过量的ROS会攻击膜脂质和蛋白质，进一步损害线粒体膜稳定性和呼吸链酶功能，形成恶性循环。

AFF GOE的改善作用被认为与其所含多酚类化合物的抗氧化特性密切相关。这些化合物（如槲皮素、没食子酸、芍药素等）能够直接清除ROS，上调内源性抗氧化酶（如SOD、CAT）的表达或活性，并维持GSH水平。通过改善细胞的氧化还原状态，AFF GOE可能减少了ROS对线粒体膜脂质和呼吸链蛋白的氧化损伤，从而部分恢复了线粒体，特别是对氧化损伤更敏感的复合物I（NADH依赖途径）的功能。然而，其对复合物II（琥珀酸依赖途径）作用有限，提示不同呼吸链段对糖尿病损伤和植物提取物干预的敏感性存在差异。此外，多酚类物质还可能通过调节线粒体动力学、生物发生等途径发挥保护作用。研究强调，功能性食品中多种生物活性成分的协同作用可能产生比单一化合物更全面的抗糖尿病效果。

研究结论（翻译自原文）：

从Galega officinalis中分离的生物活性化合物可减轻糖尿病状态下的氧化应激，并恢复肝细胞线粒体的生物能量学特征。AFF GOE的生物学效应似乎是由提取物中存在的多酚（黄酮类、酚酸和花青素）的抗氧化特性及其降糖作用所介导。这些发现突显了G. officinalis植物成分作为开发功能性食品和天然抗糖尿病制剂的潜力基础，旨在预防代谢紊乱并减轻糖尿病相关并发症和其他高血糖相关病理。